3D Bioprinting van Murine Cortiical Astrocytes voor Engineering Neural-Like Tissue

Samenvatting

Hier rapporteren we een methode van 3D bioprinting van muriene corticale astrocyten voor het biofabriceren van neurale weefsels om de functionaliteit van astrocyten in het centrale zenuwstelsel en de mechanismen met betrekking tot gliacellen bij neurologische ziekten en behandelingen te bestuderen.

Samenvatting

Astrocyten zijn gliacellen met een essentiële rol in het centrale zenuwstelsel (CZS), inclusief neuronale ondersteuning en functionaliteit. Deze cellen reageren ook op neurale verwondingen en werken om het weefsel te beschermen tegen degeneratieve gebeurtenissen. In vitro studies van de functionaliteit van astrocyten zijn belangrijk om de mechanismen die betrokken zijn bij dergelijke gebeurtenissen op te helderen en bij te dragen aan de ontwikkeling van therapieën voor de behandeling van neurologische aandoeningen. Dit protocol beschrijft een methode om een neuraalachtige weefselstructuur rijk aan astrocyten te biofabriceren door astrocyten-beladen bioink 3D-bioprinting. Een op extrusie gebaseerde 3D-bioprinter werd in dit werk gebruikt en astrocyten werden geëxtraheerd uit de hersencorticoces van C57Bl / 6 muizenpups. De bioink werd bereid door corticale astrocyten van maximaal passage 3 te mengen tot een biomateriaaloplossing bestaande uit gelatine, gelatine-methacryloyl (GelMA) en fibrinogeen, aangevuld met laminine, die optimale bioprintingcondities bood. De 3D-bioprintomstandigheden minimaliseerden celstress en droegen bij aan de hoge levensvatbaarheid van de astrocyten tijdens het proces, waarbij 74,08% ± 1,33% van de cellen direct na bioprinting levensvatbaar waren. Na 1 week incubatie nam de levensvatbaarheid van astrocyten aanzienlijk toe tot 83,54% ± 3,00%, wat aangeeft dat de 3D-constructie een geschikte micro-omgeving voor celgroei vertegenwoordigt. De samenstelling van het biomateriaal maakte celaanhechting mogelijk en stimuleerde astrocytisch gedrag, waarbij cellen de specifieke astrocytenmarker marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) tot expressie brengen en typische astrocytische morfologie bezitten. Dit reproduceerbare protocol biedt een waardevolle methode om 3D-neuraalachtig weefsel dat rijk is aan astrocyten te biofabriceren dat lijkt op de inheemse micro-omgeving van cellen, nuttig voor onderzoekers die de functionaliteit van astrocyten en hun relatie tot de mechanismen die betrokken zijn bij neurologische ziekten willen begrijpen.

Inleiding

Astrocyten zijn het meest voorkomende celtype in het centrale zenuwstelsel (CZS) en spelen een sleutelrol in de homeostase van de hersenen. Naast blijvende neuronale ondersteuning, zijn astrocyten verantwoordelijk voor het moduleren van de opname van neurotransmitters, het handhaven van de integriteit van de bloed-hersenbarrière en het reguleren van neuronale synaptogenese^1,2. Astrocyten hebben ook een essentiële rol bij CNS-ontsteking, reagerend op verwondingen aan de hersenen in een proces dat leidt tot astrocitaire reactiviteit of reactieve astrogliose^3,4....

Protocol

Alle procedures met betrekking tot dieren volgden internationale richtlijnen voor diergebruik in onderzoek (http://www.iclas.org) en werden goedgekeurd door de Commissie ethiek in onderzoek van Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519).

1. Muizen hersendissectie

1. Breng 10 ml koude Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) over in een kweekschaal van 100 mm en 1 ml in een microbuis van 1,5 ml. Bereid één microbuisje per dier voor.
   OPMERKING: Zowel de kweekschaal als de microtube moeten op ijs worden gehouden.
2. Bereid astrocyten kweekmedium met DMEM F12 + 10% Foetaal Runderserum (FBS), 2% glutamine en 1% Penici....

Resultaten

Dit werk was gericht op het ontwikkelen van een neuraalachtig weefsel met behulp van de 3D-bioprinttechnologie om laag voor laag primaire astrocyten-beladen gelatine / GelMA / fibrinogeen bioink af te zetten. Astrocyten werden geëxtraheerd en geïsoleerd uit de hersenschors van muizenjongen (figuur 1), toegevoegd aan een biomateriaalsamenstelling, waardoor de biofabricage van een levend 3D-construct mogelijk werd.

Het computer-aided-design (CAD) is ontwikkeld met b.......

Discussie

De 3D-bioprinttechnologie is naar voren gekomen als een biofabricageternatief dat de engineering van verfijnde constructies mogelijk maakt die structureel en fysiologisch lijken op inheemse weefsels²², inclusief de hersenen²³. De biofabricage van neurale weefsels maakt in vitro inheemse micro-omgevingsmodellering mogelijk, een belangrijk hulpmiddel voor het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen die verband houden met de ontwikkeling en behandeling .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3D Bioprinter	3D Biotechnology Solutions		Extrusie-gebaseerde bioprinter
Blunt-tip forceps	Integra Miltex	6--30	Forceps voor hersendissectie eerder gesteriliseerd
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	9048-46-8	Protease vrij, vetzuur vrij, essentieel globuline vrij
CaCl2	Sigma-Aldrich	10043-52-4
Cell culture flask	Fisher Scientific	156340	Kweekkolf T25
Cell strainer	Corning Incorporated	352340	Cell strainer 40 µm
Confocal microscope	Leica		Confocal TCS SP8 microscopie gekoppeld aan een Olympus FluoView 300 confocal systeem
Conical tubes	Thermo Scientific	339651, 339652	Steriele buizen van 15 mL en 50 mL
DAPI	Abcam	ab224589	DAPI kleuroplossing
DMEM/F12	Gibco; Life Technologies Corporation	12500062	DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) met L-glutamine
Dyalisis tubing	Sigma-Aldrich	D9527	Molecuulgewicht cut-off = 14 kDa
Ethanol	Fisher Scientific	64-15-5	Reagenskwaliteit
Fetal Bovine Serum	Gibco; Life Technologies Corporation	12657011	Research Grade
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	9001-32-5	Fibrinogeen kristallijn poeder van runderplasma
Gelatin	Sigma-Aldrich	9000-70-8	Gelatine poeder van varkenshuid
Glycine	Sigma-Aldrich	56-40-6	Glycine poeder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)	Gibco; Life Technologies Corporation	14175095	Geen calcium, geen magnesium, geen fenolrood
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	56-85-9	L-Glutamine kristallijn poeder
Laminin	Sigma-Aldrich	114956-81-9	Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kit	Thermo Scientific	R37601	Groene fluorescentie in levende cellen (ex/em 488 nm/515 nm). Rode fluorescentie in dode cellen (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydride	Sigma-Aldrich	760-93-0	Voor GelMA voorbereiding
Microtubes	Corning Incorporated	MCT-150-C	Microtubes van 1,5 mL
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Needle 22G	Fisher Scientific	NC1362045	Steriele stompe naald
Operating scissor	Integra Miltex	05--02	Scherpe schaar voor hersendissectie eerder gesteriliseerd
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Paraformaldehyde poeder
Penicillin/Streptomycin	Gibco; Life Technologies Corporation	15070063	Pen Strep (5.000 eenheden/mL Penicilline; 5.000 µg/mL Streptomycine)
Petri dish	Corning Incorporated	430591, 430588	Steriele petrischalen van 35 en 100 mm
Phalloidin	Abcam	ab176753	iFluor 488 reagens
Photoinitiator	Sigma-Aldrich	106797-53-9	2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiofenon
Phosphate buffer saline (PBS)	Gibco; Life Technologies Corporation	10010023	PBS 1 x, kweekkwaliteit, geen calcium, geen magnesium
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	25988-63-0	Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30.000-70.000
Primary antobody	Abcam	ab4674	Kip polyklonaal voor GFAP
Secondary antibody	Abcam	ab150176	Alexa fluor 594 anti-kip
Spatula	Miltex	V973-70	Nummer 24 cementspatel eerder gesteriliseerd
Stereomicroscope	Fisherbrand	3000038	Microscoop voor hersendissectie
Syringe 5 mL	BD	1222C84	Steriele spuit
Syringe filter 2 µm	Fisher Scientific	09-740-105	Polypropyleen filter voor sterilisatie
Thrombin	Sigma-Aldrich	9002--04-4	Thrombine kristallijn poeder van runderplasma
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Laboratoriumkwaliteit
Trypsin-EDTA	Gibco; Life Technologies Corporation	15400054	Trypsine geen fenolrood 1 x verdund in PBS
Versene solution	Gibco; Life Technologies Corporation	15040066	Versene oplossing (0,48 mM) geformuleerd als 0,2 g EDTA(Na4) per liter PBS
Well plate	Thermo Scientific	144530	Steriele 24-well plate