Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

3D Bioprinting van Murine Cortiical Astrocytes voor Engineering Neural-Like Tissue

6.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62691

⸱

16 juli 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo

In dit artikel

Samenvatting

Hier rapporteren we een methode van 3D bioprinting van muriene corticale astrocyten voor het biofabriceren van neurale weefsels om de functionaliteit van astrocyten in het centrale zenuwstelsel en de mechanismen met betrekking tot gliacellen bij neurologische ziekten en behandelingen te bestuderen.

Samenvatting

Astrocyten zijn gliacellen met een essentiële rol in het centrale zenuwstelsel (CZS), inclusief neuronale ondersteuning en functionaliteit. Deze cellen reageren ook op neurale verwondingen en werken om het weefsel te beschermen tegen degeneratieve gebeurtenissen. In vitro studies van de functionaliteit van astrocyten zijn belangrijk om de mechanismen die betrokken zijn bij dergelijke gebeurtenissen op te helderen en bij te dragen aan de ontwikkeling van therapieën voor de behandeling van neurologische aandoeningen. Dit protocol beschrijft een methode om een neuraalachtige weefselstructuur rijk aan astrocyten te biofabriceren door astrocyten-beladen bioink 3D-bioprinting. Een op extrusie gebaseerde 3D-bioprinter werd in dit werk gebruikt en astrocyten werden geëxtraheerd uit de hersencorticoces van C57Bl / 6 muizenpups. De bioink werd bereid door corticale astrocyten van maximaal passage 3 te mengen tot een biomateriaaloplossing bestaande uit gelatine, gelatine-methacryloyl (GelMA) en fibrinogeen, aangevuld met laminine, die optimale bioprintingcondities bood. De 3D-bioprintomstandigheden minimaliseerden celstress en droegen bij aan de hoge levensvatbaarheid van de astrocyten tijdens het proces, waarbij 74,08% ± 1,33% van de cellen direct na bioprinting levensvatbaar waren. Na 1 week incubatie nam de levensvatbaarheid van astrocyten aanzienlijk toe tot 83,54% ± 3,00%, wat aangeeft dat de 3D-constructie een geschikte micro-omgeving voor celgroei vertegenwoordigt. De samenstelling van het biomateriaal maakte celaanhechting mogelijk en stimuleerde astrocytisch gedrag, waarbij cellen de specifieke astrocytenmarker marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) tot expressie brengen en typische astrocytische morfologie bezitten. Dit reproduceerbare protocol biedt een waardevolle methode om 3D-neuraalachtig weefsel dat rijk is aan astrocyten te biofabriceren dat lijkt op de inheemse micro-omgeving van cellen, nuttig voor onderzoekers die de functionaliteit van astrocyten en hun relatie tot de mechanismen die betrokken zijn bij neurologische ziekten willen begrijpen.

Inleiding

Astrocyten zijn het meest voorkomende celtype in het centrale zenuwstelsel (CZS) en spelen een sleutelrol in de homeostase van de hersenen. Naast blijvende neuronale ondersteuning, zijn astrocyten verantwoordelijk voor het moduleren van de opname van neurotransmitters, het handhaven van de integriteit van de bloed-hersenbarrière en het reguleren van neuronale synaptogenese1,2. Astrocyten hebben ook een essentiële rol bij CNS-ontsteking, reagerend op verwondingen aan de hersenen in een proces dat leidt tot astrocitaire reactiviteit of reactieve astrogliose3,4,het vormen van een gliaal litteken dat een gezonde weefselexpositie aan degeneratieve middelen voorkomt5. Deze gebeurtenis resulteert in veranderingen in de genexpressie, morfologie en functie van astrocyten6,7. Daarom zijn studies met betrekking tot de functionaliteit van astrocyten nuttig voor de ontwikkeling van therapieën om neurologische aandoeningen te behandelen.

In vitro modellen zijn cruciaal voor het bestuderen van mechanismen die verband houden met neurologische verwondingen, en hoewel succesvolle isolatie en tweedimensionale (2D) cultuur van corticale astrocyten zijn vastgesteld8, slaagt dit model er niet in een realistische omgeving te bieden die het gedrag van inheemse cellen nabootst en de complexiteit van de hersenen reproduceert9 . In 2D-toestand beïnvloeden de slechte mechanische en biochemische ondersteuning, lage cel-cel- en celmatrixinteracties en celafvlakking die leidt tot de afwezigheid van basaal-apicale polariteit, de celsignaleringsdynamiek en experimentele uitkomsten die leiden tot veranderde celmorfologie en genexpressie, die de respons op behandelingen in gevaar brengen10. Daarom is het cruciaal om alternatieven te ontwikkelen die een meer realistische neurale omgeving bieden, met als doel de resultaten naar de kliniek te vertalen.

Driedimensionale (3D) celcultuur vertegenwoordigt een geavanceerder model dat samenvat met verhoogde getrouwheidskenmerken van organen en weefsels, waaronder het CZS11. Met betrekking tot gliacultuur dragen 3D-modellen bij aan het behoud van astrocytenmorfologie, cel basaal-apicale polariteit en celsignalering12,13. De 3D-bioprinttechnologie kwam naar voren als een krachtig hulpmiddel om 3D-levende weefsels op een gecontroleerde manier te biofabriceren door cellen en biomaterialen te gebruiken om de structuur en eigenschappen van inheemse weefsels na te bootsen. Het gebruik van deze technologie heeft geleid tot een aanzienlijke verbetering van de voorspelling van de resultaten en heeft bijgedragen aan regeneratieve geneeskunde toegepast op het CZS14,15,16.

Het hier beschreven protocol beschrijft de isolatie en cultuur van corticale astrocyten. Het protocol beschrijft ook een reproduceerbare methode om astrocyten ingebed in gelatine / gelatine methacryloyl (GelMA) / fibrinogeen, aangevuld met laminine, te bioprinten. In dit werk werd een op extrusie gebaseerde bioprinter gebruikt om de biomateriaalsamenstelling met corticale astrocyten te printen met een dichtheid van 1 x 106 cellen / ml. Bioprinting schuifspanning werd geminimaliseerd door de printsnelheid te regelen en astrocyten vertoonden een hoge levensvatbaarheid na het proces. Biogeprinte constructies werden gedurende 1 week gekweekt en astrocyten konden zich verspreiden, hechten en overleven in de hydrogel, waarbij de astrocytische morfologie werd gehandhaafd en een specifiek marker glial fibrillair zuur eiwit (GFAP) werd tot expressiegebracht 4.

Deze procedure is compatibel met zuigeraangedreven bioprinters op basis van extrusie en kan worden gebruikt om astrocyten uit verschillende bronnen te bioprinten. Het hier voorgestelde 3D-bioprintmodel is geschikt voor een breed scala aan neurale engineeringtoepassingen, zoals studies van de mechanismen die betrokken zijn bij astrocytenfunctionaliteit in gezonde weefsels en het begrijpen van de progressie van neurologische pathologieën en de ontwikkeling van behandelingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot dieren volgden internationale richtlijnen voor diergebruik in onderzoek (http://www.iclas.org) en werden goedgekeurd door de Commissie ethiek in onderzoek van Universidade Federal de São Paulo (CEUA 2019 / 9292090519).

1. Muizen hersendissectie

  1. Breng 10 ml koude Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) over in een kweekschaal van 100 mm en 1 ml in een microbuis van 1,5 ml. Bereid één microbuisje per dier voor.
    OPMERKING: Zowel de kweekschaal als de microtube moeten op ijs worden gehouden.
  2. Bereid astrocyten kweekmedium met DMEM F12 + 10% Foetaal Runderserum (FBS), 2% glutamine en 1% Penicilline-Streptomycine (P / S). Steriliseer het medium door te filteren met een filter van 0,2 μm.
  3. Euthanaseer C57Bl/6 muizenjongen (postnatale dag 1) door onthoofding met een scherpe operatieschaar. Trek met een tang aan de huid en leg de schedel bloot. Zorg ervoor dat zowel de schaar als de tang gesteriliseerd zijn met 70% ethanol.
  4. Knip de schedel van het foramen magnum tot de bovenkant van het hoofd langs het sagittale vlak met behulp van een scherpe gebogen puntschaar.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het encefalische weefsel niet beschadigd is.
  5. Gebruik een spatel die eerder is gesteriliseerd met ethanol 70%, til de hersenen uit de schedelholte en plaats deze in de kweekschaal met 10 ml koude HBSS.
  6. Plaats de kweekschaal met de hersenen onder de stereomicroscoop en verwijder met behulp van twee stompe tangen de hersenvliezen uit de hersenen(figuur 1).
  7. Scheid de cortices van de rest van de hersenen door ze voorzichtig weg te rollen van de mediane lijn van de hersenen met behulp van een spatel.
  8. Verzamel beide cortices en breng ze onmiddellijk over naar dezelfde microbuis met 1 ml koude HBSS.

2. Astrocyten isolatie en cultuur

  1. Knip onder de laminaire stroom het corticale weefsel in kleine stukjes met een gebogen microschaar en was ze met 1 ml HBSS door 3x op en neer te pipetteren. Wacht tot het weefsel tot rust is. Verwijder HBSS en voeg nieuwe HBSS toe, waarbij u het proces nog twee keer herhaalt.
  2. Verwijder HBSS en incubeer het weefsel met 1 ml 0,05% trypsine bij 37 °C gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: Alleen trypsinevertering is op dit moment voldoende.
  3. Dissociëren het weefsel mechanisch door 15x voorzichtig op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: De volledige dissociatie van het weefsel wordt waargenomen door de toename van de troebelheid van de suspensie en door de afwezigheid van grote fragmenten weefsel in de suspensie.
  4. Breng de oplossing over in een conische buis van 15 ml, neutraliseer de trypsineactiviteit door een gelijk volume FBS toe te voegen en filter de oplossing in een celzeeffilter van 0,4 μm om niet-gedissocieerde fragmenten te verwijderen.
  5. Was het filter met 1 ml astrocytenmedium, verzamel de celsuspensie die door de zeef is gegaan en centrifugeer het gedurende 5 minuten bij 200 x g en 25 °C. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en suspensie de pellet in 1 ml astrocytencultuurmedium.
  6. Breng de celsuspensie over in een T25-kweekkolf, maak het volume van het medium aan tot 3,5 ml en incubeer de cellen bij 37 °C en 5 % CO2.
  7. Zorg ervoor dat de cellen na 24 uur aanhangen. Vervang vervolgens het medium en vervang het om de 3 dagen.
  8. Verwijder na 7 dagen microglia en oligodendrocyten uit de kweek door de cellen te wassen met 2 ml 1x PBS.
  9. Vervang de PBS-oplossing door het astrocytencultuurmedium en laat de kweekkolf 's nachts bij 180 tpm in een orbitale shaker staan.
    OPMERKING: Astrocyten vormen een confluente monolaag in ongeveer 10-12 dagen cultuur.

3. Synthese van gelatine methacryloyl (GelMA)

  1. Weeg 10 g gelatine uit varkenshuid en los op in 100 ml PBS door de oplossing op een verwarmingsplaat bij 240 tpm en 50 °C te laten roeren totdat deze volledig is opgelost.
  2. Voeg onder een motorkap 2 ml methacrylzuuranhydride (MA) toe voor een lage mate van functionalisatie en laat de gelatine-emulsie gedurende 2 uur roeren bij 240 tpm en 50 °C.
    LET OP: MA gevarenaanduiding: H302 + H332 (schadelijk bij inslikken of inademen), H311 (giftig bij contact met de huid), 314 (veroorzaakt ernstige brandwonden op de huid en oogbeschadiging), 315 (veroorzaakt huidirritatie), H317 (kan een allergische huidreactie veroorzaken), H318 (veroorzaakt ernstig oogletsel), 331 (giftig bij inademing), H332 (schadelijk bij inademing), H335 (kan irritatie van de luchtwegen veroorzaken). Richtlijnen voor hantering: P261 (vermijd het inademen van stof/rook/gas/nevel/dampen/spray), P305 + P351 + P338 + P310 (INDIEN IN DE OGEN: Spoel voorzichtig met water gedurende enkele minuten. Verwijder contactlenzen, indien aanwezig en gemakkelijk te doen. Ga door met spoelen. Bel onmiddellijk een ANTIGIFCENTRUM/arts), P301 + P312 + P330 (INDIEN INGESLIKT: Bel een ANTIGIFCENTRUM/arts als u zich onwel voelt. Mond spoelen).
    OPMERKING: Voeg MA heel langzaam toe, druppel voor druppel.
  3. Verdun de gelatine-MA-oplossing in 100 ml voorverwarmd PBS (50 °C) tot 200 ml eindvolume en laat de oplossing gedurende 10 minuten roeren bij 240 tpm en 50 °C.
  4. Snijd ~20 cm dialysemembraan (moleculaire cutoff 12-14 kDa) en week het in gedeoniseerd water tot het zacht is.
    OPMERKING: Vul de membranen met gedeioniseerd water om ervoor te zorgen dat er geen gaten of defecten zijn.
  5. Breng met behulp van een trechter de gelatine-MA-oplossing over op de membranen.
    OPMERKING: Sluit beide zijden en laat extra ruimte binnenin om het mengsel toe te staan.
  6. Plaats de membranen met de gelatine-MA-oplossing in een container met 2 L gedestilleerd water voor dialyse en laat ze gedurende 5 dagen (500 rpm) bij 40 °C roeren.
    OPMERKING: Dek de container af om waterverdamping te voorkomen.
  7. Ververs het gedestilleerde water twee keer per dag. Draai de membranen elke keer ondersteboven voor homogenisatie.
  8. Meng op de vijfde dag 200 ml voorverwarmd ultrapijnwater (40 °C) met de gedialyseerde gelatine-MA en laat dit gedurende 15 minuten roeren bij 40 °C.
  9. Breng de gelatine-MA-oplossing over in conische buisjes van 50 ml tot 25 ml en laat de buisjes gedurende 2 dagen op -80 °C blijven.
    OPMERKING: Bewaar de buizen horizontaal om lyofilisatie te vergemakkelijken.
  10. Lyofiliseer de bevroren oplossingen gedurende 3-5 dagen en bewaar de gelma beschermd tegen vocht.

4. Bioink bereiding

OPMERKING: Om 1 ml bioink te verkrijgen, wordt aanbevolen om ten minste 3 ml biomateriaaloplossing te fabriceren, omdat er verliezen kunnen zijn tijdens filtratie.

  1. Bereiding van fibrinogeenoplossing
    1. Bereid een zoutoplossing (NaCl 0,9%) in gedeïoniseerd water en los 10 mg fibrinogeen uit runderplasma op in 1 ml van de zoutoplossing om een concentratie van 10 mg/ml te verkrijgen.
      OPMERKING: Aangezien fibrinogeen adsorbeert aan glas, gebruik geen glazen kolven om de fibrinogeenoplossing te bereiden.
    2. Laat de oplossing onder roeren bij 37 °C totdat fibrinogeen volledig is opgelost.
      OPMERKING: Gebruik voor het oplossen van fibrinogeen een roterend systeem dat in een oven bij 37 °C is geplaatst. Magnetisch roeren (180 rpm) van fibrinogeen op een hete plaat bij 37 °C is ook geschikt. Onder deze voorwaarde duurt het ongeveer 40 minuten om 10 mg / ml fibrinogeen op te lossen.
  2. Bereiding van gelatine/GelMA-oplossing
    1. Weeg 0,12 g gelatine af en voeg deze toe aan 1,9 ml voorverwarmd PBS (40 °C) om een eindconcentratie van 4% (w/v) gelatine te verkrijgen. Vortex om het oplossen te vergemakkelijken.
    2. Houd de emulsie op 40 °C totdat deze volledig is opgelost.
    3. Weeg 0,06 g gelMA-gelma af en breng over in de gelatineoplossing om een eindconcentratie van 2% (w/v) GelMA te verkrijgen. Vortex om het oplossen te vergemakkelijken.
    4. Houd de oplossing op 40 °C totdat deze volledig is opgelost.
  3. Bereiding van met astrocyten beladen gelatine/GelMA/fibrinogeen bioink
    1. Pipetteer 0,9 ml van de 10 mg/ml fibrinogeenoplossing en breng over naar de gelatine/GelMA-oplossing om een eindconcentratie van 3 mg/ml fibrinogeen te verkrijgen.
    2. Weeg 0,015 g photoinitiator (PI) af en breng over op de gelatine/GelMA/fibrinogeenoplossing om een eindconcentratie van 0,5% (w/v) PI te verkrijgen. Meng de oplossing door de buis op en neer te draaien en houd deze op 40 °C beschermd tegen licht om PI-degradatie te voorkomen.
      LET OP: Stockeer de bioink op 4 °C voor maximaal 24 uur.
    3. Filter de oplossing onder de laminaire stroom met behulp van een filter van 0,2 μm in een steriele conische buis van 15 ml.
      OPMERKING: De biomateriaaloplossing moet 37-40 °C hebben om filtratie mogelijk te maken.
    4. Breng 980 μL van de biomateriaaloplossing over in een conische buis van 15 ml.
    5. Verdun laminine in zoutoplossing om een stamoplossing van 100 μg/ml te verkrijgen.
    6. Pipetteer 20 μL laminine en breng over naar de buis met de bioink om een eindconcentratie van 2 μg/ml laminine te verkrijgen.
    7. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren en bubbels te vermijden. Als er bellen blijven bestaan, centrifugeer dan de conische buis bij 200 x g gedurende 2 minuten. Houd de bioink op 37 °C totdat deze gemengd is met de cellen.
    8. Trypsinize primaire astrocyten met 0,05% trypsine gedurende 5 min.
      OPMERKING: Gebruik astrocyten uit passages 1 tot en met 3.
    9. Neutraliseer de trypsine-activiteit met FBS in een verhouding van 1:1 en breng de cellen over naar een conische buis van 15 ml. Centrifugeer het bij 200 x g gedurende 5 minuten.
    10. Tel de cellen en breng 1 x 106 cellen over naar een andere conische buis. Centrifugeer het bij 200 x g gedurende 5 minuten.
    11. Verwijder het supernatant en laat een klein volume (~ 200 μL) achter om de celkorrel op te hangen, door zachtjes op de bodem van de conische buis te tikken.
    12. Breng 1 ml gelatine/gelMA/fibrinogeenoplossing over in de buis die de cellen bevat en pipetteer voorzichtig op en neer om te homogeniseren, tot een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/ml.

5. Bereiding van de crosslinker-oplossing

  1. Trombine reconstitutie
    1. Bereid een stamoplossing van trombine 100 E/ml in steriel gedeïoniseerd water met 0,1% (w/v) runderserumalbumine (BSA) in een conische buis van 15 ml. Voorraad in microbuisjes bij -20 °C.
      OPMERKING: Als trombine adsorbeert aan glas, gebruik geen glazen kolven om de stamoplossing te bereiden of de aliquots op te slaan.
  2. Bereiding van trombine-CaCl2-oplossing
    1. Pipetteer 100 μL trombine-stamoplossing en breng over naar een conische buis van 50 ml met 8,9 ml steriel gedeïoniseerd water om een eindconcentratie van 1 U/ml trombine te verkrijgen.
    2. Bereid een CaCl2-oplossing van 10% (met v) in gedeïoniseerd water en steriliseer met behulp van een filter van 0,2 μm.
    3. Breng 1,1 ml van de 10% CaCl2-oplossing over op de conische buis die trombine bevat, om een eindverhouding van 1:9 (CaCl2 tot trombine) te verkrijgen.
      OPMERKING: Bereid de crosslinker-oplossing voor op het volume dat in het experiment moet worden gebruikt, waarbij opslag wordt vermeden.

6. Bioprinting astrocyten-beladen bioink met behulp van een extrusie-gebaseerde bioprinter

  1. Ontwerp van het neurale weefsel
    1. Met behulp van de G-code: construeer een raster van 6 x 6 mm (vierkante vorm) met 1 mm afstand tussen elke biobedrukte lijn op de X- en Y-as, en 6 lagen op de Z-as (0,2 mm tussen elke lijn); stel de extrusie (E) in op 0,01 mm en verhoog 0,001 mm bij elke nieuwe laag van de Z-as; en stel de afdruksnelheid (F) in op 400 mm/min(aanvullende informatie).
  2. Bioprinter opgezet
    1. Stel het apparaat gedurende 15 minuten bloot aan UV-licht en veeg het vervolgens af met ethanol 70%.
    2. Schakel de bioprinter in met de aan/uit-schakelaar. Sluit het apparaat aan op de computer via een USB-kabel. Open de besturingssoftware om deze aan te sluiten op de bioprinter en laad het bestandsontwerp.
  3. Bereiding van de bioprintspuit
    1. Breng de met astrocyten beladen gelatine/GelMA/fibrinogeen bioink over in een plastic spuit van 5 ml met behulp van een pipet van 1.000 μL.
      OPMERKING: Breng langzaam over om bubbelvorming te voorkomen.
    2. Sluit een steriele 22 G stompe naald aan op de spuit.
      OPMERKING: Laat de spuit gedurende 2 minuten op 4 °C staan.
    3. Sluit de spuit aan op de bioprinterprintkop en spoel de bioink handmatig door om de resterende bubbels te verwijderen.
  4. Bioprinten
    OPMERKING: De bioprinting werd uitgevoerd buiten de laminaire kap.
    1. Plaats een kweekschaal van 35 mm op de bioprintertafel en plaats de naald op 0,1 mm afstand van het oppervlak van de kweekschaal om beweging van de naald mogelijk te maken.
      OPMERKING: Gebruik één kweekschaal van 35 mm voor elke bioprinting.
    2. Druk op de knop Afdrukken.
    3. Zodra de bioprint voorbij is, zorg er dan voor dat de spuit van de schaal af beweegt. Sluit vervolgens de cultuurschotel en bereid je voor op het crosslinking-proces.
      OPMERKING: Het bioprinten van één construct duurt ongeveer 1 min en 10 s.
  5. Crosslinking van het bioprint construct en de cultuur
    1. Plaats de kweekschaal onder UV-licht op 2 mW/cm2 voor 2 x 60 s (op en neer) voor GelMA crosslinking.
    2. Breng onder de laminaire stroming de biobedrukte constructie over op een 24-wells plaat met behulp van een steriele spatel.
    3. Voeg 500 μL trombine/CaCl2-oplossing toe en laat 30 minuten staan om fibrineverknoping mogelijk te maken.
    4. Verwijder de crosslinking-oplossing en was de constructie met 2 ml PBS 1x. Vervang vervolgens de PBS door 1 ml astrocytenkweekmedium en incubeer bij 37 °C en 5% CO2. Vervang het medium om de 3 dagen.

7. Beoordeling van de levensvatbaarheid van astrocyten

  1. Levensvatbaarheid van biogeprinte astrocyten
    1. Breng de biobedrukte constructie met behulp van een spatel over op een kweekschaal van 35 mm.
    2. Was de constructie met 1 ml 1x PBS.
    3. Deponeer 100 μL van het Live/Dead-reagens over het construct en houd het gedurende 30 minuten op 37 °C, zodat het beschermd blijft tegen licht.
    4. Verwijder het Live/Dead-reagens en was de constructie met 1 ml 1x PBS.
    5. Breng het monster over naar een confocale schaal met behulp van een spatel en observeer de cellen in het construct onder een confocale microscoop met behulp van 488 en 570 nm excitatie voor het verkrijgen van beelden.
      OPMERKING: Gebruik een vergroting van 10x voor een algehele visualisatie van de cellen in het construct.
    6. Zorg ervoor dat het monster plat zit. Plaats indien nodig een afdeklip over het monster om de vlakheid te vergroten.
      OPMERKING: Zorg er tijdens het afbeelden voor dat de confocale schaal goed is afgesloten om te voorkomen dat het monster uitdroogt.
    7. Bereken het aantal levensvatbare (groene) en dode (rode) met behulp van een rekensoftware.
  2. Levensvatbaarheid van 2D astrocyten cultuur
    1. Zaad 0,5 x 106 astrocyten (passage 1-3) in een confocale schaal van 35 mm, voeg astrocyten medium toe en incubeer ze bij 37 °C en 5% CO2.
    2. Wanneer cellen samenvloeien, verwijdert u het kweekmedium en wast u het met 1 ml 1x PBS.
    3. Deponeer 200 μL van het Live/Dead-reagens en houd de schaal gedurende 30 minuten op 37 °C, beschermd tegen licht.
    4. Verwijder het Live/Dead-reagens en was de cellen met 1 ml 1x PBS.
    5. Breng de schotel naar een confocale microscoop in combinatie met een digitale camera en gebruik 488 en 570 nm excitatie voor beeldverkrijging.
    6. Bereken het aantal levensvatbare (groene) en dode (rode) met behulp van een rekensoftware.

8. Immunostaining van astrocyten

  1. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) kleuring van 3D bioprinted astrocyten
    OPMERKING: Om de aanwezigheid van andere celmarkers te onderzoeken, moet u het primaire antilichaam dienovereenkomstig wijzigen.
    1. Haal het medium uit de put en was de constructie met 1 ml 3x PBS.
    2. Voeg 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS toe aan de put totdat de constructie volledig bedekt is en laat het 2 uur bij 4 °C staan.
    3. Verwijder de PFA en was de constructie met 1 ml 3x PBS.
      OPMERKING: Deze procedure kan enkele maanden worden gepauzeerd als deze bij 4 °C in PBS wordt bewaard. Zorg ervoor dat de putplaat is afgedicht om PBS-verdamping te voorkomen.
    4. Behandel het monster met glycine 0,1 mol/l gedurende 5 minuten.
    5. Was met 1 ml 1x PBS gedurende 5 minuten.
    6. Permeabiliseer het monster met PBS dat 0,1% Triton X-100 en 10% FBS bevat gedurende 1 uur bij 25 °C onder orbitale agitatie.
    7. Incubeer het construct met kippenanti-GFAP (primaire antilichaamverdunning 1:500) bij 4 °C gedurende de nacht.
    8. Aspiraleer het primaire antilichaam en was het monster met 1 ml PBS gedurende 5 minuten, 3 keer.
      OPMERKING: Primaire antilichamen kunnen meerdere keren worden hergebruikt wanneer ze bij 4 °C worden bewaard.
    9. Incubeer het monster met Alexa fluor 488-geconjugeerde anti-kip (secundaire antilichaamverdunning 1:500) en 1 μg /ml DAPI gedurende 1 uur bij 25 °C onder orbitale agitatie.
      OPMERKING: Houd het monster beschermd tegen licht.
    10. Was het monster met 1 ml PBS gedurende 5 minuten, 3 keer.
    11. Breng de constructie over in een confocale schaal van 35 mm.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het gerecht goed is afgesloten om te voorkomen dat het monster uitdroogt.
  2. Glial fibrillary acidic protein (GFAP) kleuring van 2D astrocyten cultuur
    1. Zaad 0,5 x 106 astrocyten (passage 1-3) in een confocale schaal van 35 mm, voeg astrocyten medium toe en incubeer ze bij 37 °C en 5% CO2.
    2. Wanneer de cellen samenvloeien, verwijdert u het kweekmedium en wast u ze met 1 ml 1x PBS.
    3. Herhaal stap 8.1.2-8.1.10.
  3. Astrocyten cytoskelet kleuring
    1. Herhaal stap 8.1.1-8.1.6.
    2. Voeg 200 μL van 50 μg/ml fluorescerend-geconjugeerde falloïdine-oplossing toe in PBS en 1 μg/ml DAPI over het construct.
    3. Incubeer gedurende 1 uur bij 25 °C onder orbitale agitatie, waardoor het monster tegen licht beschermd blijft.
    4. Was het monster met 1 ml PBS gedurende 5 min 3 keer en breng het construct over in een confocale schaal met behulp van een spatel.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het gerecht goed is afgesloten om te voorkomen dat het monster uitdroogt.

9. Confocale beeldvorming

  1. Breng de schotels naar een confocale microscoop in combinatie met een digitale camera voor beeldvorming (359, 488 en 570 nm excitatie).
  2. Gebruik een vergroting van 10x voor een algehele visualisatie en 40 of 63x voor ingezoomde afbeeldingen van cellen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het monster plat zit. Plaats indien nodig een afdeklip over het monster om de vlakheid te vergroten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit werk was gericht op het ontwikkelen van een neuraalachtig weefsel met behulp van de 3D-bioprinttechnologie om laag voor laag primaire astrocyten-beladen gelatine / GelMA / fibrinogeen bioink af te zetten. Astrocyten werden geëxtraheerd en geïsoleerd uit de hersenschors van muizenjongen (figuur 1), toegevoegd aan een biomateriaalsamenstelling, waardoor de biofabricage van een levend 3D-construct mogelijk werd.

Het computer-aided-design (CAD) is ontwikkeld met b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De 3D-bioprinttechnologie is naar voren gekomen als een biofabricageternatief dat de engineering van verfijnde constructies mogelijk maakt die structureel en fysiologisch lijken op inheemse weefsels22, inclusief de hersenen23. De biofabricage van neurale weefsels maakt in vitro inheemse micro-omgevingsmodellering mogelijk, een belangrijk hulpmiddel voor het begrijpen van de cellulaire en moleculaire mechanismen die verband houden met de ontwikkeling en behandeling ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen conflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door The São Paulo Research Foundation (FAPESP), subsidienummers 2018/23039-3 en 2018/12605-8; Nationale Raad voor Wetenschappelijke en Technologische Ontwikkeling (CNPq), subsidienummers 465656/2014-5 en 309679/2018-4; en Coördinatie voor de verbetering van het personeel in het hoger onderwijs (CAPES), financiële code 001.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3D Bioprinter3D Biotechnology SolutionsExtrusie-gebaseerde bioprinter
Blunt-tip forcepsIntegra Miltex6--30Forceps voor hersendissectie eerder gesteriliseerd
Bovine serum albuminSigma-Aldrich9048-46-8Protease vrij, vetzuur vrij, essentieel globuline vrij
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4
Cell culture flaskFisher Scientific156340Kweekkolf T25
Cell strainerCorning Incorporated352340Cell strainer 40 µm
Confocal microscopeLeicaConfocal TCS SP8 microscopie gekoppeld aan een Olympus FluoView 300 confocal systeem
Conical tubesThermo Scientific339651, 339652Steriele buizen van 15 mL en 50 mL
DAPIAbcamab224589DAPI kleuroplossing
DMEM/F12Gibco; Life Technologies Corporation12500062DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) met L-glutamine
Dyalisis tubingSigma-AldrichD9527Molecuulgewicht cut-off = 14 kDa
EthanolFisher Scientific64-15-5Reagenskwaliteit
Fetal Bovine SerumGibco; Life Technologies Corporation12657011Research Grade
FibrinogenSigma-Aldrich9001-32-5Fibrinogeen kristallijn poeder van runderplasma
GelatinSigma-Aldrich9000-70-8Gelatine poeder van varkenshuid
GlycineSigma-Aldrich56-40-6Glycine poeder
Hanks Buffered Salt Solution (HBSS)Gibco; Life Technologies Corporation14175095Geen calcium, geen magnesium, geen fenolrood
L-GlutamineSigma-Aldrich56-85-9L-Glutamine kristallijn poeder
LamininSigma-Aldrich114956-81-9Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl
Live dead kit cell imaging kitThermo ScientificR37601Groene fluorescentie in levende cellen (ex/em 488 nm/515 nm). Rode fluorescentie in dode cellen (ex/em 570 nm/602 nm)
Methacrylic anhydrideSigma-Aldrich760-93-0Voor GelMA voorbereiding
MicrotubesCorning IncorporatedMCT-150-CMicrotubes van 1,5 mL
NaClSigma-Aldrich7647-14-5
Needle 22GFisher ScientificNC1362045Steriele stompe naald
Operating scissorIntegra Miltex05--02Scherpe schaar voor hersendissectie eerder gesteriliseerd
ParaformaldehydeSigma-Aldrich30525-89-4Paraformaldehyde poeder
Penicillin/StreptomycinGibco; Life Technologies Corporation15070063Pen Strep (5.000 eenheden/mL Penicilline; 5.000 µg/mL Streptomycine)
Petri dishCorning Incorporated430591, 430588Steriele petrischalen van 35 en 100 mm
PhalloidinAbcamab176753iFluor 488 reagens
PhotoinitiatorSigma-Aldrich106797-53-92-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiofenon
Phosphate buffer saline (PBS)Gibco; Life Technologies Corporation10010023PBS 1 x, kweekkwaliteit, geen calcium, geen magnesium
Poly-L-lysineSigma-Aldrich25988-63-0Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30.000-70.000
Primary antobodyAbcamab4674Kip polyklonaal voor GFAP
Secondary antibodyAbcamab150176Alexa fluor 594 anti-kip
SpatulaMiltexV973-70Nummer 24 cementspatel eerder gesteriliseerd
StereomicroscopeFisherbrand3000038Microscoop voor hersendissectie
Syringe 5 mLBD1222C84Steriele spuit
Syringe filter 2 µmFisher Scientific09-740-105Polypropyleen filter voor sterilisatie
ThrombinSigma-Aldrich9002--04-4Thrombine kristallijn poeder van runderplasma
Triton X-100Sigma-Aldrich9002-93-1Laboratoriumkwaliteit
Trypsin-EDTAGibco; Life Technologies Corporation15400054Trypsine geen fenolrood 1 x verdund in PBS
Versene solutionGibco; Life Technologies Corporation15040066Versene oplossing (0,48 mM) geformuleerd als 0,2 g EDTA(Na4) per liter PBS
Well plateThermo Scientific144530Steriele 24-well plate

Referenties

  1. Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114(2019).
  2. Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
  3. Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
  4. Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
  5. Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
  6. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
  7. Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
  8. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079(2013).
  9. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  10. Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
  11. Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
  12. Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
  13. Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
  14. Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
  15. Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
  16. de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414(2018).
  17. Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
  18. Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
  19. Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
  20. de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
  21. Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401(2017).
  22. Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
  23. de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
  24. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884(2019).
  25. Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
  26. Liu, R., Wang, Z. h, Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
  27. Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848(2018).
  28. East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
  29. Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
  30. Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
  31. Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
  32. Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
  33. Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001(2018).
  34. Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
  35. Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
  36. Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
  37. Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036(2016).
  38. Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517(2018).
  39. Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619(2020).
  40. Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
  41. Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757(2020).
  42. Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
  43. Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
  44. Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
  45. Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Neuraal weefselengineeringastrocyten bioinkextrusie bioprintengliafibrillair zuur eiwitbiomateriaalsteigercelviabiliteitsassayimmunofluorescentiemicroscopieastrocytAire morfologie
3D Bioprinting van Murine Cortiical Astrocytes voor Engineering Neural-Like Tissue
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.