Methodenartikel

Een geoptimaliseerd O9-1/Hydrogel-systeem voor het bestuderen van mechanische signalen in neurale crest-cellen

3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62693

⸱

13 augustus 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas Health Science Center at Houston, 3SEM AFM Core in the Houston Methodist Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Gedetailleerde stapsgewijze protocollen worden hier beschreven voor het bestuderen van mechanische signalen in vitro met behulp van multipotente O9-1 neurale crest cellen en polyacrylamide hydrogels van verschillende stijfheid.

Samenvatting

Neurale crest-cellen (NCC's) zijn embryonale multipotente cellen van gewervelde dieren die kunnen migreren en differentiëren in een breed scala aan celtypen die aanleiding geven tot verschillende organen en weefsels. Weefselstijfheid produceert mechanische kracht, een fysieke aanwijzing die een cruciale rol speelt bij NCC-differentiatie; het mechanisme blijft echter onduidelijk. De hier beschreven methode biedt gedetailleerde informatie voor de geoptimaliseerde generatie van polyacrylamidehydrogels met verschillende stijfheid, de nauwkeurige meting van dergelijke stijfheid en de evaluatie van de impact van mechanische signalen in O9-1-cellen, een NCC-lijn die in vivo NCC's nabootst.

Hydrogelstijfheid werd gemeten met behulp van atoomkrachtmicroscopie (AFM) en gaf dienovereenkomstig verschillende stijfheidsniveaus aan. O9-1 NCC's gekweekt op hydrogels met verschillende stijfheid vertoonden verschillende celmorfologie en genexpressie van stressvezels, wat duidde op verschillende biologische effecten veroorzaakt door mechanische signaalveranderingen. Bovendien werd vastgesteld dat het variëren van de hydrogelstijfheid resulteerde in een efficiënt in vitro systeem om mechanische signalering te manipuleren door de gelstijfheid te veranderen en de moleculaire en genetische regulatie in NCC's te analyseren. O9-1 NCC's kunnen differentiëren in een breed scala aan celtypen onder invloed van de overeenkomstige differentiatiemedia, en het is handig om chemische signalen in vitrote manipuleren . Daarom is dit in vitro systeem een krachtig hulpmiddel om de rol van mechanische signalering in NCC's en de interactie met chemische signalen te bestuderen, wat onderzoekers zal helpen de moleculaire en genetische mechanismen van de ontwikkeling en ziekten van de neurale top beter te begrijpen.

Inleiding

Neurale crest-cellen (NCC's) zijn een groep stamcellen tijdens gewervelde embryogenese met een opmerkelijk vermogen om te migreren en bij te dragen aan de ontwikkeling van verschillende organen en weefsels. NCC's kunnen differentiëren in verschillende celtypen, waaronder sensorische neuronen, kraakbeen, bot, melanocyten en gladde spiercellen, afhankelijk van de locatie van axiale oorsprong en de lokale omgevingsrichtlijnen van de NCC1,2. Met het vermogen om te differentiëren in een breed scala aan celtypen, kunnen genetische afwijkingen die ontregeling veroorzaken in elk stadium van de ontwikkeling van de neurale top (NC) leiden tot tal van aangeboren ziekten2. Verstoringen tijdens de vorming, migratie en ontwikkeling van NCC's leiden bijvoorbeeld tot ontwikkelingsstoornissen die gezamenlijk bekend staan als neurocristopathieën1,3. Deze ziekten variëren van craniofaciale defecten als gevolg van falen in NCC-vorming, zoals het Treacher Collins-syndroom, tot de ontwikkeling van verschillende kankers als gevolg van NCC-gemetastaseerd migratievermogen, zoals te zien bij melanoom3,4,5,6. In de afgelopen decennia hebben onderzoekers opmerkelijke ontdekkingen gedaan over de rollen en mechanismen van NCC's in ontwikkeling en ziekten, waarbij de meeste bevindingen gericht zijn op chemische signalen7,8. Meer recent is aangegeven dat mechanische signalen een kritische maar slecht begrepen rol spelen in de ontwikkeling van NCC9,10.

De omgevingsfactoren van NCC's spelen een cruciale rol tijdens hun ontwikkeling, inclusief de regulering van NCC-differentiatie in verschillende celtypen. Omgevingssignalen, bijvoorbeeld fysieke signalen, beïnvloeden cruciaal gedrag en cellulaire reacties, zoals functionele diversificatie. Mechanotransductie stelt cellen in staat om die signalen te detecteren en erop te reageren om verschillende biologische processen in stand te houden2. NCC's zijn omgeven door naburige cellen en verschillende substraten, zoals de extracellulaire matrix (ECM), die aanleiding kan geven tot mechanische stimuli om de homeostase te behouden en zich aan te passen aan de veranderingen door lotbepaling, proliferatie en apoptose11. Mechanotransductie begint bij het plasmamembraan waar de sensorische component van mechanische extracellulaire stimuli optreedt, wat resulteert in de intracellulaire regulatie van de cel12. Integrinen, focale verklevingen en juncties van het plasmamembraan geven mechanische signalen, zoals schuifkrachten, spanning en de stijfheid van omliggende substraten, in chemische signalen om cellulaire reacties te produceren12. Het doorgeven van chemische signalen van het plasmamembraan naar de uiteindelijke cellulaire regulatie wordt uitgevoerd via verschillende signaalroutes om vitale processen voor het organisme, zoals differentiatie, af te ronden.

Verschillende studies hebben gesuggereerd dat mechanische signalering van substraatstijfheid een rol speelt bij celdifferentiatie13,14. Eerdere studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat mesenchymale stamcellen (MSC's) gekweekt op zachte substraten met een stijfheid vergelijkbaar met die van hersenweefsel (in het bereik van 0,1-1,0 kPa) resulteerden in neuronale celdifferentiatie15,16. Meer MSC's differentiëren echter in myocytachtige cellen wanneer ze worden gekweekt op 8-17 kPa-substraten die de stijfheid van spieren nabootsen, terwijl osteoblastachtige differentiatie werd waargenomen wanneer MSC's werden gekweekt op stijve substraten (25-40 kPa)15,16. Het belang van mechanotransductie wordt benadrukt door de onregelmatigheden en afwijkingen in de mechanische signaleringsroute die mogelijk leiden tot ernstige ontwikkelingsstoornissen en ziekten, waaronder kanker, hart- en vaatziekten en osteoporose17,18,19. Bij kankers is normaal borstweefsel zacht en neemt het risico op borstkanker toe in stijf en dicht borstweefsel, een omgeving die meer lijkt op borsttumoren15. Met deze kennis kunnen de effecten van mechanische signalering op de ontwikkeling van NCC worden bestudeerd door eenvoudige manipulatie van substraatstijfheid door middel van een in vitro systeem, wat verdere voordelen en mogelijkheden biedt bij het begrijpen van de fundamenten van NC-gerelateerde ziekteprogressie en etiologie.

Om de impact van mechanische signalen in NCC's te bestuderen, hebben we een efficiënt in vitro systeem voor NCC's opgezet op basis van de optimalisatie van eerder gepubliceerde methoden en evaluatie van de reacties van NCC's op verschillende mechanischesignalen 20,21. Er werd een gedetailleerd protocol verstrekt voor de voorbereiding van de variërende hydrogelstijfheid en evaluatie van de impact van mechanische signalering in NCC's. Om dit te bereiken, worden O9-1 NCC's gebruikt als het NC-model om de effecten en veranderingen in reactie op stijve versus zachte hydrogels te bestuderen. O9-1 NCC's zijn een stabiele NC-cellijn geïsoleerd uit muizenembryo (E) op dag 8,5. O9-1 NCC's bootsen NCC's in vivo na omdat ze kunnen differentiëren in verschillende NC-afgeleide celtypen in gedefinieerde differentiatiemedia22. Om de mechanische signalering van NCC's te bestuderen, werd een matrixsubstraat vervaardigd met instelbare elasticiteit van verschillende concentraties acrylamide en bis-acrylamide-oplossingen om de gewenste stijfheid te bereiken, correlerend met de biologische substraatstijfheid20,21,23. Om de omstandigheden van matrixsubstraat voor NCC's, met name O9-1-cellen, te optimaliseren, werden wijzigingen aangebracht in het eerder gepubliceerde protocol20. Een verandering in dit protocol was het incuberen van hydrogels in collageen I, verdund in 0,2% azijnzuur in plaats van 50 mM HEPES, bij 37 °C gedurende de nacht. De lage pH van azijnzuur leidt tot een homogene verdeling en een hogere collageen I-opname, waardoor een meer uniforme aanhechting van het ECM-eiwit mogelijk is24. Daarnaast werd een combinatie van paardenserum en foetaal runderserum (FBS) gebruikt in concentraties van respectievelijk 10% en 5% in fosfaatbufferzoutoplossing (PBS), voordat de hydrogels in de couveuse werden bewaard. Paardenserum werd gebruikt als een extra aanvulling op FBS vanwege het vermogen om celproliferatie en differentiatie te bevorderen bij een concentratie van 10%25.

Met deze methode werd een biologische omgeving nagebootst door de ECM-eiwitcoating (bijv. Collageen I) om een nauwkeurige in vitro omgeving te creëren voor NCC's om te groeien en te overleven20,21. De stijfheid van de bereide hydrogels werd kwantitatief geanalyseerd via atomic force microscopy (AFM), een bekende techniek om de elastische modulus weer te geven26. Om het effect van verschillende stijfheidsniveaus op NCC's te bestuderen, werden wild-type O9-1-cellen gekweekt en bereid op hydrogels voor immunofluorescentie (IF) kleuring tegen filamenteuze actine (F-actine) om de verschillen in celadhesie en morfologieën aan te tonen als reactie op veranderingen in substraatstijfheid. Met behulp van dit in vitro systeem zullen onderzoekers in staat zijn om de rol van mechanische signalering in NCC's en de interactie met andere chemische signalen te bestuderen om een dieper inzicht te krijgen in de relatie tussen NCC's en mechanische signalering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Hydrogel voorbereiding

OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een celkweekkap die vóór gebruik is gedesinfecteerd met ethanol en ultraviolet (UV) -gesteriliseerd om de steriliteit te behouden. Gereedschappen, zoals pincetten en pipetten, moeten worden besproeid met ethanol. Bufferoplossingen moeten ook steriel worden gefilterd.

  1. Bereiding van aminosilane-gecoate glazen coverslips
    1. Plaats het gewenste aantal glazen afdekplaten op een stuk laboratoriumdoekje.
      OPMERKING: Bereid een extra 3-4 coverslips voor om ervoor te zorgen dat er voldoende back-upvoorraden zijn als ze gemakkelijk breken. Verschillende materialen van glazen coverslips zullen verschillende compatibiliteit van celzaaien en hechten opleveren. Het is beter om te bepalen welk type het beste bij het experiment past voordat u met de experimenten begint (zie de tabel met materialen).
    2. Gebruik een alcoholbrander of Bunsen-brander om elke coverslip te steriliseren door deze heen en weer door de vlam te laten gaan (30 s voor eiwittestexperimenten). Plaats elke glazen afdekplaat op een laboratoriumdoekje om af te koelen.
    3. Zodra de glazen afdekkingen zijn afgekoeld, breng je ze over op een petrischaaltje bekleed met parafilm om uitglijden te voorkomen.
      OPMERKING: Als de coverslips niet koel genoeg zijn, zal de restwarmte de parafilm op de slips smelten, waardoor ze onbruikbaar worden.
    4. Dek de coverslips af met ongeveer 200 μL en 800 μL van 0,1 M NaOH voor respectievelijk een coverslip van 12 mm en 25 mm en laat ze 5 minuten zitten. Adem vervolgens de 0,1 M NaOH op en laat de coverslips nog 5 minuten aan de lucht drogen om een gelijkmatige film te vormen.
    5. Pipetteer na het drogen van de coverslips ongeveer 80 μL en 150 μL 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTS) voor respectievelijk 12 mm en 25 mm coverslips. Wees voorzichtig om te voorkomen dat de oplossing op de parafilm wordt gemorst. Laat de oplossing 5 minuten zitten.
    6. Zuig zoveel mogelijk overtollige APTS op en laat de resterende APTS 5 min drogen. Spoel de coverslips goed af door ze drie keer gedurende 5 minuten onder te dompelen in steriele, gedeïoniseerde (DI) H2O.
      OPMERKING: Als de glazen afdekplaten niet goed worden gespoeld, veroorzaakt de resterende APTS ongewenste reacties met glutaaraldehyde, waardoor een wit neerslag ontstaat en resulteert in onbruikbare coverslips.
    7. Verplaats de coverslips naar een nieuwe petrischaal met de reactieve kant naar boven gericht. Voeg voldoende 0,5% glutaaraldehyde toe aan de petrischaal om de coverslips volledig te bedekken en laat de coverslips 30 minuten zitten.
    8. Zuig de 0,5% glutaaraldehyde op en spoel de afdeksels gedurende 3 min één keer opnieuw af in DI H2O. Zet de coverslips reactief met de zijkant naar boven op een laboratoriumdoekje of een schone petrischaal om volledig aan de lucht te drogen voor gebruik.
      OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd; coverslips moeten tot gebruik in steriel DI H2O worden geplaatst.
  2. Bereiding van gesiliconiseerde coverslips
    1. Plaats hetzelfde aantal coverslips als de met aminosilaan gecoate coverslips (stap 1.1.1) in een petrischaaltje bekleed met parafilm.
    2. Pipetteer 40 μL of 150 μL voor respectievelijk 12 mm en 25 mm coverslips van dichlooremethylsilaan (DCMS) aan één kant van de coverslip en laat de oplossing 5 minuten zitten.
    3. Zuig de resterende oplossing uit de deklap aan, was eenmaal gedurende 1 minuut in steriel DI H2O en plaats de reactieve dekzeilen met de voorkant naar boven op een laboratoriumdoekje om volledig aan de lucht te drogen voordat u naar de volgende stap gaat.
  3. Hydrogels bereiden
    1. Meng acrylamide, bisacrylamide en DI H2O in een centrifugebuis van 1,5 ml om 500 μL oplossingen met verschillende stijfheid te bereiden (zie tabel 1). Vortex de oplossing voor 30 s om het grondig te mengen.
    2. Voeg snel de 10% ammoniumpersulfaatoplossing (APS) en tetramethylethyleendiamine (TEMED) toe aan de buis en draai de oplossingen opnieuw om de oplossingen te mengen.
      OPMERKING: Bereid verse 10% APS en laat het op ijs of vries het in tot aliquots voor eenmalig gebruik vanwege de gevoelige vries- / dooicyclus.
    3. Pipetteer ongeveer 33 μL of 100 μL van de oplossing op de gedroogde 12 mm of 25 mm aminosilane-gecoate coverslips (punt 1.1).
    4. Plaats met behulp van een gebogen pincet onmiddellijk de met DCMS behandelde coverslip bovenop de geloplossing met de behandelde zijde die de geloplossing raakt, waardoor de geloplossing tussen de met DCMS behandelde coverslip en aminosilane-gecoate coverslip wordt gesandwicht.
    5. Laat de geloplossing gedurende 5-15 minuten polymeriseren, terwijl u actief controleert op gelpolymerisatie van de overgebleven oplossing in de buis.
    6. Zodra de gel is gepolymeriseerd, scheidt u de met DCMS behandelde coverslip met een gebogen pincet of een scheermesje, waardoor de gel vastzit aan de originele aminosilane-gecoate coverslip.
    7. Plaats de coverslip met de aangehechte hydrogel onmiddellijk in een vooraf bepaalde 4-well/24-well en 6-well plaat bedekt met 500 μL en 2 ml steriele PBS of DI H2O voor respectievelijk 12 mm en 25 mm coverslips, om te voorkomen dat de gel uitdroogt.
    8. Herhaal stap 1.3.4-1.3.7 voor alle coverslips.
    9. Dompel de hydrogels gedurende 30 minuten onder in steriel PBS of DI H2O om overtollige acrylamideoplossing te verwijderen. Bewaar de hydrogels in steriel PBS of DI H2O bij 4 °C voor een procedurele stop hier.
    10. Bereid in een donkere kamer het sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrofenylamino) hexanoaat (sulfo-SANPAH) mengsel door 2,5 ml van 50 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl] ethaansulfonzuur (HEPES) (pH = 8,5) te mengen met 25 μL van de 50 μg / ml sulfo-SANPAH in een conische buis, gewikkeld in aluminiumfolie om te beschermen tegen licht. Gebruik een pipet om de oplossing goed te mengen voor gebruik.
      OPMERKING: Een volume van 2,5 ml sulfo-SANPAH-oplossing is voldoende voor ongeveer vijfentwintig 12 mm hydrogels of vijf 25 mm hydrogels.
    11. Aspirateer PBS of DI H2O uit de putplaat. Voeg ongeveer 100 μL of 500 μL voor respectievelijk 12 mm en 25 mm coverslips van sulfo-SANPAH-oplossing (stap 1.3.10) toe om de gel te bedekken. Zorg ervoor dat de oplossing de gel volledig bedekt.
      OPMERKING: Pas de vacuümzuigkracht aan om te voorkomen dat de sterke kracht de hydrogels scheurt of verstoort.
    12. Plaats de gels met de oplossing gedurende 10 minuten onder een UV-licht van 15 W, 365 nm, onbedekt om eventuele interferentie van het UV-licht dat reageert met de sulfo-SANPAH te minimaliseren.
    13. Zuig het teveel aan sulfo-SANPAH op door de plaat te kantelen om zoveel mogelijk van de oplossing te verzamelen. Was de gel twee tot drie keer met 50 mM HEPES.
    14. Voeg 500 μL en 2 ml voor respectievelijk 12 mm en 25 mm gels van 50 mg/ml collageen I verdund in 0,2% azijnzuur toe aan elke put die de hydrogel bevat. Laat de gels een nacht incuberen in een incubator van 37 °C, 5% CO2.
      OPMERKING: Verdun collageen I in 0,2% azijnzuur in plaats van 50 mM HEPES om homogene distributie en aanhechting van collageen I te bevorderen.
    15. Zuig het collageen I op en was de gels drie keer met steriel PBS om overtollig collageen I gedurende 5 minuten per wasbeurt te verwijderen. Incubeer de hydrogels in PBS met 10% paardenserum, 5% FBS gedurende 2 uur in de incubator van 37 °C, 5% CO2 incubator.
      OPMERKING: De toevoeging van 10% paardenserum bevordert een hogere proliferatie in vergelijking met alleen het gebruik van FBS zoals gedaan in de vorige publicatie.
    16. Adem het medium op. Voeg 500 ml steriel gefilterd Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine (P / S) toe aan elke put. Bewaar de gels in de 37 °C, 5% CO2 incubator totdat ze klaar zijn voor celkweek.
    17. Eenmaal klaar, bord ongeveer 1,5 × 104 O9-1 cellen / cm2 in basaal medium in de kweekschalen. Incubeer de cellen gedurende 2 dagen in een incubator bij 37 °C, 5% CO2. Controleer de cellen op confluïteit om ervoor te zorgen dat de cellen voldoende aan gels zijn bevestigd en dat het aantal cellen voldoende is voordat ze worden verzameld voor analyse.
      OPMERKING: Zie het eerder gepubliceerde protocol voor de stappen van herstel, passage en verzameling van O9-1-cellen20.
    18. Ga verder met secties 2, 3 of 4 voor verdere analyse van de hydrogels.

2. Kwantitatieve analyse van stijfheid via AFM

  1. Start de AFM-systeemcomputer, gevolgd door de AFM-controller (zie de Tabel met Materialen).
  2. Monteer de AFM-uitkraging op de AFM-sondehouder. Gebruik een bolvormige cantilever met een silicakraal van 0,5 μm gemonteerd aan het uiteinde van de cantilever (cantilever met bolvormige kraal).
    OPMERKING: Voor stijvere hydrogels, zoals 10 kPa, 20 kPa en 40 kPa, werd een stijvere sonde gebruikt met de veerconstante van 0,24 N/m. Een zachtere sonde werd gebruikt voor zachtere hydrogels, zoals 0,5 kPa en 1 kPa, met een veerconstante van 0,059 N/m.
  3. Stel de AFM-software in op contactmodus.
  4. Monteer de siliciumwafer op de AFM-monstertrap om krachtcurven te verzamelen door op Engage te klikken om de cantilever het siliciumsubstraat te laten raken, waardoor de krachtcurven worden gegenereerd.
  5. Gebruik de krachtcurven hierboven (2.4) voor kalibratie, klik op Kalibreren in de besturingssoftware om een gemiddelde veerconstante van de cantilever onder thermische afstemconditie te verkrijgen en sla de gekalibreerde waarden op in de besturingssoftware.
  6. Monteer de monsters door de afdekplaat met de aangehechte hydrogel in een petrischaaltje van 60 mm op de AFM-scanfase te plaatsen. Voeg 3 ml PBS toe aan de schaal voordat u metingen uitvoert om te voorkomen dat de gel uitdroogt.
  7. Stel de AFM in om in contactmodus (vloeistof) te werken om de meting te starten. Schakel de bolvormige kraal in om het gelmonster continu aan te raken en op te tillen.
  8. Stel de uitkraging zo in dat de afbuigingsdrempel op 10 nm blijft. Houd de oplopende grootte van de sonde op 10 μm. Noteer vervolgens de krachtcurven zoals in stap 2.4.
  9. Verkrijg ten minste 20 krachtcurven van ten minste 3 tot 10 verschillende plekken over het oppervlak van de hydrogel.
  10. Bereken de gemiddelde Young's modulus van ~20 krachtcurves voor elke plek met AFM imaging en analyse software. Gebruik uitschuifbare hellingkrachtcurven en een lineair model (bolvormig). Bereken het gemiddelde van alle vlekken voor elk monster om de uiteindelijke stijfheid op te leveren.
    OPMERKING: De modulus van Young en gerelateerde gegevens(d.w.z. standaarddeviaties) worden automatisch opgeslagen als een spreadsheet.
  11. Herhaal stap 2.6-2.10 voor alle monsters.

3. Moleculaire analyse van stijfheid via immunofluorescentiekleuring

  1. Gebruik een pincet om de afdekplaat naar een nieuwe plaat te transporteren om valse signalen van cellen die rechtstreeks op de plaat zijn gegroeid te minimaliseren. Was de cellen driemaal met 500 μL steriel PBS om dode cellen en eventueel achtergebleven kweekmedium te verwijderen.
  2. Fixeer de cellen met 500 μL 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 10 minuten ongestoord bij kamertemperatuur. Spoel de cellen vervolgens drie keer opnieuw met 500 μL PBS / put gedurende 2 minuten elk.
    OPMERKING: Bewaren bij 4 °C voor een procedurele stop.
  3. Behandel de cellen met 500 μL van 0,1% Triton X-100 gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen vervolgens drie keer met 500 μL PBS /put.
  4. Blokkeer de cellen met 250 μL 10% ezelserum (verdund in PBS en 0,1% Tween 20) per put gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Incubeer de cellen met 250 μL primaire antilichamen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C. Was de cellen vervolgens drie keer met 500 μL PBS / put gedurende 5 minuten elk.
    OPMERKING: Anti-Vinculin (Vcl) (1:250) en anti-AP2 alfa (1:250) werden gebruikt in dit experiment en werden verdund in 10% ezelsserum.
  6. Incubeer de cellen met overeenkomstige secundaire antilichamen en/of falloïdine die worden gebruikt voor F-actinekleuring bij een verdunning van 1:400 in 250 μL 10% ezelserum gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen vervolgens drie keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
    OPMERKING: 568 nm falloïdine kan worden gecoïncubeerd met 488 nm of 647 nm secundaire antilichamen of op zichzelf.
  7. Incubeer de cellen met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 1:1000 verdunning) in 250 μL PBS gedurende 10 minuten gevolgd door een laatste wasbeurt van PBS gedurende 2 minuten.
  8. Voeg 3-4 druppels montagemedium toe aan elke put. Bewaar de monsters bij 4 °C om ten minste 2 uur vóór het afbeelden in te stellen om ervoor te zorgen dat het montagemedium correct is ingesteld.
  9. Leg beelden vast van ten minste 3 willekeurige frames per hydrogelmonster met een fluorescentiemicroscoop, waardoor individuele en samengevoegde kanalen worden geproduceerd.

4. Kwantitatieve real-time PCR (RT-qPCR)

  1. Breng de hydrogels met de aanhangende cellen voor RNA-verzameling over naar een nieuwe plaat om ongewenst RNA van cellen die aan de celplaat zijn bevestigd te minimaliseren. Was de cellen drie keer met PBS om dode cellen en kweekmedium te verwijderen.
  2. Extraheer het totale mRNA met behulp van een RNA-extractiekit. Voer reverse-transcriptie van RNA naar cDNA uit met behulp van een reverse transcriptie supermix volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Voer RT-qPCR uit met primers voor Vcl als de stijfheidsmarker van keuze en analyseer met behulp van de 2-ΔΔCT-methode.
    OPMERKING: Primervolgorde van Vcl: Voorwaarts 5' GCTTCAGTCAGACCCATACTCG 3'; omgekeerd 5' AGGTAAGCAGTAGGTCAGATGT 3'.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hydrogelvoorbereiding en stijfheidsbeoordeling via AFM en het Hertz-model
Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt om polyacrylamidehydrogels van verschillende stijfheid te genereren door de verhouding acrylamide en bis-acrylamide te reguleren. De polyacrylamide hydrogels zijn echter niet klaar voor de hechting van cellen vanwege het gebrek aan ECM-eiwitten. Sulfo-SANPAH, dat als linker fungeert, bindt dus covalent aan de hydrogels en reageert met de primaire amines van ECM-eiwitten om de <...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het doel van de huidige studie is om een effectief en efficiënt in vitro systeem te bieden om de impact van mechanische signalen in NCC's beter te begrijpen. Naast het volgen van het hierboven genoemde stapsgewijze protocol, moeten onderzoekers in gedachten houden dat de celcultuur van O9-1 NCC's wordt beïnvloed door het type glazen afdekkingsplaten dat wordt gebruikt om hydrogels te bereiden. Er werd bijvoorbeeld opgemerkt dat cellen gezaaid op een specifiek type glazen afdekplaat (zie de tabel met mate...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

We bedanken Dr. Ana-Maria Zaske, exploitant van Atomic Force Microscope-UT Core-faciliteit aan het University of Texas Health Sciences Center, voor de bijgedragen expertise in AFM in dit project. We danken ook de financieringsbronnen van de National Institutes of Health (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 en R01HL142704 aan J. Wang).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-012
2% Bis-AcrylamideSigma AldrichM1533
24-well plateGreiner Bio-one662165
25 mm #1 Corning 0211 Glass CoverslipChemglass Life SciencesCLS-1763-025
3-aminopropyl triethoxysilane (APTS)Sigma AldrichA3648
4-well cell culture plateThermo Scientific179830
4% ParaformaldehydeSigma AldrichJ61899-AP
40% AcrylamideSigma AldrichA4058
50% glutaraldehydeSigma AldrichG7651
6-well cell culture plateGreiner Bio-one657160
AFM cantilever (bolvormige kraal)Novascan
AFM softwareCatalyst NanoScopeModel: 8.15 SR3R1
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo FisherA12379
Ammonium Persulfate (APS)Sigma Aldrich248614Poeder
anti-AP-2α AntibodySanta Cruzsc-12726
anti-Vinculin antibodyAbcamab129002
Atomic Force Microscopy (AFM) Bioscope CatalystBruker Corporation
Collagen type I (100mg)Corning354236
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenylindoldihydrochloride)Thermo FisherD1306
Dichloromethylsilane (DCMS)Sigma Aldrich440272
Donkey serumSigma AldrichD9663
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Corning10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)Corning35-010-CV
FluorescentiemicroscoopLeicaModel DMi8
Fluoromount-G montagemediumSouthernBiotech0100-35
HEPESSigma AldrichH3375Poeder
Paarden serumCorning35-030-CI
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad1708841
Penicillin-Streptomycin antibioticumThermo Fisher15140148
RNeasy micro kitQiagen74004
Steriele 1x PBSHycloneSH30256.02
Steriele gedeïoniseerd waterHardy DiagnosticsU284
sulfo-SANPAHThermo Fisher22589
SYBR greenApplied Biosystems4472908
TEMEDSigma AldrichT9281
Triton X-100Sigma AldrichX100
Tween 20Sigma AldrichP9416

Referenties

  1. Mehrotra, P., Tseropoulos, G., Bronner, M. E., Andreadis, S. T. Adult tissue-derived neural crest-like stem cells: Sources, regulatory networks, and translational potential. Stem Cells Translational Medicine. 9 (3), 328-341 (2020).
  2. Liu, J. A., Cheung, M. Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications. Developmental Biology. 419 (2), 199-216 (2016).
  3. Watt, K. E. N., Trainor, P. A. Neurocristopathies: the etiology and pathogenesis of disorders arising from defects in neural crest cell development. Neural Crest Cells-Evolution, Development and Disease. Trainor, P. A. , Academic Press. 361-394 (2014).
  4. Lavelle, C. L. B. Applied oral physiology. , Butterworth-Heinemann. (1988).
  5. Chin, L. The genetics of malignant melanoma: lessons from mouse and man. Nature Reviews Cancer. 3 (8), 559-570 (2003).
  6. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  7. Wang, Q., et al. Perturbed development of cranial neural crest cells in association with reduced sonic hedgehog signaling underlies the pathogenesis of retinoic-acid-induced cleft palate. Disease Models & Mechanisms. 12 (10), (2019).
  8. Rocha, M., Singh, N., Ahsan, K., Beiriger, A., Prince, V. E. Neural crest development: insights from the zebrafish. Developmental Dynamics. 249 (1), 88-111 (2020).
  9. Barriga, E. H., Franze, K., Charras, G., Mayor, R. Tissue stiffening coordinates morphogenesis by triggering collective cell migration in vivo. Nature. 554 (7693), 523-527 (2018).
  10. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  11. Mason, D. E., et al. YAP and TAZ limit cytoskeletal and focal adhesion maturation to enable persistent cell motility. Journal of Cell Biology. 218 (4), 1369-1389 (2019).
  12. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  13. Lu, Y. -B., et al. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (47), 17759-17764 (2006).
  14. Georges, P. C., Miller, W. J., Meaney, D. F., Sawyer, E. S., Janmey, P. A. Matrices with compliance comparable to that of brain tissue select neuronal over glial growth in mixed cortical cultures. Biophysical Journal. 90 (8), 3012-3018 (2006).
  15. Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
  16. Engler, A., Sweeney, H., Discher, D., Schwarzbauer, J. E. Extracellular matrix elasticity directs stem cell differentiation. Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions. 7 (4), 335(2007).
  17. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  18. Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. Journal of Cell Science. 121 (22), 3794-3802 (2008).
  19. Robling, A. G., Turner, C. H. Mechanical signaling for bone modeling and remodeling. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 19 (4), 319-338 (2009).
  20. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 10, Unit 10.16 (2010).
  21. Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2089(2010).
  22. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  23. Engler, A., et al. Substrate compliance versus ligand density in cell on gel responses. Biophysical Journal. 86 (1), 617-628 (2004).
  24. Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Varying solvent type modulates collagen coating and stem cell mechanotransduction on hydrogel substrates. APL Bioengineering. 3 (3), 036108(2019).
  25. Fedoroff, S., Hall, C. Effect of horse serum on neural cell differentiation in tissue culture. In vitro. 15 (8), 641-648 (1979).
  26. Huth, S., Sindt, S., Selhuber-Unkel, C. Automated analysis of soft hydrogel microindentation: Impact of various indentation parameters on the measurement of Young's modulus. PLoS One. 14 (8), 0220281(2019).
  27. Mitchell, P. J., Timmons, P. M., Hébert, J. M., Rigby, P., Tjian, R. Transcription factor AP-2 is expressed in neural crest cell lineages during mouse embryogenesis. Genes & Development. 5 (1), 105-119 (1991).
  28. Wegner, M. Neural crest diversification and specification: transcriptional control of Schwann Cell differentiation. Encyclopedia of Neuroscience. , 153-158 (2010).
  29. Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-β. Biomaterials. 32 (16), 3921-3930 (2011).
  30. Sun, M., et al. Effects of matrix stiffness on the morphology, adhesion, proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. International Journal of Medical Sciences. 15 (3), 257(2018).
  31. Burridge, K., Guilluy, C. Focal adhesions, stress fibers and mechanical tension. Experimental Cell Research. 343 (1), 14-20 (2016).
  32. Burridge, K. Focal adhesions: a personal perspective on a half century of progress. The FEBS Journal. 284 (20), 3355-3361 (2017).
  33. Zhou, C., et al. Compliant substratum modulates vinculin expression in focal adhesion plaques in skeletal cells. International Journal of Oral Science. 11 (2), 1-9 (2019).
  34. Fernández, J. L. R., Geiger, B., Salomon, D., Ben-Ze'ev, A. Overexpression of vinculin suppresses cell motility in BALB/c 3T3 cells. Cell Motility and the Cytoskeleton. 22 (2), 127-134 (1992).
  35. Coll, J., et al. Targeted disruption of vinculin genes in F9 and embryonic stem cells changes cell morphology, adhesion, and locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (20), 9161-9165 (1995).
  36. Saunders, R. M., et al. Role of vinculin in regulating focal adhesion turnover. European Journal of Cell Biology. 85 (6), 487-500 (2006).
  37. Kuo, J. -C. Focal adhesions function as a mechanosensor. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 126, 55-73 (2014).
  38. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58346(2018).
  39. Kolewe, K. W., Zhu, J., Mako, N. R., Nonnenmann, S. S., Schiffman, J. D. Bacterial adhesion is affected by the thickness and stiffness of poly (ethylene glycol) hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (3), 2275-2281 (2018).
  40. Lin, Y. -C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review E. 82 (4), 041918(2010).
  41. Mullen, C. A., Vaughan, T. J., Billiar, K. L., McNamara, L. M. The effect of substrate stiffness, thickness, and cross-linking density on osteogenic cell behavior. Biophysical Journal. 108 (7), 1604-1612 (2015).
  42. Tusan, C. G., et al. Collective cell behavior in mechanosensing of substrate thickness. Biophysical Journal. 114 (11), 2743-2755 (2018).
  43. McBurney, M. W., Jones-Villeneuve, E. M., Edwards, M. K., Anderson, P. J. Control of muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature. 299 (5879), 165-167 (1982).
  44. Hasegawa, A., Shirayoshi, Y. P19 cells overexpressing Lhx1 differentiate into the definitive endoderm by recapitulating an embryonic developmental pathway. Yonago Acta Medica. 58 (1), 15(2015).
  45. Wells, R. G. Tissue mechanics and fibrosis. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (7), 884-890 (2013).
  46. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  47. Butler, J. P., Tolic-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  48. Leong, W. S., et al. Thickness sensing of hMSCs on collagen gel directs stem cell fate. Biochemical and Biophysical Research Communications. 401 (2), 287-292 (2010).
  49. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  50. Funaki, M., Janmey, P. A. Technologies to engineer cell substrate mechanics in hydrogels. Biology and Engineering of Stem Cell Niches. , Academic Press. 363-373 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hydrogelstijfheidmechanische signaleringO9 1 cellenpolyacrylamidhydrogelsatoomkrachtmicroscopieceldifferentiatieimmunofluorescentiekleuringexpressie van stressvezelsfocale adhesie

Gerelateerde artikelen