Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Driedimensionale collageenmatrixsteigerimplantatie als leverregeneratiestrategie

3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62697

⸱

29 juni 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Liver, Pancreas and Motility Laboratory; Unit of Experimental Medicine; School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de Mexico (UNAM), 2Department of Surgery, School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), 3Department of Cells and Tissue Biology, School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), 4Department of Pathology, Hospital General de Mexico, 5Materials Research Institute, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

In dit artikel

Samenvatting

Leverziekten worden veroorzaakt door vele oorzaken die fibrose of cirrose bevorderen. Transplantatie is de enige optie om de gezondheid te herstellen. Gezien de schaarste aan transplanteerbare organen moeten echter alternatieven worden onderzocht. Ons onderzoek stelt de implantatie van collageensteigers in leverweefsel voor vanuit een diermodel.

Samenvatting

Leverziekten zijn wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. Overmatig alcoholgebruik, een vetrijk dieet en hepatitis C-virusinfectie bevorderen fibrose, cirrose en / of hepatocellulair carcinoom. Levertransplantatie is de klinisch aanbevolen procedure om de levensduur van patiënten in gevorderde ziektestadia te verbeteren en te verlengen. Slechts 10% van de transplantaties is echter succesvol, met orgaanbeschikbaarheid, prechirurgische en postoperatieve procedures en verhoogde kosten die direct gecorreleerd zijn met dat resultaat. Extracellulaire matrix (ECM) steigers zijn naar voren gekomen als een alternatief voor weefselherstel. Biocompatibiliteit en entacceptatie zijn de belangrijkste gunstige eigenschappen van die biomaterialen. Hoewel het vermogen om de grootte en de juiste functie van de lever te herstellen is geëvalueerd in leverhepatectomiemodellen, is het gebruik van steigers of een soort ondersteuning ter vervanging van het volume van de uitgeroeste levermassa niet beoordeeld.

Gedeeltelijke hepatectomie werd uitgevoerd in een rattenlever met de xeno-implantatie van een collageenmatrixsteiger (CMS) van een rundercondylus. Linker leverkwabweefsel werd verwijderd (ongeveer 40%) en een gelijk deel van CMS werd chirurgisch geïmplanteerd. Leverfunctietests werden geëvalueerd voor en na de chirurgische ingreep. Na dag 3, 14 en 21 werden de dieren geëuthanaseerd en werden macroscopische en histologische evaluaties uitgevoerd. Op dag 3 en 14 werd vetweefsel rond het CMS waargenomen, zonder klinisch bewijs van afstoting of infectie, net als vaatneoformatie en CMS-reabsorptie op dag 21. Er was histologisch bewijs van een onbeduidend ontstekingsproces en migratie van aangrenzende cellen naar het CMS, waargenomen met de hematoxyline en eosine (H & E) en Masson's trichrome kleuring. Het CMS bleek goed te presteren in leverweefsel en zou een nuttig alternatief kunnen zijn voor het bestuderen van weefselregeneratie en -herstel bij chronische leverziekten.

Inleiding

De lever is een van de belangrijkste organen die betrokken zijn bij het handhaven van homeostase en eiwitproductie1. Helaas is leverziekte wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak. In gevorderde stadia van leverschade, waaronder cirrose en hepatocellulair carcinoom, is levertransplantatie de klinisch aanbevolen procedure. Vanwege de schaarste aan donoren en het lage aantal succesvolle transplantaties zijn echter nieuwe technieken in tissue engineering (TE) en regeneratieve geneeskunde (RM) ontwikkeld2,3.

TE omvat het gebruik van stamcellen, steigers en groeifactoren4 om het herstel van ontstoken, fibrotische en oedemateuze organen en weefsels te bevorderen1,5,6. De biomaterialen die in steigers worden gebruikt, bootsen de inheemse ECM na en bieden de fysische, chemische en biologische aanwijzingen voor geleide cellulaire remodellering7. Collageen is een van de meest voorkomende eiwitten verkregen uit de dermis, pees, darm en pericard8,9. Bovendien kan collageen worden verkregen als een biopolymeer om twee- en driedimensionale steigers te produceren door middel van bioprinting of elektrospinning10,11. Deze groep is de eerste die het gebruik van collageen uit een botbron voor de regeneratie van leverweefsel meldt. Een andere studie meldt het gebruik van steigers gesynthetiseerd uit rundercollageen, dat werd verkregen uit de huid, met homogene en dicht bij elkaar gelegen poriën, zonder enige communicatie tussen hen12.

Decellularisatie behoudt de inheemse ECM, waardoor de daaropvolgende integratie van cellen met stamcelpotentiaal13,14mogelijk is. Deze procedure bevindt zich echter nog steeds in de experimentele fase in de lever, het hart, de nieren, de dunne darm en de urineblaas van muizen, ratten, konijnen, varkens, schapen, runderen en paarden3,14. Momenteel wordt het gereseceerde levermassavolume niet vervangen in een van de dierhepatectomiemodellen. Het gebruik van extra ondersteuning of netwerk (biomaterialen) dat celproliferatie en angiogenese mogelijk maakt, kan echter essentieel zijn voor het snelle herstel van leverparenchymale functies. Steigers kunnen dus worden gebruikt als alternatieve benaderingen om weefsel te regenereren of te herstellen bij chronische leverziekten, waardoor beperkingen als gevolg van donatie en de klinische complicaties van levertransplantatie worden geëlimineerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het huidige onderzoek werd goedgekeurd door de ethische commissie van de School of Medicine (DI/115/2015) aan de Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) en de ethische commissie van het Hospital General de Mexico (CI/314/15). De instelling voldoet aan alle technische specificaties voor de productie, verzorging en het gebruik van proefdieren en is wettelijk gecertificeerd door de nationale wetgeving (NOM-062-ZOO-1999). Mannelijke Wistar-ratten met een gewicht van 150-250 g (6-8 weken oud) werden voor deze studie verkregen van de Laboratory Animal Facility van de School of Medicine, UNAM.

1. Collageenmatrixsteigers verkrijgen uit runderdijbeen

  1. Verkrijg de condyle van runderdijbeen uit een slachthuis dat is gecertificeerd door de gezondheids- en landbouwautoriteiten van Mexico.
    1. Ontleed zorgvuldig het condylevet, de spier en het kraakbeen met een chirurgisch instrument. Snijd de condylefragmenten met een zaagsnijder in fragmenten van 3 cm x3 cm en reinig het vet en bloed met een handdoek. Was de condylefragmenten met water.
    2. Kook (92 °C) de fragmenten met 1 l anionisch des wasmiddel (10 g/L) gedurende 30 minuten. Was de condylefragmenten tweemaal om eventuele resten van het anionische reinigingsmiddel te verwijderen.
    3. Droog de condylefragmenten gedurende 3 uur met filtreerpapier (0,5 mm).
  2. Bereid een driehoekig (1 cm x 1 cm x1 cm) CMS van dikte 0,5 cm uit de fragmenten vermeld in stap 1.1 (Figuur 1A).
    1. Demineraliseer de fragmenten in 100 ml van 0,5 M HCl gedurende 10 minuten met constante agitatie. Verwijder de HCl.
      OPMERKING: Neutraliseer de HCl met natriumhydroxide (10 M).
    2. Spoel de fragmenten drie keer met 100 ml gedestilleerd water, telkens 15 minuten, met constante agitatie. Droog het CMS met filtreerpapier (0,5 mm) gedurende 1 uur.
    3. Gebruik een stereomicroscoop15 om de structurele eigenschappen van het CMS te analyseren (grootte van de poriën, porievorming en poreuze interconnectie) (Figuur 1B).
    4. Gebruik een scanning elektronenmicroscoop16 om het ruwe oppervlak van de CMS trabeculae te analyseren(Figuur 1C).
    5. Gebruik het dissectie-instrument voor mengen en uitrekken om de mechanische veranderingen (plasticiteit en flexibiliteit) van het CMS te evalueren(figuur 1D).
    6. Verpak het CMS in het sterilisatiezakje en steriliseer het gedurende 38 minuten met waterstofperoxideplasma. Bewaar het steriele CMS in de originele verpakking in een droge ruimte bij 20-25 °C tot gebruik.

2. Voorbereiding van het operatiegebied en behandeling en voorbereiding van het diermodel

  1. Ontsmet het operatiegebied, de werktafel, de microchirurgische microscoop en de zitting met 2% chloorhexidine-oplossing. Steriliseer alle chirurgische instrumenten, chirurgische spons, wattenstaafjes en wegwerpchirurgisch gordijn door middel van warmtesterilisatie (121 °C/30 min/100 kPa)
  2. Wijs de ratten (n= 5) toe aan drie groepen van vijf ratten per groep: 1. sham, 2. hepatectomie en 3. hepatectomie plus CMS, en volg alle groepen op dag 3, 14 en 21 dagen.
    1. Dien ketamine (35 mg/kg) en xylazine (2,5 mg/kg) intramusculair toe in de achterpoot.
      OPMERKING: De kalmerende periode duurt meestal 30-40 minuten.
    2. Scheer de buikhuid (5 cm x 2 cm) met chirurgische zeep en een tweesnijdend mes en desinfecteer de huid met actuele 10% povidon-jodiumoplossing in drie rondes17.
    3. Plaats het dier op een warme plaat in de dorsale positie van de decubitus, met de nek hyperextended om een doorlaatbare luchtweg te behouden (figuur 2).
    4. Evalueer de diepte van de anesthesie door het ademhalingspatroon en het verlies van de ontwenningsreflex in de ledematen.
    5. Plaats een wegwerpchirurgisch gordijn rond de geschoren huid en maak een incisie (2,5 cm) op de albeuze lijn met een scalpel, met het xiphoid-proces als referentiepunt. Vermijd het bloedvat van de buikwand om bloedingen te voorkomen.
    6. Plaats de abdominale retractor op zijn plaats en observeer de buikholte. Gebruik de dissectie-tang om de linker leverkwab te extraheren en op de metalen plaat te plaatsen(figuur 3A).
      OPMERKING: In de schijngroep, extraheer alleen de linker leverkwab en breng de lever vervolgens terug naar de buikholte. Hecht de buikwand en huid met een 3-0 nylon hechting.
    7. Gebruik in de experimentele groepen met en zonder CMS een scalpelmes en steriel scalpelmes (# 15) om hepatectomie (ongeveer 40%) uit te voeren met twee sneden. Gebruik een driehoekige metalen sjabloon (1 cm x 1 cm x 1 cm) om de hepatectomie uit te voeren(figuur 3B).
    8. Om bloedingen van de lever te voorkomen, handhaaft u de chirurgische compressie met een wattenstaafje aan de rand van de lever gedurende 5 minuten.
    9. Hydrateer het CMS in steriele zoutoplossing gedurende 20 minuten vóór de chirurgische ingreep. Implanteer het CMS op de hepatectomieplaats met vier hechtingen tussen het leverweefsel en het CMS om verplaatsing van het biomateriaal te voorkomen. Gebruik 7-0 niet-absorbeerbare polypropyleen hechtingen(figuur 3C).
      OPMERKING: Verwijder de hechtingen niet bij een tweede operatie; hechtingen kunnen worden gebruikt als referentie om de plaats van CMS-implantatie te identificeren.
    10. Breng de lever terug naar de buikholte en hecht de buikwand en de huid met een 3-0 nylon hechting. Reinig de chirurgische incisie met een chirurgische jodium-gedrenkte spons in twee rondes. Observeer en bewaak de vitale functies van de dieren.

3. Postoperatieve zorg

  1. Dien meglumine flunixine (2,5 mg/kg) intramusculair toe in de achterpoot. Analgetica toedienen zoals goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierverzorging en -gebruik.
  2. Voor anesthesieherstel plaatst u de dieren in individuele polycarbonaatdozen met laboratoriumdierstrooisel in een geruisvrije ruimte met temperatuurregeling (23 °C).
  3. Observeer het herstel van de dieren en controleer hun water- en voedselconsumptie gedurende 2 uur. Bewaak dieren postoperatief zoals goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierverzorging en -gebruik.

4. Evaluatie van de leverfunctie in serum

  1. Verzamel bloedmonsters (500 μL) van de laterale staartaderen van de verdoofde dieren vóór de chirurgische ingreep (uitgangswaarden) en op evaluatiedagen 3, 14 en 21.
  2. Centrifugeer de bloedmonsters bij 850 × g/10 min bij kamertemperatuur (23 °C); scheid het serum en bewaar het bij -80°C tot gebruik.
  3. Voer een panel van leverfunctietests uit: serumalbumine (ALB), alkalische fosfatase (ALP), alanineaminotransferase (ALAT), aspartaataminotransferase (ASAT), totaal bilirubine (TB) en direct bilirubine (DB) (tabel 1).

5. Euthanasie en weefselmanagement

  1. Verdoof de dieren voor elke evaluatie (dag 3, 14 en 21) door het hierboven beschreven protocol te volgen.
  2. Euthanaseer via methoden die zijn goedgekeurd door de institutionele commissie voor dierverzorging en -gebruik.
  3. Voer een incisie (5-6 cm) uit op de albeuze lijn met een scalpel om de organen van de buikholte te observeren en foto's te maken van het hepatectomiegebied van de sham en de experimentele groepen, met en zonder het CMS.
  4. Neem levermonsters (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) van alle dieren in de onderzoeksgroep en plaats ze gedurende 24 uur in een 4% formaldehyde-oplossing voor daaropvolgende histologische evaluatie.

6. Histologische analyse

  1. Bewaar de leverweefsels in 4% formaldehyde en droger het weefsel uit met behulp van een reeks alcoholconcentraties (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); plaats ze in xyleen (1 uur) en ingebed ze in paraffine16.
  2. Snijd de paraffineblokken met een microtoom in 4 μm dikke secties voor de voorbereiding van acht dia's.
  3. Voer H&E en Masson's trichrome kleuringuit 16.
  4. Observeer de gekleurde secties onder een lichtmicroscoop om de representatieve gebieden van de lever te selecteren, met en zonder CMS. Verkrijg fotomicrografen met een vergroting van 4x, 10x en 40x en verwerk de afbeeldingen met behulp van de juiste software18 (zie de tabel met materialen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Botdemineralisatie beïnvloedt de mechanische eigenschappen van CMS zonder de oorspronkelijke vorm of interconnectie van de poriën te veranderen. CMS kan elke vorm hebben en kan daarom worden aangepast aan de grootte en vorm van het geselecteerde orgaan of weefsel19. In het huidige protocol gebruikten we een driehoekig CMS (Figuur 1A-D). Een rattenmodel werd gebruikt om het regeneratieve vermogen van de CMS-xeno-impla...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Orgaantransplantatie is de steunpilaar van de behandeling bij patiënten met leverfibrose of cirrose. Enkele patiënten hebben baat bij deze procedure, waardoor het noodzakelijk is om therapeutische alternatieven te bieden voor patiënten op de wachtlijst. Tissue engineering is een veelbelovende strategie die gebruik maakt van steigers en cellen met regeneratief potentieel2,4,13. Het verwijderen van een deel van de lever is een kri...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben. Benjamín León-Mancilla is een doctoraatsstudent van het Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) en hij ontving dgapa-unam fellowship.

Dankbetuigingen

De auteurs willen het personeel van de Laboratory Animal Facility van de Experimental Medicine Unit, verpleegster Carolina Baños G. voor technische en chirurgische ondersteuning, Marco E. Gudiño Z. voor ondersteuning bij microfotografen en Erick Apo voor ondersteuning in lever histologie bedanken. De Nationale Raad ondersteunde dit onderzoek voor Wetenschap en Technologie(CONACyT),subsidienummer SALUD-2016-272579 en de PAPIIT-UNAM TA200515.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anodisch wasmiddelAlconoxZ273228
Biopsie cassettesLeica3802453
Camera DMXNikonDXM1200F
CentrifugeEppendorf5424
Chlorhexidine gluconate 4%BD372412
Dekglasjes 25 mm x 40 mmCorning2980-224
EosineSigma-Aldrich200-MCAS 17372-87-1
Ethyl alcohol, puurSigma-Aldrich459836CAS 64-17-5
Flunixine meglumideMSDQ-0273-035
Glijbanen 75 mm x 25 mmCorning101081022
HematoxylinenMerckH9627CAS 571-28-2
Zoutzuur 37%Merck339253CAS 7647-01-0
KetaminePisa agropecuariaQ-7833-028
LichtmicroscoopNikonMicrophoto-FXA
Microchirurgie stereomicroscoopZeissOPMI F170
Microtainer gele capeBeckton Dickinson365967
MicrotomeLeicaRM2125
Modeldier: Wistar rattenUniversidad Nacional Autónoma de México
Nylon 3-0 (Dermalon)Covidien1750-41
Polypropyleen 7-0AtramatSE867/2-60
Povidon-jodium10% cutane oplossingDiafra SA de CV1.37E+86
Scanning elektronenmicroscoopZeissDSM-950
Natriumhydroxide, pelletsJ. T. Baker3722-01CAS 1310-73-2
Software ACT-1NikonVer 2.70
StereomicroscoopLeicaEZ4Stereo 8X-35X
Sterrad 100SJohnson and Johnson99970
Surgipath paraplastLeica39601006
Spuit van 1 mL met naald (27G x 13 mm)SensiMedicalLAN-078-077
Weefselprocessor (Histokinette)LeicaTP1020
Tissue-Tek TEC 5 (Weefsel inbedder)Sakura Finetek USA5229
Trichrome kleurkitSigma-AldrichHT15
Unicell DxC600 AnalyzerBeckman CoulterBC 200-10
XylazinePisa agropecuariaQ-7833-099
XYleenSigma-Aldrich534056CAS 1330-20-7

Referenties

  1. Li, N., Hua, J. Immune cells in liver regeneration. Oncotarget. 8 (2), 3628-3639 (2017).
  2. Langer, R., Vacanti, J. Tissue Engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
  3. Lee, H., et al. Development of liver decellularized extracellular matrix bioink for three-dimensional cell printing-based liver tissue engineering. Biomacromolecules. 18 (4), 1229-1237 (2017).
  4. Shafiee, A., Atla, A. Tissue engineering: Toward a new era of medicine. Annual Review of Medicine. 68, 29-40 (2017).
  5. Hu, C., Zhao, L., Wu, Z., Li, L. Transplantation of mesenchymal stem cells and their derivatives effectively promotes liver regeneration to attenuate acetaminophen-induced liver injury. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 88(2020).
  6. Sancho-Bru, P. Therapeutic possibilities of stem cells in the treatment of liver diseases. Gastroenterologia y Hepatologia. 34 (10), 701-710 (2011).
  7. Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
  8. Freedman, B. R., Mooney, D. J. Biomaterials to mimic and heal connective tissues. Advanced Materials. 31 (19), 1806695(2019).
  9. Meyer, M. Processing of collagen based biomaterials and the resulting materials properties. Biomedical Engineering Online. 18 (1), 24(2019).
  10. El Baz, H., et al. Transplant of hepatocytes, undifferentiated mesenchymal stem cells, and in vitro hepatocyte-differentiated mesenchymal stem cells in a chronic lver failure experimental model: a comparative study. Experimental and Clinical Transplantation. 16 (1), 81-89 (2018).
  11. Nedjari, S., Awaja, F., Guarino, R., Gugutkov, D., Altankov, G. Establishing multiple osteogenic differentiation pathways of mesenchymal stem cells through different scaffold configurations. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (10), 1428-1437 (2020).
  12. Chan, E. C., et al. Three dimensional collagen scaffold promotes intrinsic vascularisation for tissue engineering applications. PLoS One. 11 (2), 0149799(2016).
  13. Arenas-Herrera, J. E., Ko, I. K., Atala, A., Yoo, J. J. Decellularization for whole organ bioengineering. Biomedical Materials. 8 (1), 014106(2013).
  14. Parmaksiz, M., Dogan, A., Odabas, S., Elçin, A. E., Elçin, Y. M. Clinical applications of decellularized extracellular matrices for tissue engineering and regenerative medicine. Biomedical Materials. 11 (2), 022003(2016).
  15. Gacek, G. Stereo microscope, neglected tool. Postepy Biochemii. 63 (1), 68-73 (2017).
  16. Oldham, S., Rivera, C., Boland, M. L., Trevaskis, J. L. Incorporation of a survivable liver biopsy procedure in mice to assess non-alcoholic steatohepatitis (NASH) resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (146), e59130(2019).
  17. The University of Texas at Austin Institutional Animal Care and Use Committee. Guidelines for the Use of Chemical Depilatory Agents on Laboratory Animals. , https://research.utexas.edu (2021).
  18. Sivridis, L., Kotini, A., Anninos, P. The process of learning in neural net models with Poisson and Gauss connectivities. Neural Networks. 21 (1), 28-35 (2008).
  19. León-Mancilla, B. H., Araiza-Téllez, M. A., Flores-Flores, J. O., Piña-Barba, M. C. Physico-chemical characterization of collagen scaffolds for tissue engineering. Journal of Applied Research and Technology. 14 (1), 77-85 (2016).
  20. León, A., et al. Hematological and biochemical parameters in Sprague Dawley laboratory rats breed in CENPALAB, Cenp:SPRD. Revista Electronica de Veterinaria. 12, 1-10 (2011).
  21. Tsuchiya, A., et al. Mesenchymal stem cell therapies for liver cirrhosis: MSCs as "conducting cells" for improvement of liver fibrosis and regeneration. Inflammation and Regeneration. 39, 18(2019).
  22. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
  23. Acevedo, G. C. Xenoimplante de colágena en uretra de perro. Universidad Nacional Autónoma de México. , Specialty of Urology thesis (2011).
  24. Montalvo-Jave, E. E., et al. Absorbable bioprosthesis for the treatment of bile duct injury in an experimental model. International Journal of Surgery. 20, 163-169 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Tissue engineeringparti le hepatectomieextracellulaire matrix steigerleverfibrosemodelhepatocytmigratiechronische leverziektehistologische analyse
Driedimensionale collageenmatrixsteigerimplantatie als leverregeneratiestrategie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.