Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Planaire ovariumdissectie voor ultrastructurele analyse en kleuring van antilichamen

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62713

⸱

10 september 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Howard Hughes Medical Institute, 3Department of Human Genetics, University of California Los Angeles

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert de stappen die zijn genomen om de eierstokken in de zoetwaterplanariërs, Schmidtea mediterranea, te ontleden.De ontlede eierstokken zijn compatibel voor immunokleuring van antilichamen en ultrastructurele analyse met transmissie-elektronenmicroscopie om de celbiologie van de eicellen en somatische cellen te bestuderen, waardoor een beeldvormingsdiepte en -kwaliteit worden geboden die voorheen ontoegankelijk waren.

Samenvatting

Toegankelijkheid tot kiemcellen maakt de studie van de ontwikkeling van kiemcellen, meiose en recombinatie mogelijk. Het seksuele biotype van de zoetwaterplanariër, Schmidtea mediterranea, is een krachtig ongewerveld model om de epigenetische specificatie van geslachtscellen te bestuderen. In tegenstelling tot het grote aantal testis en mannelijke geslachtscellen, zijn planarische eicellen relatief moeilijk te lokaliseren en te onderzoeken, omdat er slechts twee eierstokken zijn, elk met 5-20 eicellen. Diepere lokalisatie in het planaire lichaam en het ontbreken van beschermende epitheelweefsels maken het ook een uitdaging om planarische eierstokken direct te ontleden.

Dit protocol maakt gebruik van een korte fixatiestap om de lokalisatie en dissectie van planaire eierstokken voor stroomafwaartse analyse te vergemakkelijken om deze moeilijkheden te overwinnen. De ontlede eierstok is compatibel voor ultrastructureel onderzoek door middel van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) en immunokleuring van antilichamen. De dissectietechniek die in dit protocol wordt beschreven, maakt ook experimenten met genverstoring mogelijk, waarbij de eierstokken worden onderzocht onder verschillende RNA-interferentie (RNAi) -omstandigheden. Directe toegang tot de intacte kiemcellen in de eierstok die door dit protocol wordt bereikt, zal de beeldvormingsdiepte en -kwaliteit aanzienlijk verbeteren en cellulaire en subcellulaire ondervraging van de eicelbiologie mogelijk maken.

Inleiding

De anatomie van de planaria is onderzocht met behulp van TEM in veel weefsels 1,2,3,4,5,6. Er is echter weinig aandacht besteed aan eierstokken of eicellen. Het gebrek aan literatuur over eicellen is deels te wijten aan de moeilijkheid om toegang te krijgen tot deze cellen, waardoor de biologie van planaire eicellen grotendeels onontgonnen blijft. Moleculaire hulpmiddelen hebben veel regulerende mechanismen van de ontwikkeling van de eierstokken bij de planariërs blootgelegd met behulp van licht- of fluorescentiemicroscopie 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 . Al deze experimenten werden uitgevoerd op hele wormen of histologische secties van hele wormen. De protocollen voor antilichaamkleuring en in situ hybridisatie op hele wormen omvatten uitgebreide stappen voor bleken, wassen en weefselverwijdering, die tijdrovend zijn en enkele dagen zullen duren.

Het algemene doel van de hier beschreven methode is om toegang te bieden tot intacte, ontlede planaire eierstokken en eicellen, waardoor bleken of histologische secties niet meer nodig zijn en de tijd voor wassen en weefselopruiming bij antilichaamkleuring en in situ hybridisatie wordt verkort.De ontlede eierstokken zullen ook de penetratie van sonde of antilichamen verbeteren en de beelddiepte en -kwaliteit voor licht- en elektronenmicroscopen vergroten. Toegankelijkheid tot de ontlede eierstokken en eicellen maakt celbiologisch onderzoek mogelijk met cellulaire en subcellulaire resolutie met hele intacte eicellen. Een recente studie over ontlede planaire eierstokken karakteriseerde planarische eicelmeiose voor het eerst met TEM en confocale microscopie21. Het werk gaf een uitgebreide beschrijving van een nieuw fenomeen tijdens meiose dat nucleaire envelopvesiculatie wordt genoemd.

Hier presenteren we de gedetailleerde procedures bij de dissectie van planaire eierstokken. Een fixatiestap was voldoende om de eierstokcelstructuur te behouden voor dissectie en stroomafwaartse manipulatie (d.w.z. verwerking voor TEM en lichtmicroscoopanalyse). Gezien hun gelijkenis in lichaamsplannen en weefselarchitectuur, zou dit protocol ook in grote lijnen informatief moeten zijn voor het bestuderen van eicellen en hun kernen in verschillende andere Platyhelminthes-soorten (bijv. het geslacht Dugesia of Polycelis). Dit protocol is waarschijnlijk niet relevant voor Macrostomum lignano vanwege hun kleine afmetingen en bijna transparante lichaamsarchitectuur, die directe observatie van de eierstok en eicellen mogelijk maakt 22,23,24. Het lichaamsgebied dat de eierstokken bevat, is bij sommige soorten (bijv. Dugesia ryukyuensis 9,25) optisch beter te onderscheiden (bijv. donkerder gepigmenteerd of lichter gepigmenteerd) dan S. mediterranea. Studies bij deze soorten kunnen minder vertrouwen op de hier gepresenteerde richtlijnen voor het lokaliseren van de eierstokken in S. mediterranea, maar profiteren van de fixatie- en dissectieomstandigheden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding

  1. Bereid wormen voor: voer seksuele planariërs twee keer per week met biologische leverpasta om geslachtsrijpheid te bereiken.
    OPMERKING: Over het algemeen zijn dergelijke wormen groter dan 1 cm lang en hebben ze een gonopore achter de keelholte-opening.
  2. Bereid oplossingen voor.
    1. Bereid de volgende reagentia voor: 16% paraformaldehyde (PFA); 50% glutaaraldehyde (GA) waterige oplossing; N-acetyl-L-cysteïne (NAC); 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 en 2 mM KH2PO4.
    2. Verdun 50% GA en 16% PFA met PBS tot een eindmengsel van 2,5% GA en 2% PFA. Verdun 16% PFA met PBS tot een eindconcentratie van 4% PFA.
    3. Los 5 g NAC op in 100 ml PBS om een werkende oplossing van 5% te maken.

2. Eierstokken verzamelen

  1. Behandel geslachtsrijpe wormen met 5% NAC in een schaaltje bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    OPMERKING: Grote wormen kunnen zich opkrullen. Borstels of pipetpunten kunnen worden gebruikt om de wormen plat te maken. De gebruikte hoeveelheid van 5% NAC is minimaal, genoeg om het oppervlak van de petrischaal te bedekken.
  2. Vervang NAC door 10 ml vers bereide 4% paraformaldehyde en fixeer de wormen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met af en toe schudden. Begin de dissectie 10 minuten na de toevoeging van 4% PFA en voer de dissectie uit in 4% PFA terwijl de wormen worden gefixeerd.
  3. Observeer de epitheliale pigmentatie om de ventrale zenuwkoorden te lokaliseren, die verschijnen als twee lijnen met lichtere pigmentatie die lopen van de voorste cephalische ganglia naar de staart.
  4. Zoek de eierstokken.
    OPMERKING: De eierstok bevindt zich direct naast het zenuwkoord aan de mediale zijde (Figuur 1A). Vertrouw op epitheelpigmentatie om de positie van de eierstok in de voorste-posterieure richting te bepalen. Idealiter is de pigmentatie van het ventrale epitheel in het eierstokgebied lichter dan de omliggende regio's. Bij sommige wormen geeft de pigmentatie van het ventrale epitheel niet genoeg vertrouwen. Deze wormen kunnen worden weggegooid omdat sommige mogelijk geen goed ontwikkelde eierstokken hebben.
  5. Valideer de posities van de eierstokken zodra de vermeende eierstokken zijn gelokaliseerd door pigmentatie.
    OPMERKING: Ten eerste bevinden de eierstokken zich achter de cephalische ganglia. Ten tweede bevinden donkergekleurde teelballen zich lateraal van het dorsale oppervlak boven de eierstok. Eierstokken bevinden zich voor de meest voorste testis (Figuur 1B). Soms bevinden de testiskwabben zich ter hoogte van of iets voor de eierstokken.
  6. Gebruik twee chirurgische messen om de achterste en voorste van de twee eierstokken door te snijden (Figuur 1C) om de voorste en achterste wormfragmenten volledig te verwijderen. Gebruik één mes om de worm te verankeren en maak het andere mes schoon dat wordt gebruikt om de sneden te maken.
  7. Snijd in de middelste lijn van het eierstokfragment om de twee eierstokken te scheiden. Draai het fragment om zodat het met de buikkant naar beneden ligt.
  8. Trek het dorsale weefsel af om de darm bloot te leggen (Figuur 1D) met twee puntige pincetten (type 5-SA).
    OPMERKING: De koepelvormige eierstok bevindt zich onder de darmtakken.
  9. Verwijder voorzichtig de darmtakken die boven de ventrale weefsels zitten met de punt van het pincet of een zachte borstel om de eierstok bloot te leggen (Figuur 1E).
  10. Verwijder de omliggende weefsels om de eierstok te verwijderen (Figuur 1F,G).
  11. Haal de eierstokken eruit en doe ze in een tube van 1,5 ml om te wassen met 1 ml PBS.

3. Fixatie voor TEM

  1. Was de eierstokken in PBS gedurende 10 minuten met zacht schudden. Houd de buisjes rechtop en laat de eierstokken door de zwaartekracht naar de bodem zinken. Herhaal de wasbeurt een keer.
    OPMERKING: Als de eierstokken niet zinken, centrifugeer dan gedurende 15 s zachtjes met een mini-tafelcentrifuge (maximale snelheid 2000 × g).
  2. Vervang de PBS door 2% PFA/2,5% GA/PBS.
  3. Fixeer de monsters gedurende 1 uur op kamertemperatuur op een shaker bij 40 rpm.
  4. Bewaar de monsters in fixeermiddel een nacht bij 4 °C op een shaker bij 40 rpm.

4. Steekproefverwerking voor TEM

  1. Was de eierstokken in PBS 3 keer gedurende 10 minuten elk.
  2. Was de eierstokken in dubbel gedestilleerd water (ddH2O) 3 keer gedurende 10 minuten elk.
  3. Fixeer de eierstokken na 1-2 uur in 2% waterig OsO4 bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
    OPMERKING: De monsterhouders moeten tijdens deze stap worden verzegeld met parafilm. Bereid 2% OsO4 voor met omgekeerde osmose behandeld water (zie de materiaaltabel).
  4. Spoel de monsters met ddH2O 3 keer, elk 10 minuten.
  5. Kleuring de eierstokken 's nachts bij 4 °C in 2% waterig uranylacetaat (UA).
    NOTITIE: De UA-oplossing moet voor gebruik worden gefilterd; Vermijd licht tijdens de en bloc kleuring. Bereid 2% OsO4 voor met omgekeerde osmose behandeld water (zie de materiaaltabel).
  6. Spoel de monsters in ddH2Ö 4 keer met zachte beweging, elk 10 min.
  7. Dehydrateer de eierstokken in een gesorteerde ethanolreeks (30%, 50%, 70%, 95% en twee keer 100%, 10 minuten per oplossing) en verdeel ze vervolgens in twee incubaties (10 min) in propyleenoxide.
  8. Voor infiltratie met hars moeten de monsters een nacht bij 4 °C in een mengsel van 50% propyleenoxide en 50% vloeibare epoxyhars worden geïncubeerd. Infiltreer de monsters met 100% epoxyhars met 3 veranderingen (1 uur elke verandering) met zachte agitatie.
  9. Veranker de eierstokken in 100% epoxyhars en polymeriseer de hars bij 60 °C gedurende 48 uur.

5. Ultramicrotomie

  1. Blok bijsnijden en monstercontrole met een lichtmicroscoop
    1. Snijd de monsterblokken met een scheermesje in een piramidevorm.
    2. Snijd secties van 1-2 μm dikte met een glas- of diamantmes.
    3. Breng de secties over op een dia met een druppel water en verwarm de dia vervolgens op een hete plaat totdat de secties plat worden en zich tijdens waterverdamping aan het diaoppervlak hechten.
    4. Bedek de secties met een druppel 1% toluïdine blauw O en verwarm ze op een hete plaat gedurende ~10 s. Spoel het glaasje af met stromend water en laat het drogen. Controleer de secties onder een gewone lichtmicroscoop.
  2. Ultradunne secties snijden, verzamelen en nakleuren.
    1. Snijd ultradunne secties van 50-70 nm dikte met een diamantmes. Breng de secties van de meswaterboot over op gaas of koperen roosters met één sleuf.
    2. Kleur de secties in 2% RE gedurende 8 min. Was de roosters in lopende ddH2O gedurende 30 s.
    3. Kleurs de secties met 1% loodoplossing gedurende 6 minuten. Was de secties in lopende ddH2O gedurende 1 minuut en laat ze aan de lucht drogen.

6. Gegevensverzameling en -analyse

  1. Verzamel TEM-gegevens met behulp van geschikte software, bijv. Digitale Micrograaf (zie de Materiaaltabel voor meer details).
  2. Gebruik de richtkijker op 80 kV. Plaats het monsterrooster in de scoop wanneer het vacuüm klaar is.
  3. Schakel de straal in door in het menu op Licht te klikken. Draai aan de intensiteitsknop op het linkerbedieningspaneel totdat de automatische belichtingstijd ~1 s is. Klik op Start Acquire om een definitieve afbeelding te krijgen.
  4. Bouw driedimensionale EM-modellen met behulp van het open-source IMOD-pakket (Image Processing, Modeling and Display).

7. Kleuring van antilichamen

  1. Was de ontlede eierstokken (stap 2.16) in een 1,5 ml microfuge tube met 1 ml 1x PBS aangevuld met 0,5% Triton X-100 (PBST). Plaats de buizen op een schudder om gedurende 10 minuten op 40 tpm te roeren. Laat de buisjes in een rek staan en de eierstokken zinken door de zwaartekracht. Vervang de was door verse PBST en herhaal dit twee keer.
  2. Verteer de weefsels met 2 μg/ml proteïnase K en 0,1% natriumdodecylsulfaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in PBST.
  3. Was de verteerde eierstokken in PBST drie keer gedurende 10 minuten per wasbeurt.
  4. Incubeer de eierstokken met 10% paardenserum in PBST gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  5. Verdun primaire antilichamen 1 tot 100 in de blokkerende oplossing (10% paardenserum in PBS met 0,5% Triton X-100). Incubeer de eierstokken met primaire antilichamen 's nachts bij 4 °C met zacht schudden.
  6. Was de eierstokken in PBST drie keer gedurende 10 minuten per wasbeurt.
  7. Incubeer de eierstokken met secundaire antilichamen 's nachts bij 4 °C met zacht schudden. Verdun alle secundaire antilichamen 1:300 in de blokkerende oplossing.
  8. Was de eierstokken drie keer in PBST en zorg ervoor dat de eerste en derde wasbeurt 10 minuten duren. Kleuring van de eierstokkernen met Hoechst 33342 in verdunning 1:300 in PBST gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in de tweede wasbeurt.
  9. Monteer de eierstokken op objectglaasjes.
    OPMERKING: Anti-fading mountant kan worden gebruikt om de fluorescentiesignalen te verlengen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De hier gepresenteerde methode is beschreven door Guo et al.21. De sleutel tot succesvolle dissectie is het correct identificeren van de pigmentatie en positiegeleiders van de eierstok. De strategie van de methode is om van brede posities naar een specifieke locatie te gaan. Om dit te bereiken, moet u eerst vertrouwen op dorsale en ventrale pigmentatiepatronen (Figuur 1A,B). Ventrale pigmentatie, waar de eierstokken z...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze op fixatie gebaseerde procedures voor het ontleden van planaire eierstokken zullen het begrip van de meiose van eicellen en de ontwikkeling en regeneratie van de eierstokken vergemakkelijken. De grootte van de eicellen en hun somatische ondersteunende cellen kan variëren van 20 μm tot 50 μm. Op dissectie gebaseerde methoden bieden toegang tot intacte cellen van één eierstok die niet kunnen worden bereikt met doorsnede of op volledige montage gebaseerde methoden. Dit protocol zal de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Het werk werd ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute (LK en ASA) en de Helen Hay Whitney Foundation (LHG).

De originele gegevens die aan dit manuscript ten grondslag liggen, zijn toegankelijk via de Stowers Original Data Repository op http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
16% paraformaldehydeElectron Microscopy Sciences15710EM grade
2% aqueous OsO4Electron Microscopy Sciences19152
50% glutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16320EM grade
Digital MicrographGatan Inc.Versie 2.33.97.1, TEM data verzameling
Epon harsElectron Microscopy Sciences14120Embed 812 Kit, vloeibaar, epoxy hars
EthanolTed Pella19207Gedenatureerd
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Paarden serumSigmaH1138
Lead AcetateElectron Microscopy Sciences6080564
MilliQ wateromkeerbaar-osmose behandeld water
N-Acetyl-L-cysteïneSigmaA7250
ParafilmsigmaP7793
Prolong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36965
PropyleenoxideElectron Microscopy Sciences75569EM grade
 Proteinase KThermo Fisher Scientific25530049
Toluidine blauw OElectron Microscopy Sciences92319
Transmissie-elektronenmicroscoopFEITecnai G2 Spirit BioTWIN
Uranyl acetaatElectron Microscopy Sciences541093

Referenties

  1. Brubacher, J. L., Vieira, A. P., Newmark, P. A. Preparation of the planarian Schmidtea mediterranea for high-resolution histology and transmission electron microscopy. Nature Protocols. 9 (3), 661-673 (2014).
  2. Carpenter, K. S., Morita, M., Best, J. B. Ultrastructure of the photoreceptor of the planarian Dugesia dorotocephala. I. Normal eye. Cell Tissue Research. 148 (2), 143-158 (1974).
  3. Ishii, S. The ultrastructure of the protonephridial flame cell of the freshwater planarian Bdellocephala brunnea. Cell Tissue Research. 206 (3), 441-449 (1980).
  4. Morita, M., Best, J. B., Noel, J. Electron microscopic studies of planarian regeneration: I. Fine structure of neoblasts in Dugesia dorotocephala. Journal of Ultrastructure Research. 27 (1), 7-23 (1969).
  5. Hyman, L. H. The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. 2, 550(1951).
  6. Higuchi, S., et al. Characterization and categorization of fluorescence activated cell sorted planarian stem cells by ultrastructural analysis. Development, Growth & Differentiation. 49 (7), 571-581 (2007).
  7. Chong, T., Stary, J. M., Wang, Y., Newmark, P. A. Molecular markers to characterize the hermaphroditic reproductive system of the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 11, 69(2011).
  8. Handberg-Thorsager, M., Salo, E. The planarian nanos-like gene Smednos is expressed in germline and eye precursor cells during development and regeneration. Development Genes and Evolution. 217 (5), 403-411 (2007).
  9. Kobayashi, K., et al. The identification of D-tryptophan as a bioactive substance for postembryonic ovarian development in the planarian Dugesia ryukyuensis. Scientific Reports. 7, 45175(2017).
  10. Maezawa, T., et al. Planarian D-amino acid oxidase is involved in ovarian development during sexual induction. Mechanisms of Development. 132, 69-78 (2014).
  11. Rouhana, L., Tasaki, J., Saberi, A., Newmark, P. A. Genetic dissection of the planarian reproductive system through characterization of Schmidtea mediterranea CPEB homologs. Developmental Biology. 426 (1), 43-55 (2017).
  12. Sato, K., et al. Identification and origin of the germline stem cells as revealed by the expression of nanos-related gene in planarians. Development, Growth & Differentiation. 48 (9), 615-628 (2006).
  13. Tharp, M. E., Collins, J. J., Newmark, P. A. A lophotrochozoan-specific nuclear hormone receptor is required for reproductive system development in the planarian. Developmental Biology. 396 (1), 150-157 (2014).
  14. Wang, Y., Zayas, R. M., Guo, T., Newmark, P. A. nanos function is essential for development and regeneration of planarian germ cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5901-5906 (2007).
  15. Zhang, S., et al. A nuclear hormone receptor and lipid metabolism axis are required for the maintenance and regeneration of reproductive organs. bioRxiv. , 279364(2018).
  16. Saberi, A., Jamal, A., Beets, I., Schoofs, L., Newmark, P. A. GPCRs direct germline development and somatic gonad function in planarians. PLoS Biology. 14, 1002457(2016).
  17. Steiner, J. K., Tasaki, J., Rouhana, L. Germline defects caused by Smed-boule RNA-interference reveal that egg capsule deposition occurs independently of fertilization, ovulation, mating, or the presence of gametes in planarian flatworms. PLoS Genetics. 12, 1006030(2016).
  18. Iyer, H., Issigonis, M., Sharma, P. P., Extavour, C. G., Newmark, P. A. A premeiotic function for boule in the planarian Schmidtea mediterranea. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (25), 3509-3518 (2016).
  19. Rouhana, L., Vieira, A. P., Roberts-Galbraith, R. H., Newmark, P. A. PRMT5 and the role of symmetrical dimethylarginine in chromatoid bodies of planarian stem cells. Development. 139 (6), 1083-1094 (2012).
  20. Wang, Y., Stary, J. M., Wilhelm, J. E., Newmark, P. A. A functional genomic screen in planarians identifies novel regulators of germ cell development. Genes & Development. 24 (18), 2081-2092 (2010).
  21. Guo, L., et al. Subcellular analyses of planarian meiosis implicates a novel, double-membraned vesiculation process in nuclear envelope breakdown. bioRxiv. , 620609(2019).
  22. Grudniewska, M., et al. Transcriptional signatures of somatic neoblasts and germline cells in Macrostomum lignano. Elife. 5, 20607(2016).
  23. Wudarski, J., et al. The free-living flatworm Macrostomum lignano. Evodevo. 11, 5(2020).
  24. Wudarski, J., et al. Efficient transgenesis and annotated genome sequence of the regenerative flatworm model Macrostomum lignano. Nature Communications. 8 (1), 2120(2017).
  25. Maezawa, T., Sekii, K., Ishikawa, M., Okamoto, H., Kobayashi, K. Reproductive and Developmental Strategies: The Continuity of Life. Kobayashi, K., Kitano, T., Iwao, Y., Kondo, M. , Springer. Japan, Tokyo. 175-201 (2018).
  26. Newmark, P. A., Reddien, P. W., Cebria, F., Sanchez Alvarado, A. Ingestion of bacterially expressed double-stranded RNA inhibits gene expression in planarians. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11861-11865 (2003).
  27. Orii, H., Mochii, M., Watanabe, K. A simple "soaking method" for RNA interference in the planarian Dugesia japonica. Development Genes and Evolution. 213 (3), 138-141 (2003).
  28. Rouhana, L., et al. RNA interference by feeding in vitro-synthesized double-stranded RNA to planarians: methodology and dynamics. Developmental Dynamics. 242 (6), 718-730 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Oocytbiologietransmissie elektronenmicroscopieRNA interferentiekiemcelontwikkelingimmunofluorescentiekleuringSchmidtea mediterraneakiemcellokalisatie
Planaire ovariumdissectie voor ultrastructurele analyse en kleuring van antilichamen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.