Primaire weefsels verkregen van patiënten na totale knieartroplastiek bieden een experimenteel model voor artroseonderzoek met maximale klinische vertaalbaarheid. Dit protocol beschrijft hoe RNA uit zeven unieke knieweefsels kan worden geïdentificeerd, verwerkt en geïsoleerd om mechanistisch onderzoek bij menselijke artrose te ondersteunen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Weefselverzameling en RNA-extractie uit het menselijke artrosekniegewricht
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Artrose (OA) is een chronische en degeneratieve gewrichtsaandoening die meestal de knie aantast. Omdat er momenteel geen genezing is, is totale knieartroplastiek (TKA) een veel voorkomende chirurgische ingreep. Experimenten met primaire menselijke OA-weefsels verkregen uit TKA bieden de mogelijkheid om ziektemechanismen ex vivote onderzoeken. Terwijl eerder werd gedacht dat artrose vooral het kraakbeen beïnvloedde, is nu bekend dat het meerdere weefsels in het gewricht beïnvloedt. Dit protocol beschrijft patiëntselectie, monsterverwerking, weefselhomogenisatie, RNA-extractie en kwaliteitscontrole (gebaseerd op RNA-zuiverheid, integriteit en opbrengst) van elk van de zeven unieke weefsels ter ondersteuning van onderzoek naar ziektemechanismen in het kniegewricht. Met geïnformeerde toestemming werden monsters verkregen van patiënten die TKA voor artrose ondergingen. Weefsels werden ontleed, gewassen en opgeslagen binnen 4 uur na de operatie door flash freezing voor RNA of formaline fixatie voor histologie. Verzamelde weefsels omvatten gewrichtskraakbeen, subchondraal bot, meniscus, infrapatellair vetkussen, voorste kruisband, synovium en vastus medialis schuine spier. RNA-extractieprotocollen werden getest voor elk weefseltype. De belangrijkste modificatie betrof de methode van desintegratie die wordt gebruikt voor laagcellige, hoog-matrix, harde weefsels (beschouwd als kraakbeen, bot en meniscus) versus relatief hoogcellige, lage matrix, zachte weefsels (beschouwd als vetkussen, ligament, synovium en spier). Het bleek dat verpulvering geschikt was voor harde weefsels en homogenisatie geschikt was voor zachte weefsels. Een neiging voor sommige proefpersonen om hogere RNA-integriteitsgetalwaarden (RIN) op te leveren dan andere proefpersonen consistent over meerdere weefsels, wat suggereert dat onderliggende factoren zoals de ernst van de ziekte de RNA-kwaliteit kunnen beïnvloeden. Het vermogen om hoogwaardig RNA te isoleren uit primaire menselijke OA-weefsels biedt een fysiologisch relevant model voor geavanceerde genexpressie-experimenten, inclusief sequencing, die kunnen leiden tot klinische inzichten die gemakkelijker worden vertaald naar patiënten.
Inleiding
De knie is het grootste synoviale gewricht in het menselijk lichaam, bestaande uit het tibiofemorale gewricht tussen het scheenbeen en het dijbeen en het patellofemorale gewricht tussen de patella en het dijbeen1. De botten in de knie zijn bekleed met gewrichtskraakbeen en worden ondersteund door verschillende bindweefsels, waaronder menisci, vet, ligamenten en spieren, en een synoviaal membraan kapselt het hele gewricht in om een met synoviale vloeistof gevulde holte1,2,3 te creëren(figuur 1). Een gezonde knie functioneer....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit onderzoeksprotocol werd goedgekeurd en volgde de institutionele richtlijnen van de Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB #13995).
1. Selectie van patiënten
- Identificeer de patiënten uit degenen die gepland zijn om TKA te ondergaan met een orthopedisch chirurg.
- Selecteer de patiënten op basis van de geschiktheidscriteria die zijn gedefinieerd in het onderzoeksprotocol. Voorbeelden van inclusiecriteria zijn 18 jaar of ouder zijn en een bevestigde diagnose van knieartrose hebben. Voorbeelden van uitsluitingscriteria zijn het ondergaan van een gedeeltelijke knieprothese of het hebben van een bevestigde....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Zeven unieke menselijke kniegewrichtweefsels zijn beschikbaar voor verzameling van patiënten die TKA ondergaan voor artrose(figuur 1). In dit protocol werd elk van deze weefsels geïdentificeerd en verwerkt binnen 4 uur na chirurgische verwijdering(figuur 2). Volgens de stappen in figuur 3werden delen van elk weefsel geformaliseerd voor histologische beoordeling(figuur 4),terwijl andere delen werden gefl.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het gepresenteerde protocol is succesvol gebleken voor het verzamelen van zeven primaire menselijke OA-weefsels voorRNA-extractie( tabel 1 ) en histologische verwerking (figuur 4). Voorafgaand aan het verzamelen van patiëntmonsters, is het noodzakelijk om een IRB-goedgekeurd protocol op te stellen, idealiter in samenwerking met een chirurg of chirurgisch team. Het toepassen van een gestandaardiseerd protocol voor het verzamelen van monsters (bijv. Resectie van consistente
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken de studiedeelnemers die dit onderzoek mogelijk hebben gemaakt en dragen dit rapport op aan nieuwe wetenschappers op het gebied van artrose.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05 402 | Steriel, nuclease-vrij. Gereserveerd voor alleen RNA-werk. |
| 10% Formalin | Cardinal Health | C4320-101 | Bewaar in het chemisch kabinet wanneer niet in gebruik. |
| 100% Chloroform (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | ICN19400290 | Steriel, nuclease-vrij. Gereserveerd voor alleen RNA-werk, bewaar in het chemisch kabinet wanneer niet in gebruik. |
| 100% Ethanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | BP2818500 | Steriel, nuclease-vrij. Gereserveerd voor alleen RNA-werk, bij verdunning gebruik DEPC/nuclease-vrij water. |
| 100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | AC327272500 | Steriel, nuclease-vrij. Gereserveerd voor alleen RNA-werk, bewaar in het chemisch kabinet wanneer niet in gebruik. |
| 100% Reagent Alcohol | Cardinal Health | C4305 | Verdund tot 70% met dH2O voor reinigingsdoeleinden. |
| 15 cm steriele kweekschotels | Thermo Scientific | 12-556-003 | Steriel, nuclease-vrij. |
| 15 mL polypropyleen (Falcon) buizen | Fisher Scientific | 14 959 53A | Steriel, nuclease-vrij. |
| 2 mL cryovials (extern getand) | Fisher Scientific | 10 500 26 | Steriel, nuclease-vrij. |
| 5 mL rondbodem buizen | Corning | 352052 | Steriel, nuclease-vrij. Gereserveerd voor alleen RNA-werk. |
| 50 mL polypropyleen (Falcon) buizen | Fisher Scientific | 12 565 271 | Steriel, nuclease-vrij. |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | Voor RNA integriteitsmeting. |
| Bioveiligheidskast | Algemeen labmateriaal | ||
| Botsneden | Fisher Scientific | 08 990 | Gesteriliseerd met 70% EtOH. |
| Chemische afzuigkap | Algemeen labmateriaal | ||
| Wegwerp scalpels (No.10) | Thermo Scientific | 3120032 | Steriel, nuclease-vrij. |
| EDTA | Life Technologies | 15-576-028 | 10% oplossing met dH2O. |
| Pincetten | Elke leverancier | Gesteriliseerd met 70% EtOH. | |
| Glycoblue Coprecipitant | Fisher Scientific | AM9516 | Gereserveerd voor alleen RNA-werk, bewaar bij -20 °C. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Vloeibare Stikstof | Elke leverancier | ||
| Vloeibare Stikstof Dewar | Algemeen labmateriaal | ||
| Molen en stamper | Elke leverancier | Gereserveerd voor alleen RNA-werk, gesteriliseerd volgens protocol. | |
| Nanodrop Spectrofotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | Voor RNA zuiverheid en opbrengstmetingen. |
| Nuclease-vrij/DEPC-behandeld water | Fisher Scientific | Steriel, nuclease-vrij. Gereserveerd voor alleen RNA-werk. | |
| PBS (Sterieel) | Gibco | 20 012 050 | Steriel, nuclease-vrij. |
| Pipetten (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips | Elke leverancier | Steriel, nuclease-vrij. | |
| Plasma/Serum Advanced miRNA kit | Qiagen | 217204 | |
| Gekoelde Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| RNAlater | Thermo Scientific | 50 197 8158 | Steriel, nuclease-vrij. |
| RNAse Away/RNAseZap | Fisher Scientific | 7002 | |
| Spatula (semimicro maat) | Elke leverancier | Gereserveerd voor alleen RNA-werk. | |
| Weefsel homogenisator | Pro Scientific | 01-01200 | Gereserveerd voor alleen RNA-werk, gesteriliseerd volgens protocol. |
| TRIzol Reagent | Fisher Scientific | 15 596 026 | Steriel, nuclease-vrij. Gereserveerd voor alleen RNA-werk. |
Referenties
- Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
- Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent adv....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
