Methodenartikel

Weefselverzameling en RNA-extractie uit het menselijke artrosekniegewricht

6.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62718

⸱

22 juli 2021

 ,  ,  , 
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

In dit artikel

Samenvatting

Primaire weefsels verkregen van patiënten na totale knieartroplastiek bieden een experimenteel model voor artroseonderzoek met maximale klinische vertaalbaarheid. Dit protocol beschrijft hoe RNA uit zeven unieke knieweefsels kan worden geïdentificeerd, verwerkt en geïsoleerd om mechanistisch onderzoek bij menselijke artrose te ondersteunen.

Samenvatting

Artrose (OA) is een chronische en degeneratieve gewrichtsaandoening die meestal de knie aantast. Omdat er momenteel geen genezing is, is totale knieartroplastiek (TKA) een veel voorkomende chirurgische ingreep. Experimenten met primaire menselijke OA-weefsels verkregen uit TKA bieden de mogelijkheid om ziektemechanismen ex vivote onderzoeken. Terwijl eerder werd gedacht dat artrose vooral het kraakbeen beïnvloedde, is nu bekend dat het meerdere weefsels in het gewricht beïnvloedt. Dit protocol beschrijft patiëntselectie, monsterverwerking, weefselhomogenisatie, RNA-extractie en kwaliteitscontrole (gebaseerd op RNA-zuiverheid, integriteit en opbrengst) van elk van de zeven unieke weefsels ter ondersteuning van onderzoek naar ziektemechanismen in het kniegewricht. Met geïnformeerde toestemming werden monsters verkregen van patiënten die TKA voor artrose ondergingen. Weefsels werden ontleed, gewassen en opgeslagen binnen 4 uur na de operatie door flash freezing voor RNA of formaline fixatie voor histologie. Verzamelde weefsels omvatten gewrichtskraakbeen, subchondraal bot, meniscus, infrapatellair vetkussen, voorste kruisband, synovium en vastus medialis schuine spier. RNA-extractieprotocollen werden getest voor elk weefseltype. De belangrijkste modificatie betrof de methode van desintegratie die wordt gebruikt voor laagcellige, hoog-matrix, harde weefsels (beschouwd als kraakbeen, bot en meniscus) versus relatief hoogcellige, lage matrix, zachte weefsels (beschouwd als vetkussen, ligament, synovium en spier). Het bleek dat verpulvering geschikt was voor harde weefsels en homogenisatie geschikt was voor zachte weefsels. Een neiging voor sommige proefpersonen om hogere RNA-integriteitsgetalwaarden (RIN) op te leveren dan andere proefpersonen consistent over meerdere weefsels, wat suggereert dat onderliggende factoren zoals de ernst van de ziekte de RNA-kwaliteit kunnen beïnvloeden. Het vermogen om hoogwaardig RNA te isoleren uit primaire menselijke OA-weefsels biedt een fysiologisch relevant model voor geavanceerde genexpressie-experimenten, inclusief sequencing, die kunnen leiden tot klinische inzichten die gemakkelijker worden vertaald naar patiënten.

Inleiding

De knie is het grootste synoviale gewricht in het menselijk lichaam, bestaande uit het tibiofemorale gewricht tussen het scheenbeen en het dijbeen en het patellofemorale gewricht tussen de patella en het dijbeen1. De botten in de knie zijn bekleed met gewrichtskraakbeen en worden ondersteund door verschillende bindweefsels, waaronder menisci, vet, ligamenten en spieren, en een synoviaal membraan kapselt het hele gewricht in om een met synoviale vloeistof gevulde holte1,2,3 te creëren(figuur 1). Een gezonde knie functioneert als een mobiel scharniergewricht dat wrijvingsloze beweging in het frontale vlak1,3mogelijk maakt. Onder pathologische omstandigheden kan beweging beperkt en pijnlijk worden. De meest voorkomende degeneratieve kniegewrichtsziekte is artrose (OA)4. Van een verscheidenheid aan risicofactoren is bekend dat ze vatbaar zijn voor de ontwikkeling van artrose, waaronder oudere leeftijd, obesitas, vrouwelijk geslacht, gewrichtstrauma en genetica, onder andere5,6. Er zijn momenteel naar schatting 14 miljoen mensen in de VS met symptomatische knie artrose, waarbij de prevalentie toeneemt als gevolg van de stijgende leeftijd van de bevolking en de percentages van obesitas7,8. Aanvankelijk beschouwd als een ziekte van het kraakbeen, wordt artrose nu begrepen als een ziekte van het hele gewricht9. Vaak waargenomen pathologische veranderingen in artrose omvatten gewrichtskraakbeenerosie, osteofytvorming, subchondrale botverdikking en ontsteking van het synovium9,10. Omdat er geen bekende remedie voor artrose is, richten behandelingen zich voornamelijk op symptoom (bijv. Pijn) management11,12,en zodra artrose is gevorderd tot het eindstadium, wordt gewrichtsvervangende chirurgie vaak geïndiceerd13.

Gewrichtsvervangende operaties kunnen gedeeltelijke of totale knieprothesen zijn, met totale kniearthroplastiek (TKA) inclusief het vervangen van de gehele tibiofemorale articulatie en het patellofemorale gewricht. Vanaf 2020 worden elk jaar ongeveer 1 miljoen TKAs uitgevoerd in de VS14. Tijdens TKA rekt een orthopedisch chirurg het bovenste deel van het tibiale plateau en de onderste femorale condylen (figuur 2A, 2B) om te worden uitgerust met prothetische implantaten. Soms verkeerd geïnterpreteerd door patiënten, wordt in een TKA slechts 8-10 mm gereseceerd vanaf het uiteinde van elk bot, dat vervolgens wordt afgedekt of opnieuw wordt opgedoken, met metaal. Een tussenliggende polyethyleen voering vormt het lageroppervlak (d.w.z. vulling) tussen de twee metalen implantaten. Bovendien worden verschillende zachte weefselcomponenten van het gewricht geheel of gedeeltelijk weggesneden om een goede gezamenlijke balans te bereiken. Onder deze weefsels bevinden zich de mediale en laterale menisci (figuur 2C), infrapatellaire vetkussen (figuur 2D), voorste kruisband (ACL; Figuur 2E), synovium (figuur 2F) en vastus medialis schuine spier (VMO; Figuur 2G) 15. Hoewel TKAs over het algemeen succesvol zijn voor artrosebehandeling, meldt ongeveer 20% van de patiënten herhaling van pijn na de operatie16. Samen met de hoge kosten en relatieve invasiviteit van de procedure, wijzen deze beperkingen op de noodzaak van verder onderzoek om alternatieve behandelingen te identificeren om de progressie van artrose te verminderen.

Om ziektemechanismen in artrose te onderzoeken die nieuwe wegen voor therapeutische interventie kunnen bieden, kunnen experimentele systemen, waaronder cellen, weefselexplantaten en diermodellen worden gebruikt. Cellen worden meestal gekweekt in monolaag en zijn afgeleid van primaire menselijke of dierlijke weefsels (bijv. Chondrocyten geïsoleerd uit kraakbeen) of vereeuwigde cellen (bijv. ATDC517 en CHON-00118). Hoewel cellen nuttig kunnen zijn voor het manipuleren van experimentele variabelen in een gecontroleerde kweekomgeving, vangen ze geen omstandigheden van het natuurlijke gewricht op waarvan bekend is dat ze celfenotypenbeïnvloeden 19. Om de complexe cascade van chemische, mechanische en cel-naar-cel communicatie die ten grondslag ligt aan artrose beter samen te vatten, wordt een alternatief gevonden in primaire menselijke of dierlijke weefselmonsters, ongeacht of ze vers of ex vivo als explantaten worden gebruikt, om de weefselstructuur en de celmicro-omgeving te behouden20. Om het gewricht in vivote bestuderen, zijn kleine (bijv. muis21)en grote (bijv. paard22)diermodellen voor artrose (bijv. door chirurgische inductie, genetische verandering of veroudering) ook nuttig. De vertaling van deze modellen naar menselijke ziekten kan echter worden beperkt door anatomische, fysiologische en metabole verschillen, onder andere23. Gezien de voor- en nadelen van experimentele systemen, maximaliseren de belangrijkste sterke punten van het soortspecifiek zijn en het handhaven van de extracellulaire niche die wordt aangeboden door de primaire menselijke OA-weefsels het translationele potentieel van onderzoeksresultaten.

Primaire menselijke OA-weefsels kunnen gemakkelijk worden verkregen na TKA, waardoor de hoge frequentie van TKA's een waardevolle bron voor onderzoek is. Tot de mogelijke experimentele toepassingen behoren genexpressie en histologische analyses. Om het potentieel van primaire menselijke OA-weefsels voor deze onderzoeksbenaderingen en andere te realiseren, worden de volgende belangrijke overwegingen geschetst. Ten eerste is het gebruik van patiëntspecimens onderworpen aan ethische regelgeving en moeten protocollen voldoen aan de goedkeuringen van de Institutional Review Board (IRB)24. Ten tweede creëren de inherente heterogeniteit van menselijke primaire zieke weefsels en de invloed van variabelen zoals leeftijd en geslacht, onder andere, de behoefte aan zorgvuldige patiëntenselectie (d.w.z. toepassing van subsidiabiliteitscriteria) en gegevensinterpretatie. Ten derde kunnen de unieke biologische eigenschappen van verschillende weefsels in het gewricht (bijv. Lage cellulariteit van kraakbeen en meniscus25) uitdagingen opleveren tijdens experimenten (bijvoorbeeld het isoleren van hoge kwaliteit en kwantiteit van RNA). Dit rapport behandelt deze overwegingen en presenteert een protocol voor patiëntenselectie, monsterverwerking, weefselhomogenisatie, RNA-extractie en kwaliteitscontrole (d.w.z. beoordeling van RNA-zuiverheid en -integriteit; Figuur 3) het gebruik van primaire menselijke artroseweefsels in de onderzoeksgemeenschap aan te moedigen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit onderzoeksprotocol werd goedgekeurd en volgde de institutionele richtlijnen van de Henry Ford Health System Institutional Review Board (IRB #13995).

1. Selectie van patiënten

  1. Identificeer de patiënten uit degenen die gepland zijn om TKA te ondergaan met een orthopedisch chirurg.
  2. Selecteer de patiënten op basis van de geschiktheidscriteria die zijn gedefinieerd in het onderzoeksprotocol. Voorbeelden van inclusiecriteria zijn 18 jaar of ouder zijn en een bevestigde diagnose van knieartrose hebben. Voorbeelden van uitsluitingscriteria zijn het ondergaan van een gedeeltelijke knieprothese of het hebben van een bevestigde diagnose van reumatoïde artritis.
  3. Neem contact op met de patiënten om geïnformeerde toestemming te verkrijgen voorafgaand aan de operatie.

2. Monsterverwerking (voor RNA)

OPMERKING: Voer alle weefselverwerking uit in een klasse II bioveiligheidskast en volg steriele technieken. Draag altijd geschikte PBM's (nitrilhandschoenen, laboratoriumjas, veiligheidsbril) bij het verwerken van menselijke monsters. Tijdens TKA worden verschillende botfragmenten geproduceerd, een grote hoeveelheid bot/kraakbeen zal mogelijk beschikbaar zijn voor dissectie. Als gevolg van ziekteprogressie kan articulaire kraakbeendegeneratie ernstiger zijn op sommige botgedeelten, wat kan worden meegenomen in het experimentele ontwerp. Alleen weefsels die elektrocauterie verplicht stellen voor resectie hebben thermische randschade en er wordt een gezamenlijke chirurgische inspanning geleverd om de meeste weefsels met een scalpel te verkrijgen om schade te minimaliseren. Gereseceerde weefsels moeten te allen tijde gehydrateerd worden gehouden met steriel PBS.

  1. Desinfecteer alle werkoppervlakken en apparatuur met 70% ethanol, RNase-ontsmettingsmiddel, DEPC-behandeld water en opnieuw met 70% ethanol. Veeg achtergebleven vloeistof weg met schone, pluisvrije weefsels. Tangen, botsnijders en scalpels worden voorafgaand aan gebruik geautoclaveerd of gedrenkt in 70% ethanol gedurende ten minste 10 minuten. Houd apparatuur ondergedompeld in 70% ethanol wanneer deze niet onmiddellijk wordt gebruikt.
  2. Pre-label ten minste drie cryovialen met de naam van het geïdentificeerde monster en aliquot nummer voor elk weefsel (bijv. TKA-1 Kraakbeen 1).
    1. Identificeer elk weefseltype van het monster op basis van de verschillen in grootte, vorm, kleur en textuur zoals weergegeven en beschreven in figuur 2. Identificeer het kraakbeen(figuur 2A-pijl), bot(figuur 2B-pijl), meniscus(figuur 2C),infrapatellaire vetkussen(figuur 2D),voorste kruisband(figuur 2E),synovium(figuur 2F)en de schuine spier van de vastus medialis (figuur 2G).
  3. Isoleer het gewrichtskraakbeen.
    1. Selecteer een botgedeelte met minimale kraakbeenafbraakafbraak.
    2. Snijd met behulp van een No.10 scalpel zoveel mogelijk door de kraakbeendiepte om de volledige dikte van de kraakbeenlaag te ontleden.
      OPMERKING: Een No.10 scalpel zal alleen kraakbeen binnendringen, niet bot.
    3. Ontleed met behulp van de volledige dikte van het kraakbeen drie blokjes van 5 mm.
  4. Isoleer het subchondrale bot.
    1. Gebruik hetzelfde botgedeelte waaruit kraakbeen is verzameld.
    2. Schraap met behulp van een No.10 scalpel eventueel overgebleven kraakbeen en resterende weefsels van het botoppervlak.
    3. Houd het te snijden botgedeelte vast met een tang en gebruik de botsnijders om drie blokjes van 5 mm te snijden.
  5. Isoleer de meniscus.
    1. Identificeer een relatief onbeschadigd deel van de mediale of laterale meniscus.
    2. Ontleed met behulp van een No.10 scalpel en tang drie blokjes van 5 mm.
  6. Isoleer het infrapatellaire vetkussen.
    1. Snijd met behulp van een no.10 scalpel en een tang het gele deel van het weefsel in drie even grote en homogene porties (elk ~ 500 mg).
  7. Isoleer de voorste kruisband (ACL).
    1. Ontleed met behulp van een No.10 scalpel en tang drie blokjes van 5 mm.
  8. Isoleer het synovium.
    1. Gebruik een No.10 scalpel en tang om het roze cellulaire deel van het membraan zoveel mogelijk te isoleren door vetweefsel weg te schrapen.
    2. Ontleed drie even grote en homogene porties (~ 200 mg elk).
  9. Isoleer de vastus medialis schuine spier (VMO).
    1. Gebruik een No.10 scalpel en tang, verwijder vetweefsel uit het monster, waardoor alleen het rode spierweefsel overblijft.
    2. Ontleed drie blokjes van 5 mm.
      OPMERKING: De initiële grootte van het weefsel beperkt de grootte van de porties.
  10. Spoel de weefselgedeelten af met steriel PBS om eventuele resten of vuil te verwijderen.
  11. Om histologie uit te voeren, fixeert u elk weefselgedeelte zoals beschreven in deel 3.
  12. Om RNA-extractie uit te voeren, snijdt u elk van de drie weefselgedeelten in kleinere stukjes (blokjes van ~ 1-2   mm).
    1. Breng de kleinere stukken over naar een cryoviale, veilige doppen van 2 ml, flash freeze door 30 s ondergedompeld te worden in vloeibare stikstof en breng vervolgens over naar een vriezer van -80 °C voor langdurige opslag (tot 4 maanden getest in het huidige protocol). Herhaal dit voor alle aliquots van alle weefsels.
    2. Ga verder met weefselhomogenisatie zoals beschreven in deel 4.

3. Monsterverwerking (voor histologie)

LET OP: Formaline is een gevaarlijke chemische stof, alleen te gebruiken in een chemische zuurkast.

  1. Vul voorgelabelde conische buizen van 15 ml met 10% formaline-oplossing.
  2. Breng met behulp van een tang het weefselgedeelte over naar de met formaline gevulde buizen.
  3. Fixeer de weefsels in formaline gedurende 1 week bij kamertemperatuur tijdens het schudden / roeren indien mogelijk.
  4. Gooi na 1 week de formaline weg in de juiste verwijdering van chemisch afval, spoel de weefsels met PBS en breng vervolgens over naar een verse conische buis van 15 ml met 70% ethanol voor langdurige opslag bij 4 °C totdat monsters zijn ingebed voor sectie.
    OPMERKING: Alleen voor bot/ kraakbeen, voer ontkalking als volgt uit.
  5. Gooi na 1 week de formaline weg in de juiste verwijdering van chemisch afval en spoel de weefsels met PBS.
  6. Breng het weefsel over in een conische buis van 50 ml met 45 ml 10% EDTA-oplossing (pH 7,4).
  7. Als schudden/roeren niet mogelijk is, keer de buisjes dan 10-15 keer per dag om.
  8. Gooi de EDTA-oplossing eenmaal per week weg en vervang deze.
    1. Test de textuur tweemaal per week met een instrument (d.w.z. spatel) of gehandschoende vinger om de ontkalking te bevestigen door vervorming te observeren wanneer druk wordt uitgeoefend. De tijd die nodig is om botweefsel te ontkalken varieert tussen monsters van 4-6 weken.
  9. Spoel het weefsel na ontkalking met PBS en breng het over op een verse conische buis van 15 ml met 70% ethanol voor langdurige opslag bij 4 °C totdat monsters zijn ingebed voor sectie.

4. Weefselhomogenisatie

LET OP: Het protocol maakt gebruik van de gevaarlijke chemische stof fenol. Werken met fenol moet worden uitgevoerd in een chemische zuurkast.

OPMERKING: Reinig alle te gebruiken apparatuur en oppervlakken grondig met 70% ethanol (minimaal 10 minuten weken), gevolgd door RNase-ontsmettingsmiddel (minimaal 10 minuten weken), afspoelen met met DEPC behandeld water, afvegen met een schone, pluisvrije papieren handdoek en vervolgens overspuiten of weken met 70% ethanol.

  1. Homogenisatie van hard weefsel (gewrichtskraakbeen, subchondraal bot, meniscus)
    1. Koel vóór homogenisatie de vijzel, stamper en spatel met vloeibare stikstof. Deze moeten zo koud mogelijk worden gehouden om te voorkomen dat het monster ontdooit.
    2. Verwerk de monsters één voor één en houd de andere monsters op -80 °C totdat ze zijn gebruikt.
    3. Breng het weefselmonster over in mortel met behulp van een gekoelde spatel; giet extra vloeibare stikstof op het weefsel en laat het verdampen. Plet het weefsel met behulp van de stamper. Voeg herhaaldelijk meer vloeibare stikstof toe aan het weefselmonster, laat het verdampen en ga dan verder met malen met de stamper om een fijn poeder te maken.
    4. Breng na het zoveel mogelijk poederen van het weefsel over op een voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml.
      1. Pre-chill buizen door onderdompeling in vloeibare stikstof gedurende 30 s voorafgaand aan weefseloverdracht.
    5. Voeg 1 ml van de zuur-guanidinium-fenoloplossing toe aan elke buis en bewaar deze op ijs.
    6. Herhaal stap 4.1.3-4.1.5 voor elk hard weefselmonster.
    7. Reinig na elk weefsel de vijzel, stamper en spatel met 70% ethanol, RNase-ontsmettingsmiddel, DEPC-behandeld water en een extra week in 70% ethanol. Veeg alle resterende vloeistof af met een schoon, pluisvrij weefsel.
    8. Incubeer de monsters op ijs gedurende nog eens 20 minuten.
  2. Homogenisatie van zacht weefsel (infrapatellaire vetkussen, ACL, synovium, VMO)
    1. Desinfecteer de homogenisator door loopbuizen van 70% ethanol, RNase-ontsmettingsmiddel, DEPC-behandeld water en een extra 70% ethanolwas, elk gedurende 30 s. Veeg alle resterende vloeistof af met een schoon, pluisvrij weefsel. Herhaal dit tussen elk monster.
    2. Pre-label 5 ml ronde bodembuizen voor elk monster. Voeg 1 ml van de zuur-guanidinium-fenoloplossing toe aan elke buis.
      1. Werk aan één monster tegelijk en houd andere monsters die moeten worden verwerkt bij -80 °C tot gebruik.
    3. Breng het weefsel over in een voorgelabelde buis van 5 ml met zuur-guanidinium-fenol.
    4. Homogeniseer de weefsels in 30 s pulsen en blijf op ijs tijdens en tussen pulsen. Herhaal dit totdat het weefsel visueel is opgelost of gedurende maximaal vijf pulsen van 30 s.
      OPMERKING: Sommige vezelige weefsels (d.w.z. spieren) kunnen niet grondig homogeniseren.
    5. Incubeer het opgeloste weefsel op ijs en ga naar het volgende monster.
      1. Reinig de homogenisator zoals beschreven in stap 4.2.1. Zorg ervoor dat weefselbrokken niet in de tanden van de sonde achterblijven; verwijder indien nodig met een steriele tang.
    6. Na homogenisatie van alle monsters, incubeer op ijs in zuur-guanidinium-fenol gedurende nog eens 20 minuten.
    7. Breng de monsters over van ronde bodembuizen naar voorgelabelde en voorgekoelde microcentrifugebuizen van 1,5 ml.

5. RNA-extractie uit weefsels

LET OP: Dit protocol maakt gebruik van gevaarlijke chemicaliën zoals fenol, chloroform en isopropanol. Voer al het werk uit in een chemische zuurkast.

OPMERKING: Apparatuur en reagentia zijn alleen gereserveerd voor RNA-werk en moeten van de juiste chemische kwaliteit zijn voor moleculaire toepassingen (d.w.z. steriel, nucleasevrij). Dit protocol volgt zowel deel 4.1 als 4.2 weefselhomogenisatieprotocollen op. Reinig alle te gebruiken apparatuur en oppervlakken grondig met 70% ethanol (minimaal 10 minuten weken), gevolgd door RNase-ontsmettingsmiddel (minimaal 10 minuten weken). Spoel af met DEPC-behandeld water, veeg de resterende vloeistof af met een schone, pluisvrije papieren handdoek en spuit of week vervolgens met 70% ethanol.

  1. Centrifugeer de microcentrifugebuizen bij 10000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om het vuil te pelleteren.
  2. Breng het supernatant over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    OPMERKING: Voor vetweefsel zal er soms een lipidelaag aanwezig zijn op de bovenkant. Vermijd het overbrengen hiervan door de laag aan de zijkant van de buis te doorboren met een pipetpunt.
  3. Voeg aan elk monster 200 μl chloroform per 1 ml zuur-guanidinium-fenoloplossing toe. Schud de buizen krachtig met de hand gedurende 30 s om te mengen. Incubeer vervolgens gedurende 2 minuten op ijs.
  4. Centrifugeer monsters bij 10000 x g gedurende 12 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Na het centrifugeren zullen zich drie lagen hebben gevormd: een waterige fase met RNA, een witte DNA-interfase en een roze eiwitfase aan de onderkant.
  5. Breng ~500 μL van de bovenste, waterige fase over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    OPMERKING: Verstoor de interfase en de eiwitfracties niet. Bewaar deze fasen bij -80 °C voor toekomstige DNA- of eiwitisolatie.
  6. Voeg een gelijk volume zuur-guanidinium-fenoloplossing toe aan de overgedragen waterige fase, meng door de buis 8-10 keer om te keren. Incubeer de buis op ijs gedurende 20 minuten.
  7. Voeg aan elk monster 200 μl chloroform per 1 ml zuur-guanidinium-fenoloplossing toe. Schud krachtig met de hand gedurende 30 s om te mengen en incubeer vervolgens gedurende 2 minuten op ijs.
  8. Centrifugeer monsters bij 10000 x g gedurende 12 minuten bij 4 °C.
  9. Breng <500 μL van de waterige fase over in een verse microcentrifugebuis, waarbij u ervoor zorgt dat het monster niet met de andere fasen wordt verontreinigd.
    LET OP: Gooi de resterende fasen weg met geschikte methoden voor het verwijderen van gevaarlijke materialen.
  10. Voeg aan elk monster een gelijk volume (als waterige fase) van 100% isopropanol toe. Meng door de buis 8-10 keer om te keren. Incubeer op ijs gedurende 5 min.
    1. Voeg 1 μL glycogeencoprecipitant toe aan elk monster om te helpen bij het lokaliseren van de RNA-pellet na centrifugatie.
  11. Centrifugeer de monsters bij 12000 x g gedurende 25 minuten bij 4 °C.
  12. Zoek de pellet in de buis (als u coprecipitant gebruikt, wordt deze blauw weergegeven). Giet het supernatant voorzichtig af.
  13. Was de pellet door 1 ml ijskoude 75% ethanol toe te voegen aan elk monster, vortex om de pellet van de bodem van de buis los te maken.
    OPMERKING: Bereid 75% ethanol met pure ethanol van moleculaire kwaliteit en nucleasevrij water.
  14. Centrifugeer bij 7000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Giet het supernatant voorzichtig af.
  15. Herhaal stap 5.13 en 5.14 nog twee keer.
  16. Snelle spin (<2000 x g gedurende 5 s) om eventuele resterende vloeistof naar de bodem van de buis te brengen. Gebruik een P20-pipet om eventuele resterende ethanol van de bodem van de buizen te verwijderen.
    1. Vermijd het aanraken van de RNA-pellet met een pipetpunt. Wissel tips tussen monsters.
  17. Met open buisdoppen, luchtdrogen monsters bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
    OPMERKING: Pellet kan doorschijnend worden als het droogt. Ervoor zorgen dat alle resterende ethanol is verdampt, zal de RNA-zuiverheid verbeteren.
  18. Voeg 25 μL nucleasevrij water toe aan elke buis om de pellet op te lossen.
  19. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
  20. Pipetteer voorzichtig op en neer om het RNA te mengen.
  21. Aliquot 5 μL van het monster in een verse buis voor kwaliteitscontrole analyse (deel 6). Bewaar de resterende 20 μL bij -80 °C voor genexpressietests.

6. Kwaliteitscontrole

  1. Bepaal de concentratie en zuiverheid van RNA met behulp van een spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Bepaal de RNA-integriteit met behulp van een elektroforese-apparaat volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Verdun het RNA om binnen het bereik van de chipdetectielimieten te liggen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zeven unieke menselijke kniegewrichtweefsels zijn beschikbaar voor verzameling van patiënten die TKA ondergaan voor artrose(figuur 1). In dit protocol werd elk van deze weefsels geïdentificeerd en verwerkt binnen 4 uur na chirurgische verwijdering(figuur 2). Volgens de stappen in figuur 3werden delen van elk weefsel geformaliseerd voor histologische beoordeling(figuur 4),terwijl andere delen werden gefl...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het gepresenteerde protocol is succesvol gebleken voor het verzamelen van zeven primaire menselijke OA-weefsels voorRNA-extractie( tabel 1 ) en histologische verwerking (figuur 4). Voorafgaand aan het verzamelen van patiëntmonsters, is het noodzakelijk om een IRB-goedgekeurd protocol op te stellen, idealiter in samenwerking met een chirurg of chirurgisch team. Het toepassen van een gestandaardiseerd protocol voor het verzamelen van monsters (bijv. Resectie van consistente

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken de studiedeelnemers die dit onderzoek mogelijk hebben gemaakt en dragen dit rapport op aan nieuwe wetenschappers op het gebied van artrose.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubesEppendorf05 402Steriel, nuclease-vrij. Gereserveerd voor alleen RNA-werk.
10% FormalinCardinal HealthC4320-101Bewaar in het chemisch kabinet wanneer niet in gebruik.
100% Chloroform (Molecular Biology Grade)Fisher ScientificICN19400290Steriel, nuclease-vrij. Gereserveerd voor alleen RNA-werk, bewaar in het chemisch kabinet wanneer niet in gebruik.
100% Ethanol (Molecular Biology Grade)Fisher ScientificBP2818500Steriel, nuclease-vrij. Gereserveerd voor alleen RNA-werk, bij verdunning gebruik DEPC/nuclease-vrij water.
100% Isopropanol (Molecular Biology Grade)Fisher ScientificAC327272500Steriel, nuclease-vrij. Gereserveerd voor alleen RNA-werk, bewaar in het chemisch kabinet wanneer niet in gebruik.
100% Reagent AlcoholCardinal HealthC4305Verdund tot 70% met dH2O voor reinigingsdoeleinden.
15 cm steriele kweekschotelsThermo Scientific12-556-003Steriel, nuclease-vrij.
15 mL polypropyleen (Falcon) buizenFisher Scientific14 959 53ASteriel, nuclease-vrij.
2 mL cryovials (extern getand)Fisher Scientific10 500 26Steriel, nuclease-vrij.
5 mL rondbodem buizenCorning352052Steriel, nuclease-vrij. Gereserveerd voor alleen RNA-werk.
50 mL polypropyleen (Falcon) buizenFisher Scientific12 565 271Steriel, nuclease-vrij.
BioanalyzerAgilentG2939BAVoor RNA integriteitsmeting.
BioveiligheidskastAlgemeen labmateriaal
BotsnedenFisher Scientific08 990Gesteriliseerd met 70% EtOH.
Chemische afzuigkapAlgemeen labmateriaal
Wegwerp scalpels (No.10)Thermo Scientific3120032Steriel, nuclease-vrij.
EDTALife Technologies15-576-02810% oplossing met dH2O.
PincettenElke leverancierGesteriliseerd met 70% EtOH.
Glycoblue CoprecipitantFisher ScientificAM9516Gereserveerd voor alleen RNA-werk, bewaar bij -20 °C.
KimwipesFisher Scientific06-666
Vloeibare StikstofElke leverancier
Vloeibare Stikstof DewarAlgemeen labmateriaal
Molen en stamperElke leverancierGereserveerd voor alleen RNA-werk, gesteriliseerd volgens protocol.
Nanodrop SpectrofotometerThermo ScientificND-2000Voor RNA zuiverheid en opbrengstmetingen.
Nuclease-vrij/DEPC-behandeld waterFisher ScientificSteriel, nuclease-vrij. Gereserveerd voor alleen RNA-werk.
PBS (Sterieel)Gibco20 012 050Steriel, nuclease-vrij.
Pipetten (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tipsElke leverancierSteriel, nuclease-vrij.
Plasma/Serum Advanced miRNA kitQiagen217204
Gekoelde Centrifuge 5810REppendorf22625101
RNAlaterThermo Scientific50 197 8158Steriel, nuclease-vrij.
RNAse Away/RNAseZapFisher Scientific
7002
Spatula (semimicro maat)Elke leverancierGereserveerd voor alleen RNA-werk.
Weefsel homogenisatorPro Scientific01-01200Gereserveerd voor alleen RNA-werk, gesteriliseerd volgens protocol.
TRIzol ReagentFisher Scientific15 596 026Steriel, nuclease-vrij. Gereserveerd voor alleen RNA-werk.

Referenties

  1. Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  2. Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
  3. Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. Anatomy, Hinge Joints. , StatPearls. Treasure Island, FL. (2020).
  4. Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044(2017).
  5. Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
  6. O'Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
  7. Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
  8. Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
  9. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  10. McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
  11. Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
  12. Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
  13. Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
  14. Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
  15. Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  16. Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
  17. Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
  18. Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180(2014).
  19. Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
  20. Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
  21. Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
  22. McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
  23. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
  24. Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32(2015).
  25. Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7(2010).
  26. Anatomy & Physiology, Connexions. OpenStax College. , Available from: http://cnx.org/content/col11496/1.6/ (2021).
  27. Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
  28. Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
  29. Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
  30. Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
  31. Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
  32. Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  33. Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
  34. Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443(2017).
  35. Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
  36. Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249(2020).
  37. Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
  38. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
  39. Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Artrose van de knieweefselhomogenisatiemenselijke kniegewrichtgewrichtskraakbeensubchondraal botmeniscusweefselgenexpressieflash freezinghistologische kleuring

Gerelateerde artikelen