Methodenartikel

Studie van dendritische celontwikkeling door korte haarspeld RNA-gemedieerde gen knockdown in een hematopoëtische stam en voorlopercellijn in vitro

3.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62730

⸱

7 maart 2022

 ,  , 
1Graduate Institute of Immunology, National Taiwan University College of Medicine, 2Department of Pathology, Division of Microbiology and Immunology, University of Utah

In dit artikel

Samenvatting

Hier bieden we een protocol voor het screenen van potentiële transcriptiefactoren die betrokken zijn bij de ontwikkeling van dendritische cel (DC) met behulp van lentivirale transductie van shRNA om stabiele knockdown-cellijnen te verkrijgen voor in vitro DC-differentiatie.

Samenvatting

Dendritische cellen (DC's) zijn belangrijke antigeen-presenterende cellen die aangeboren en adaptieve immuunresponsen verbinden. DC's zijn heterogeen en kunnen worden onderverdeeld in conventionele DC's (cDC's) en plasmacytoïde DC's (pDC's). cDC's zijn gespecialiseerd in het presenteren van antigenen aan en het activeren van naïeve T-cellen. Aan de andere kant kunnen pDC's grote hoeveelheden type I interferonen (IFN-I) produceren tijdens virale infectie. De specificatie van DC's vindt plaats in een vroeg stadium van DC-voorlopercellen in het beenmerg (BM) en wordt gedefinieerd door een netwerk van transcriptiefactoren (TF's). CDC's drukken bijvoorbeeld ID2 zeer uit, terwijl pDC's E2-2 zeer goed uitdrukken. Aangezien er steeds meer subsets van DC's worden geïdentificeerd, is er een groeiende interesse in het begrijpen van specifieke TF's die dc-ontwikkeling beheersen. Hier stellen we een methode vast om TF's te screenen die cruciaal zijn voor DC-differentiatie in vitro door lentivirus met kort haarspeld RNA (shRNA) af te leveren in een onsterfelijke hematopoietische stam en voorlopercel (iHSPC's) lijn. Na de selectie en in vitro differentiatie worden cDC- en pDC-potentiaal van de stabiele knockdown-cellijnen geanalyseerd door middel van flowcytometrie. Deze aanpak biedt een platform om genen te identificeren die mogelijk dc-loten van voorlopers in vitro beheersen.

Inleiding

DC's zijn belangrijke regulatoren van aangeboren en adaptieve immuniteit1. DC's worden voornamelijk ingedeeld in twee functioneel verschillende populaties, namelijk pDC's en cDC's. Bovendien bestaan cDC's uit twee subsets, namelijk type I en type II cDC's of cDC1's en cDC2's, respectievelijk2. pDC's, die BST2, Siglec-H en intermediaire niveaus van CD11c bij muizen tot expressie brengen3,4, zijn de cellen die grote hoeveelheden IFN-I kunnen afscheiden tijdens ontsteking en virale infectie5. Vanwege hun robuuste IFN-I-producerende vermogen wordt ook vermoed dat ze een sleutelrol spelen in de progressie van auto-immuunziekten, waaronder systemische lupus erythematosus (SLE)6. cDC1's, gedefinieerd door de oppervlakte-expressie van XCR1, CD8a, CLEC9A en CD103 bij muizen7, zijn gespecialiseerd in de activering en polarisatie van cytotoxische CD8 + T-cellen (CTL's) door de antigeenkruispresentatie, waardoor type I-immuniteit wordt geïnitieerd in reactie op intracellulaire pathogenen en kanker8,9. Aan de andere kant kunnen cDC2's, die CD11b en CD172α (ook bekend als Sirpα) tot expressie brengen bij zowel mensen als muizen, CD4 + T-cellen activeren en de type II immuunrespons tegen allergenen en parasieten10 bevorderen, evenals type III-immuniteit moduleren na extracellulaire bacteriën en microbiota-herkenning11,12.

Diversificatie van DC's wordt bepaald door een groep TF's van hematopoietische stam- en voorlopercellen (HSPC's) in de BM. E2-2 (gecodeerd door Tcf4) is een hoofdregulator voor differentiatie en functie van pDC's13,14. Daarentegen stimuleert de remmer van DNA-binding 2 (ID2) de cDC-specificatie en remt de pDC-ontwikkeling door de E-eiwitactiviteit te blokkeren15. Bovendien vereist de ontwikkeling van cDC1's IRF8 en BATF3, terwijl differentiatie van cDC2's sterk afhankelijk is van IRF416. Recente werken hebben de heterogeniteit van pDC's17 en cDC's en hun transcriptionele regulatie18 onderzocht. Vanwege de complexiteit van het DC-netwerk is er een onvervulde behoefte om een platform op te zetten om andere TF's te identificeren die de ontwikkeling en functionaliteit van DC's beheersen.

Hier gebruikten we een iHSPC die werd gegenereerd door oestrogeen-gereguleerde nucleaire translocatie van Hoxb8 in BM-cellen (ook wel Hoxb8-FL-cellen genoemd) tot expressie te brengen19. iHSPC's kunnen zich vermenigvuldigen en in een ongedifferentieerd stadium blijven in de aanwezigheid van β-estradiol en Flt3-ligand (FL), terwijl ze beginnen te differentiëren in verschillende DC-typen in de aanwezigheid van FL na terugtrekking van β-estradiol19. Op basis van deze functie kunnen we genen van belang neerhalen in het voorloperstadium, gevolgd door het onderzoeken van het effect op in vitro differentiatie van pDC's en cDC's. Daarom is deze methode een krachtig hulpmiddel om de genen te ontdekken die de ontwikkeling en functie van DC's reguleren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Behandeling van lentivirus wordt uitgevoerd volgens de regelgeving van het Department of Environmental Health and Safety van National Taiwan University College of Medicine.

1. Bereiding van vereeuwigde hematopoëtische stam- en voorlopercellijnen (iHSPC's)

  1. Behoud de iHSPC-cellijn in volledig RPMI 1640-medium met 100 ng/ ml FL en 1 μM β-oestradiol.
  2. Passeer de cellen in een verhouding van 1:10 om de 3 dagen.
    OPMERKING: Maak het RPMI 1640-medium compleet door aan te vullen met 10% foetaal runderserum (FBS), 5 x 10-5 M β-mercaptoethanol en 10 μg / ml gentamicine. Recombinant murine FL is ook in de handel verkrijgbaar.

2. Lentivirale transductie

  1. Plaat iHSPC's met een dichtheid van 1 x 105 cellen/put in 12-putplaten in 1 ml volledig medium met 100 ng/ml FL, 1 μM β-oestradiol en 8 μg/ml polybreen.
    OPMERKING: De concentratie polybreen is afhankelijk van de celtypen en ligt meestal in het bereik van 4-8 μg / ml.
  2. Voeg shRNA-dragend lentivirus toe in elke put bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 100.
    OPMERKING: De lentivirale vector is pLKO.1-Puro met een puromycine selectiemarker (figuur 1). De doelsequenties van shRNA's tegen respectievelijk LacZ, Tcf4 en Id2 worden vermeld in de tabel met materialen. De MOI wordt gedefinieerd door het aantal virionen dat per cel wordt toegevoegd tijdens infectie.
    figure-protocol-1
  3. Draai de platen gedurende 90 minuten bij 37 °C op 1.100 x g .
    OPMERKING: Spininfectie wordt uitgevoerd met behulp van een zwenkbakrotor.
  4. Incubeer de plaat met geïnfecteerde cellen gedurende een nacht bij 37 °C in een incubator.
    OPMERKING: Als de cellen gevoelig zijn voor polybreen, ververs dan de cellen met het volledige medium zonder polybreen na de spininfectie.
  5. Ververs cellen met een compleet medium dat 100 ng/ml FL en 1 μM β-oestradiol bevat 24 uur na de infectie.
  6. Voeg 6 μg /ml puromycine toe aan het medium om de geïnfecteerde cellen na nog eens 24 uur te selecteren.
    OPMERKING: Getransduceerde lentivirale vector duurt meestal 48 uur voor het tot expressie brengen van genen, waaronder puromycine-resistent gen. Zorg ervoor dat de concentratie puromycine is geoptimaliseerd voor elke cellijn.
  7. Ververs het selectiemedium met 100 ng / ml FL, 1 μM β-oestradiol en 6 μg / ml puromycine om de 3 dagen en onderhoud de cellen gedurende ten minste één week om de stabiel getransduceerde iHSPC-cellen uit te breiden.
    OPMERKING: Puromycine selectie wordt meestal 48 h later van kracht, en de periode van selectie is afhankelijk van celtypen.

3. Meting van knockdown-efficiëntie door reverse transcriptie en real-time PCR (RT-PCR)

  1. Extraheer totaal RNA uit 1 x 107 shLacZ, shTcf4 en shId2 stabiele knockdown iHSPC-cellen met behulp van commercieel RNA-extractiereagens en precipiteer RNA uit de waterige laag met isopropanol, gevolgd door het wassen van het RNA-neerslag met 75% ethanol.
  2. Los het RNA (~ 5 μg) op met 5 μL DEPC-behandeld H2O en stel de concentratie in op 1 μg/μL.
  3. Neem 1-3 μg RNA, meng met met DEPC behandeld H2O tot een eindvolume van 17,4 μL, voeg 1 μL van 1 eenheid/μL RNase-vrij DNase I toe en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C.
    OPMERKING: Deze stap is om het genomische DNA in de RNA-monsters te verteren.
  4. Voeg 1 μL van 20 mM EDTA toe aan de RNA-monsters, incubeer bij 65 °C gedurende 10 minuten om DNase I te inactiveren en plaats de RNA-monsters onmiddellijk bij 4 °C.
  5. Voeg 11,6 μL van het reactiemengsel met 1 μL oligo (dT) primers (45 μM), 6 μL 5x 1e strengbuffer, 3 μL dNTP (2 mM), 0,6 μL RNase-remmer (50 Unit/μL) en 1 μL reverse transcriptase (200 Unit/μL) toe aan de RNA-monsters en incamineer bij 40 °C gedurende 1 uur.
  6. Stop de reactie door verhitting bij 70 °C gedurende 10 minuten en verdun het reactiemengsel met 30 μL H2O.
  7. Neem 2 μL van de verdunde RT-reactiemix als DNA-sjabloon en PCR versterkt deze met behulp van primers tegen Tcf4 of Id2 (zie tabel 1 voor thermocyclercondities).
    OPMERKING: De primersequenties zijn opgenomen in de tabel met materialen.

4. In vitro differentiatie van de stabiele knockdown iHSPC cellijnen

  1. Handhaaf de stabiele enkele knockdown van LacZ (shLacZ), Tcf4 (shTcf4) of Id2 (shId2) in iHSPC's in volledig medium met 100 ng/ml FL en 1 μM β-estradiol.
  2. Verzamel shLacZ, shTcf4 en shId2 niet-gedifferentieerde iHSPC's in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g om de cellen te pelleteren.
  3. Gooi het supernatant weg en voeg 10 ml PBS toe om de cellen te wassen. Herhaal deze stap twee keer.
  4. Resuspend en zaai de iHSPC-cellen met een dichtheid van 2 x 105 cellen / ml in een 12-well plaat in 1 ml volledig medium met slechts 100 ng / ml FL.
  5. Voeg drie dagen later 1 ml vers compleet medium met 100 ng/ml FL toe.
  6. Analyseer de gedifferentieerde cellen (shLacZ, shTcf4 en shId2 iHSPC's) door flowcytometrie twee dagen later.

5. Flowcytometrische analyse van de gedifferentieerde DC's

  1. Verzamel de cellen in buizen van 1,5 ml door de cellen 2-3 keer op en neer te pipetteren in de plaat en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g bij kamertemperatuur (RT).
    OPMERKING: In vitro gedifferentieerde DC's zullen zich enigszins aan de platen hechten. Zacht pipetteren zal helpen om DC's van de platen te herstellen.
  2. Gooi het supernatant weg en resuspend de cellen in 50 μL FACS-buffer. Voeg vervolgens 50 μL anti-CD16/32 hybridoma supernatant toe en incubeer gedurende 5-10 minuten op ijs.
    OPMERKING: Het Fc-blokkerende antilichaam voorkomt niet-specifieke binding van antilichamen aan Fc-receptoren die zich uitdrukken op sommige myeloïde cellen en B-cellen en is commercieel verkrijgbaar via verschillende leveranciers.
  3. Voeg fluorescerende kleurstof-geconjugeerde antilichamen (0,04 μg voor elk antilichaam) rechtstreeks toe aan de cellen en incubeer gedurende 15 minuten op ijs in het donker. De gebruikte antilichamen zijn APC/cy7 anti-muis CD11c, FITC anti-muis CD11b en PE anti-muis B220.
    OPMERKING: pDC's worden gedefinieerd als CD11c+CD11b-B220+, en cDC's worden gedefinieerd als CD11c+CD11b+B220-.
  4. Was cellen met 1 ml FACS-buffer en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g bij RT.
  5. Resuspend de cellen in 100 μL FACS-buffer en analyseer door flowcytometrie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De kaart van lentivirale vector pLKO.1-Puro is weergegeven (figuur 1). Na de levering van lentivirus dat shRNA tot expressie bracht tegen LacZ (een niet-gerichte controle), Tcf4 en Id2 in iHSPC's, onthulde de knockdown-efficiëntie bevestigd door RT-qPCR dat de expressie van Tcf4 was verminderd in shTcf4 iHSPCCs, vergeleken met shLacZ iHSPCs (Figuur 2A). Aan de andere kant werd de verminderde expressie van

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Lentivirus-gebaseerde shRNA-vectoren worden vaak gebruikt voor gen-uitschakeling door virale transductie in cellen en maken stabiele integratie in het gastheergenoom mogelijk. Er moet echter rekening worden gehouden met verschillende transductie-efficiëntie in verschillende celtypen en er zijn een aantal benaderingen gevolgd om dit probleem op te lossen.

Polybreen is een polycationisch polymeer dat de ladingen op het celmembraan kan neutraliseren, waardoor de binding van het virion aan de cel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zijn dankbaar voor de technische ondersteuning van Dr. Tz-Ling Chen. We bedanken de National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan) voor het leveren van shRNA lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw). Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 en MOST 109-2320-B-002-054-MY3).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antilichamen
APC/Cy7 anti-muis CD11c AntilichaamBiolegend117324(Clone: N418)
FITC anti-muis/mens CD11b AntilichaamBiolegend101206(Clone: M1/70)
PE anti-muis/mens B220 AntilichaamBiolegend103208(Clone: RA3-6B2)
Celcultuur
1.5 mL Microbuis ExtraGeneTUBE-170-C
12-well weefselkweekplaatFalcon353043
Foetaal bovien serum (FBS)Corning35-010-CV
RPMI 1640 mediumgibco11875-085
Reagens
β-oestradiolSigma-AldrichE2758-250MG
β-mercaptoethanol (β-ME)Sigma-AldrichM6250
FACS bufferzelfgemaaktFormule: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3
Flt3 ligand (FL)zelfgemaakt
PolybreneSigma-AldrichTR-1003-G
PuromycinInvivogenant-pr-1
TRIsureBIOLINEBIO-38032
shRNA (Doelsequentie/clone ID)Bedrijf
shId2  (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)The RNAi Consortium (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)The RNAi Consortium (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)The RNAi Consortium (TRC)

Referenties

  1. Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
  2. Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
  3. Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12. Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. -J. IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).
  6. Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).
  7. Durai, V., Murphy, K. M. Functions of murine dendritic cells. Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).
  8. Mashayekhi, M., et al. CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites. Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).
  9. Anderson, D. A., Dutertre, C. -A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
  10. Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
  11. Persson, E. K., et al. IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation. Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).
  12. Kumamoto, Y., et al. CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity. Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).
  13. Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
  14. Grajkowska, L. T., et al. Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification. Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).
  15. Jackson, J. T., et al. Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages. The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).
  16. Suzuki, S., et al. Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).
  17. Rodrigues, P. F., et al. Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells. Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).
  18. Brown, C. C., et al. Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity. Cell. 179 (4), 846-863 (2019).
  19. Redecke, V., et al. Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential. Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).
  20. Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection. Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).
  21. Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer. Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).
  22. Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).
  23. Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
  24. Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information. Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).
  25. Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hematopo tische progenitorcellenlentivirale transductiein vitro differentiatieflowcytometrietranscriptiefactorenconventionele dendritische cellenplasmacyto de dendritische cellen

Gerelateerde artikelen