Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Snelle, betaalbare en ongecompliceerde productie van bacteriële celvrije lysaat

4.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62753

⸱

29 oktober 2021

 ,  ,  , 
1Biocircuits Institute, University of California, San Diego, 2Present address, Kyoto Institute of Technology, 3Present address, Vertex Pharmaceuticals, 4Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 5Molecular Biology Section, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een snelle en eenvoudige methode om bacterieel lysaat te produceren voor celvrije genexpressie, met behulp van een gemanipuleerde stam van Escherichia coli en waarvoor alleen standaard laboratoriumapparatuur nodig is.

Samenvatting

Celvrije genexpressie biedt de kracht van biologie zonder de complicaties van een levend organisme. Hoewel er veel van dergelijke genexpressiesystemen bestaan, zijn de meeste vrij duur om te kopen en / of vereisen ze speciale apparatuur en fijnmazige expertise om effectief te produceren. Dit protocol beschrijft een methode om bacterieel celvrij lysaat te produceren dat hoge niveaus van genexpressie ondersteunt, waarbij alleen standaard laboratoriumapparatuur wordt gebruikt en minimale verwerking vereist is. De methode maakt gebruik van een Escherichia coli-stam die een endolysine produceert die de groei niet beïnvloedt, maar die een geoogste celkorrel efficiëntlyseert na een eenvoudige vries-dooicyclus. De enige verdere verwerking die nodig is, is een korte incubatie gevolgd door centrifugering om het autolysaat van cellulair puin te verwijderen. Dynamische gencircuits kunnen worden bereikt door heterologe expressie van het ClpX-protease in de cellen vóór het oogsten. Een E. coli-stam zonder het lacZ-gen kan worden gebruikt voor hooggevoelige, celvrije biosensingtoepassingen met behulp van een colorimetrische of fluorescerende uitlezing. Het hele protocol vereist slechts 8-9 uur, met slechts 1-2 uur hands-on arbeid van inenting tot voltooiing. Door de kosten en tijd te verminderen om celvrij lysaat te verkrijgen, moet deze methode de betaalbaarheid van celvrije genexpressie voor verschillende toepassingen vergroten.

Inleiding

Genexpressie in celvrije lysaten heeft verschillende voordelen ten opzichte van het gebruik van levende cellen1,2,3,4. Lysaten kunnen gemakkelijk biochemisch worden gemodificeerd en worden gebruikt in omstandigheden die schadelijk of onmogelijk te bereiken zijn in levende cellen. Genexpressiecircuits hoeven niet te concurreren met biologische processen van de gastheer en het testen van nieuwe genetische circuits is net zo eenvoudig als het toevoegen van DNA. Om deze redenen heeft celvrije genexpressie verschillende toepassingen gevonden, van biosensoren5,6 tot het snel prototypen van synthetische gencircuits7,8 tot het ontwikkelen van kunstmatige cellen9. De meeste celvrije genexpressie maakt gebruik van cellulaire lysaten die sterk zijn verwerkt, wat over het algemeen lange en complexe protocollen, gespecialiseerde apparatuur en / of gevoelige stappen vereist die kunnen leiden tot aanzienlijke variatie tussen gebruikers en batches10,11.

Dit artikel beschrijft een eenvoudige, efficiënte methode voor het produceren van celvrij lysaat dat minimale verwerking en expertise vereist(Figuur 1A)12. De methode is gebaseerd op E. coli-cellen die zijn ontworpen om te lyseren na een eenvoudige vries-dooicyclus. De cellen drukken een endolysine uit faag lambda die de celwand afbreekt. Terwijl de cellen groeien, blijft dit endolysine achter in het cytoplasma, gesekwestreerd uit de celwand. Een eenvoudige vries-dooicyclus verstoort echter het cytoplasmatische membraan, waardoor de endolysine vrijkomt in het periplasma, waar het de celwand afbreekt, wat resulteert in snelle cellysis. Het protocol kan worden voltooid met slechts een paar uur hands-on werk en vereist alleen een vriezer, een centrifuge van 30.000 × g (voor optimale resultaten; lagere snelheden kunnen met meer zorg worden gebruikt om de pellet niet te verstoren), een vortexmixer en een eenvoudige bufferoplossing. Functioneel lysaat kan zelfs worden geproduceerd door de cellen te vriesdrogen en ter plaatse opnieuw te hydrateren. Deze methode produceert echter lysaten met een lagere activiteit, vermoedelijk als gevolg van het resterende celafval.

De lysaten zijn zeer actief voor celvrije genexpressie en ze kunnen op verschillende manieren worden verbeterd, afhankelijk van het eindgebruik. De snelheid van eiwitsynthese kan verder worden verhoogd door het lysaat te concentreren met behulp van standaard spinconcentrators. Lineair DNA kan worden beschermd tegen afbraak door het toevoegen van gezuiverd GamS-eiwit. Eiwitdegradatie, noodzakelijk voor complexere circuitdynamica zoals oscillatie, kan worden bereikt door een ClpX-hexameer in de autolysaatproducerende stamco-expressie te geven 13. Ten slotte worden op LacZ gebaseerde visuele uitlezingen mogelijk gemaakt door gebruik te maken van een autolysaatbelasting zonder lacZ. Over het algemeen produceert deze methode zeer actief celvrij lysaat dat geschikt is voor een breed scala aan toepassingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereid media en buffers voor.

  1. Bereid 2xYTPG medium voor.
    1. Meng 62 g 2xYT poeder, 5,99 g kaliumfosfaat monobasisch, 13,93 g kaliumfosfaat dibasisch en gedeïoniseerd water tot 2 L.
    2. Autoclaaf op vloeistofcyclus met een belichtingstijd van 30 min14.
    3. Voeg aan 400 ml 2xYTP-media van 1.1.2 7,2 g D-glucose (dextrose) toe en meng tot het is opgelost.
    4. Filter-steriliseer door een filter van 0,2 μm.
  2. Bereid S30A-buffer voor.
    1. Meng Tris-HCl (pH 7,7, 50 mM eindconcentratie), kaliumglutamaat (60 mM finale) en magnesiumglutamaat (14 mM finale).
    2. Stel de pH in op 7,7 met 10 M KOH.
  3. Oplossing 1 voorbereiden (zie tabel 1).
    1. Resuspend 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonzuur (HEPES) in 2 ml water.
    2. Stel de pH in op 8,0 met KOH.
    3. Voeg alle andere componenten uit tabel 1toe.
    4. Stel de pH in op 7,6 met 10 M KOH. Filter-steriliseren.
  4. Bereid 2,5x premixoplossing (zie tabel 2).
    1. Meng alle componenten in tabel 2.
    2. Stel de pH in op 7,5 met KOH.
    3. Aliquot en invriezen bij -80 °C.
      OPMERKING: Een reactie van 20 μL gebruikt 8,9 μL premix.

2. Bereid cellen voor.

  1. Strijk de autolysaatcellen op LB-agarplaten met 50 μg/ml ampicilline met behulp van een entingslus en groei bij 37 °C (zie noot 1).
  2. Kies een enkele kolonie in een startercultuur van LB /ampicillinemedium met behulp van een pipetpunt en kweek 's nachts bij 37 ° C.
  3. Ent 400 ml 2xYTPG-medium met 50 μg/ml ampicilline met 400 μL startcultuur en kweek bij 37 °C in een Erlenmeyer van 1 L, schuddend bij 300 tpm.
  4. Meet periodiek de optische dichtheid van de cultuur bij 600 nm (OD600) met behulp van een spectrofotometer om een optische cuvette met een padlengte van 1 cm af te lezen. Wanneer de OD600 groter is dan 1, begint u de cultuur 5-voudig te verdunnen vóór de metingen om ervoor te zorgen dat de metingen binnen het lineaire bereik van een typische laboratoriumspectrofotometer blijven. Blijf de cellen kweken totdat de 5-voudig verdunde cultuur OD600 van 0,3 bereikt (overeenkomend met een cultuur OD600 van 1,5).

3. Bereid het lysaat voor.

  1. Bereid S30A-buffer aangevuld met 2 mM dithiothreitol (DTT). Meng 3 ml S30A-buffer met 6 μL DTT-stamoplossing op 1 M. Plaats op ijs voor gebruik in stap 3.7.
  2. Oogst de cellen door 15 min bij kamertemperatuur te centrifugeren bij 1800 × g.
  3. Gooi het supernatant weg door het af te gieten en een pipet te gebruiken om de resterende vloeistof te verwijderen.
  4. Resuspend de pellet in 45 ml koude (4-10 °C) S30A buffer met behulp van een vortex mixer.
  5. Weeg een lege centrifugebuis van 50 ml, breng de cellen erin over en herhaal stap 3.2-3.3 om de cellen te wassen.
  6. Weeg de pellet en trek het gewicht van een lege buis van 50 ml af. Zorg ervoor dat u het resterende supernatant zorgvuldig opademt om een nauwkeurige meting van het pelletgewicht te garanderen.
    OPMERKING: Een typische opbrengst is ~ 1,3 g celkorrel uit 400 ml productiecultuur.
  7. Voeg 2 volumes koude S30A-buffer toe aangevuld met 2 mM dithiothreitol, d.w.z. 2 ml buffer voor elke 1 g celkorrel, en resuspend de cellen door krachtig vortexmenging.
  8. Vries de cellen in. Plaats de buis van 50 ml met de cellen in een vriezer van -20 °C of -80 °C totdat de pellet goed bevroren is.
    OPMERKING: De vriesstap is een goed stoppunt voor de dag.
  9. Ontdooi de cellen in een waterbad op kamertemperatuur.
  10. Vortex krachtig gedurende 2-3 min.
  11. Incubeer bij 37 °C gedurende 45 minuten met schudden bij 300 tpm.
  12. Ruim het monster van zwaar celafval door het gedurende 45 minuten bij 45 minuten bij 4 °C in transparante centrifugebuizen bij 30.000 × g te centrifugeren.
    OPMERKING: Als er geen centrifuge van 30.000 x g beschikbaar is, centrifugeer dan gedurende 45 minuten bij 21.000 × gen wees extra voorzichtig in stap 3.13, omdat de pellet minder compact zal zijn.
  13. Breng het supernatant voorzichtig over in een nieuwe buis met een pipet, zodat de pellet zoveel mogelijk wordt verstoord. Als het overgedragen supernatant verontreinigd is met materiaal uit de pellet, herhaalt u de vorige stap.
  14. Breng het supernatant over in 1,5 ml centrifugebuizen en centrifugeer nogmaals bij 21.000 × g (of de maximale snelheid van een tafelcentrifuge) gedurende 5 minuten.
  15. Vul het geklaarde autolysaat in de gewenste volumes, vermijd zorgvuldig resterende pellets en vries in bij -80 °C of gebruik het onmiddellijk.
    OPMERKING: Een enkele reactie van 20 μL gebruikt 8 μL autolysaat.

4. Celvrije genexpressie

OPMERKING: Het autolysaat is nu klaar voor elk gewenst eindgebruik. Het volgende is een voorbeeld van een standaardprotocol voor celvrije genexpressie.

  1. Voor een reactie van 20 μL mengt u op ijs 8 μL autolysaat en 8,9 μL premix. Zie OPMERKING aan het einde van het protocolgedeelte met betrekking tot de optimalisatie van magnesiumglutamaat- en PEG 8000-concentraties.
  2. Voeg DNA (bijv. pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 toe aan een eindconcentratie van 8 nM), eventuele andere reagentia en water aan 20 μL.
  3. Plaats de reactie in een 384-well microplaat en meet het fluorescentietijdverloop en/of eindpunten met behulp van een plaatlezer. Gebruik voor groen fluorescerend eiwit (GFP) een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 520 nm.

5. Wijzigingen van het protocol

OPMERKING: De volgende wijzigingen van het protocol maken het mogelijk om andere toepassingen te bedienen.

  1. Celvrije genexpressie met behulp van lineaire DNA-sjablonen
    1. Voer de stappen in rubriek 4 uit en vul de reactie aan met 2,2 μM gezuiverd GamS-eiwit (uitgedrukt en gezuiverd zoals beschreven12) vóór de toevoeging van het lineaire DNA.
  2. Celvrije genexpressie met eiwitafbraak
    1. Gebruik in stap 2.1 autolysaatcellen die het plasmide pACYC-FLAG-dN6-His bevatten (zie de tabel met materialen). Neem in alle groeimedia bovendien 34 μg / ml chlooramfenicol op.
    2. Neem in stap 2.3 40 μM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) op in het groeimedium om expressie uit het plasmide te induceren.
    3. Herhaal stap 3.2-3.4 (wassen) nog twee keer (voor een totaal van drie wasbeurten) om de volledige verwijdering van chlooramfenicol, een translatieremmer, te garanderen. Vervang voor de eerste twee wasbeurten (stap 3.4) de S30A-buffer door een fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,4).
    4. Vul in stap 4.2 aan met een extra 3 mM ATP (toegevoegd uit een voorraadoplossing van 100 mM ATP in water, pH 7,2) en 4,5 mM magnesiumglutamaat (met behulp van een 1 M stockoplossing in water) (eindconcentraties) om het hoge ATP-gebruik door ClpXP te compenseren, evenals chelatie van magnesium door de extra ATP.
  3. Celvrije genexpressie met behulp van lacZ-gebaseerde uitlezingen (inclusief colorimetrisch)
    1. Gebruik in stap 2.1 autolysaatcellen die lacz niet native tot expressie brengen (zie de tabel met materialen).
  4. Als alternatief kunt u het lysaat rechtstreeks uit gevriesdroogde cellen bereiden.
    1. Voer alle stappen van 1.1 tot 3.7 uit.
    2. Meng 8 μL celsuspensie met 8,9 μL premix.
    3. Voeg plasmide-DNA (indien gewenst), andere aangepaste reagentia en water toe om een eindvolume van 20 μL te bereiken.
    4. Breng de reactie over op een 384-well microplaat en vries deze te vriesdrogen.
      OPMERKING: Gevriesdroogde monsters kunnen tot een week en mogelijk langer worden bewaard.
    5. Om de reactie te beginnen, rehydrateert u het met 18 μL gedeïoniseerd water aangevuld met gewenst DNA of andere reagentia.
    6. Volg de fluorescentiedynamiek in een plaatlezer.

OPMERKING 1: Autolysaatcellen zijn ontworpen om te lyseren op een vries-dooicyclus, dus het is bijzonder belangrijk om cryoprotectant te gebruiken bij het maken van bevroren voorraden. We bevroren voorraden in 24% wt/vol glycerol en bewaarden ze bij -80 °C.

OPMERKING 2: Magnesiumionen en PEG 8000 zijn van cruciaal belang voor de prestaties van lysaat. Het basis 2,5x premix, gebaseerd op eerder gepubliceerde gegevens, bevat 6 mM magnesiumglutamaat en 4,8% wt/vol PEG 8000, die in de uiteindelijke reactie respectievelijk 2,4 mM en 1,9% worden. Het autolysaat dat hier met het protocol is bereid, presteert meestal het beste met een extra 5 mM Mg-glutamaat en 1,5% PEG 8000 in de uiteindelijke reactie. Dit kan echter worden geoptimaliseerd in het bereik van een extra 0-10 mM Mg glutamaat en een extra 0-3% PEG 8000 (vergeleken met de basis premix). Om het premix te bereiden met de aanbevolen extra 5 mM Mg-glutamaat en 1,5% PEG 8000 (eindconcentraties), mengt u 380 μL premix met 4,75 μL magnesiumglutamaat bij 1 M en 36,1 μL PEG 8000 bij 40% gewicht/volume.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Representatieve resultaten kunnen worden waargenomen door autolysaat te gebruiken om GFP uit te drukken uit een constitutief tot expressie brengend plasmide, hier pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, en een tijdsverloop van GFP-fluorescentie in een plaatlezer te registreren (Figuur 1B). Een verdunningsreeks van plasmide-DNA vond sterke expressie, zelfs bij 1 nM DNA. In vergelijking met een in de handel verkrijgbaar lysaat kan het autolysaat een grotere totale opbrengst produceren en een grotere...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier beschreven protocol levert zeer actief bacterieel lysaat op voor celvrije genexpressie. De sleutel is om cellen te gebruiken die het plasmide pAD-LyseR dragen, dat de lambdafaag endolysine cytosolisch tot expressie brengt. Deze cellen worden gepotentieerd om zichzelf te lyseren bij permeabilisatie van het binnenmembraan, waardoor de endolysine toegang krijgt tot de celwand, wat de methode bereikt door een eenvoudige vries-dooicyclus. Omdat de cellen zichzelf effectief lyseren, wordt het product autolysaat genoem...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

J.H. is mede-oprichter van GenCirq Inc, dat zich richt op kankertherapieën. Hij zit in de Raad van Bestuur en heeft aandelen in GenCirq.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Zachary Sun en Richard Murray (California Institute of Technology) voor het leveren van het plasmide P_araBAD-gamS, en Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) voor het vriendelijk leveren van een snelle koelcentrifuge. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health en van het ARO MURI-programma en werd gedeeltelijk ondersteund door het Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2xYT mediaEMD Millipore4.85008of gelijkwaardig
3-PGASigma AldrichP8877of gelijkwaardig
Amicon Ultra-15 centrifugale filterunit, 3 kDa cut-offMillipore SigmaUFC900308optioneel, kan worden gebruikt om lysate te concentreren, selecteer concentratorcapaciteit die geschikt is voor het te concentreren volume
ampicillineSigma AldrichA0166-5Gof carbencillin, een stabielere variant
ATPSigma AldrichA8937of gelijkwaardig
cAMPSigma AldrichA9501of gelijkwaardig
CoASigma AldrichC4282of gelijkwaardig
CTPUnited States Biosciences14121of gelijkwaardig
D-glucose (dextrose)Fisher ScientificAAA1749603of gelijkwaardig
dithiothreitol (DTT)Sigma AldrichD0632-1Gof gelijkwaardig
E. coli BL21-Gold (DE3) met pAD-LyseRAddgene99244
E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ met pAD-LyseRAddgene99245
FolinezuurSigma AldrichF7878of gelijkwaardig
GTPUnited States Biosciences16800of gelijkwaardig
HEPESSigma AldrichH3375-25Gof gelijkwaardig
LB mediaFisher ScientificDF0446075of gelijkwaardig
magnesiumglutamaatSigma Aldrich49605-250Gof gelijkwaardig
NADSigma AldrichN6522of gelijkwaardig
kaliumglutamaatSigma AldrichG1501-100Gof gelijkwaardig
kaliumhydroxide (KOH)Sigma Aldrich221473-25Gvoor het aanpassen van de pH
kaliumfosfaat dibasischFisher ScientificBP363-500of gelijkwaardig
kaliumfosfaat monobasischFisher ScientificBP362-500of gelijkwaardig
SpermidineSigma Aldrich85558of gelijkwaardig
Tris-HClFisher Scientific9310500GMof gelijkwaardig
tRNA-mixRoche10109541001of gelijkwaardig
UTPUnited States Biosciences23160of gelijkwaardig

Referenties

  1. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  2. Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
  3. Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
  4. He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
  5. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  6. Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  7. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  8. Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free "breadboard". ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
  9. Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027(2018).
  10. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762(2013).
  11. Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
  14. Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
  15. Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  16. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614(2016).
  17. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8(2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Celvrije genexpressiebacterieel cellysaatEscherichia coli lysaatvries dooi lyseautolyseprotocolexpressie van genencircuitscelvrije biosensingClpX protease expressiecolorimetrische uitlezingfluorescentie uitlezing
Snelle, betaalbare en ongecompliceerde productie van bacteriële celvrije lysaat
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.