Method Article

Fluorescentiemicroscopie voor ATP-internalisatie gemedieerd door macropinocytose in menselijke tumorcellen en tumor-xenogetransplanteerde muizen

DOI:

10.3791/62768

⸱

June 30th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ohio University, 2Molecular and Cellular Biology Program, Ohio University, 3Neuroscience Program, Ohio University, 4Edison Biotechnology Institute, Ohio University, 5Translational Biomedical Sciences Program, Ohio University, 6Honors Tutorial College, Ohio University, 7Department of Biomedical Sciences, Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We ontwikkelden een reproduceerbare methode om de internalisatie van niet-hydrolyseerbaar fluorescerend adenosinetrifosfaat (ATP), een ATP-surrogaat, met hoge cellulaire resolutie te visualiseren. We hebben onze methode gevalideerd met behulp van onafhankelijke in vitro en in vivo assays - menselijke tumorcellijnen en immunodeficiënte muizen xenografeerd met menselijk tumorweefsel.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Van adenosinetrifosfaat (ATP), inclusief extracellulaire ATP (eATP), is aangetoond dat het een belangrijke rol speelt in verschillende aspecten van tumorigenese, zoals geneesmiddelresistentie, epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) en metastase. Intratumorale eATP is 103 tot 104 keer hoger in concentratie dan in normale weefsels. Terwijl eATP functioneert als een boodschapper om purinerge signalering voor EMT-inductie te activeren, wordt het ook geïnternaliseerd door kankercellen door middel van upregulated macropinocytose, een specifiek type endocytose, om een breed scala aan biologische functies uit te voeren. Deze functies omvatten het leveren van energie aan ATP-vereisende biochemische reacties, het doneren van fosfaatgroepen tijdens signaaltransductie en het vergemakkelijken of versnellen van genexpressie als een transcriptionele cofactor. ATP is direct beschikbaar en de studie op kanker en andere gebieden zal ongetwijfeld toenemen. EATP-studie blijft echter in een vroeg stadium en onopgeloste vragen blijven onbeantwoord voordat de belangrijke en veelzijdige activiteiten van eATP en geïnternaliseerde intracellulaire ATP volledig kunnen worden ontrafeld.

De bijdragen van de laboratoria van deze auteurs aan deze vroege eATP-studies omvatten microscopische beeldvorming van niet-hydrolyseerbare fluorescerende ATP, gekoppeld aan fluorescentie dextrans met een hoog en laag molecuulgewicht, die dienen als macropinocytose en endocytose tracers, evenals verschillende endocytoseremmers, om het eATP-internalisatieproces te controleren en te karakteriseren. Deze beeldvormingsmodaliteit werd toegepast op tumorcellijnen en op immunodeficiënte muizen, xenogegrafeerd met menselijke kankertumoren, om eATP-internalisatie in vitro en in vivo te bestuderen. Dit artikel beschrijft deze in vitro en in vivo protocollen, met de nadruk op het modificeren en finetunen van assaycondities, zodat de macropinocytose-/endocytose-gemedieerde eATP-internalisatie assays met succes kunnen worden uitgevoerd in verschillende systemen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De opportunistische opname van intratumorale extracellulaire (dwz) voedingsstoffen is onlangs uitgeroepen tot een belangrijk kenmerk voor kankermetabolisme1. Een van deze belangrijke voedingsstoffen is ATP, omdat de concentratie van ieATP 103 en 104 keer hoger is dan die in normale weefsels, in het bereik van enkele honderden μM tot lage mM2,3,4,5. Als een belangrijk energie- en signaalmolecuul speelt ATP een centrale rol in het cellulaire metabolisme in kankerachtige en gezonde cellen

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hierin gerapporteerde procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de IACUC van Ohio University en met de NIH.

1. Selectie van niet-hydrolyseerbare fluorescerende ATP (NHF-ATP) en dextrans

  1. Selecteer een fluorofoor-geconjugeerde NHF-ATP (Figuur 1A) en endocytose tracers, hoge en lage moleculaire gewicht fluorescerende dextrans (TMR-HMWFD en TMR-LMWFD) (Figuur 1B), op basis van de gewenste emissiegolflengten (bijv. beeldvormingssysteem uitgerust met geschikte filters) en het specifieke endocytoseproces dat moet worden bestudeerd.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro studie
Intracellulaire internalisatie van NHF-ATP werd aangetoond door co-lokalisatie van NHF-ATP met HMWFD of LMWFD(figuur 4). Het succes van deze procedure hangt voornamelijk af van het gebruik van geschikte concentraties NHF-ATP en dextrans en van het bepalen van het juiste type of de juiste type(n) dextrans (poly-lysine vs. neutraal). Om bijvoorbeeld macropinocytose te onderzoeken, werd HMWFD gekozen omdat het alleen wordt geïnterna.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er werd een methode ontwikkeld voor ruimtelijke, temporele en kwantitatieve analyse van de cellulaire internalisatie van niet-hydrolyseerbare ATP. Deze methode is breed toepasbaar voor gebruik in diverse biologische systemen, waaronder verschillende tumorogene modellen, waarvoor we technische instructies en representatieve gegevens verstrekken. Om interpreteerbare gegevens te verkrijgen tijdens in vivo ATP-internalisatiestudies (sectie 4 van het protocol), is het van cruciaal belang om de experimentele tijd die .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryosectie werd ter plaatse uitgevoerd in de Ohio University Histopathology Core. Dit werk werd deels ondersteund door start-upfondsen (Ohio University College of Arts & Sciences) aan C Nielsen; NIH-subsidie R15 CA242177-01 en RSAC-toekenning aan X Chen.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A549 cells, human lung epithelial, carcinomaNational Cancer Instituten/aLess expensive source
AcetoneFisher ScientificS25904
Aluminum foil, ReynoldsGrainger6CHG6
Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade ReagentThermoFisherP36930
ATP analogJena BiosciencesNK-101
Autoclave, sterilizerGrainger33ZZ40
Blades, cryostat, high profileC. L. Sturkey, Inc.DT554550
Calipers, vernierGrainger4KU77
Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-freeMillipore Sigma51651C-1000ML
Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotorEppendorf5810R
ChloroformAcros Organics423555000
Conical tube, 15 mLVWR21008-216
Conical tube, 50 mLVWR21008-242
Coverslips, glass, 12 mmCorning2975-245
Cryostat, Leica CM1950Leica BiosystemsCM1950
Delicate task wipe, Kim WipesKimberly-Clark34155
Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW)InvitrogenD1818MW = 70,000, Tetramethylrhodamine
Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW)InvitrogenD1819
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-freeFisher Scientific11885076
Dry iceLocal deliveryCustom order
Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition softwareNikonCustom order
EthanolFisher ScientificBP2818-4
Fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher16000044
Forceps, Dumont #7, curvedFine Science Tools11274-20
Forceps, Dumont #5, straightFine Science Tools11254-20
Gloves (small, medium, large)MicroflexN191, N192, N193
Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice)Fisher Scientific19-046-563
HemocytometerDaiggerEF16034F EA
Incubator, cell cultureEppendorfGalaxy 170 S
Labelling tapeFisher Scientific159015R
Marking pen, Sharpie (ultra-fine)Staples642736
Mice, immunodeficient (Nu/J)Jackson Laboratory2019
Microcentrifuge, accuSpin Micro17Fisher Scientific13-100-675
Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL)AxygenMCT-150-C
Microscope slide boxFisher Scientific50-751-4983
Needle, 27 gaugeBecton-Dickinson752 0071
PaintbrushGrainger39AL12
Paper towelsStaples33550
ParaformaldehydeAcros Organics416785000
Penicillin/StreptomycinGibco15140122
Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm lengthRoboz Surgical Instrument Co.RS-6162
Phosphate buffered saline (PBS)Fisher ScientificBP3991
Pipet tips (10 μL)Fisher Scientific02-707-438
Pipet tips (200 μL)Fisher Scientific02-707-411
Pipet tips (1000 μL)Fisher Scientific02-707-403
Pipets, serological (10 mL)VWR89130-910
Pippetor, Gilson P2DaiggerEF9930A
Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL)DaiggerEF9931A
Platform shaker - orbital, benchtopCole-ParmerEW-51710-23
Positively-charged microscope slides, SuperfrostFisher Scientific12-550-15
Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc.Fisher Scientific22-079-707
Scissors, surgical - sharp, curvedFine Science Tools14005-12
Software for image analysis, Nikon ElementsNikonCustom order
Software for image analysis, ImageJ (FIJI)National Institutes of Healthn/aDownload online (free)
Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessoryLeica Biosystems14047740044
Staining tray, 245 mm BioAssay DishCorning431111
Syringe, 1 ccBecton-Dickinson309623
Tape, laboratory, 19 mm widthFisher Scientific15-901-5R
TimerFisher Scientific14-649-17
Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameterFisher Scientific08-757-100D
Tissue culture flask, 225 cm2ThermoFisher159933
Tissue culture plate, 24-wellBecton-Dickinson353226
Tissue embedding mold, stainless steelTissue Tek4161
Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT)Fisher Scientific4585
Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25%Gibco25200072
Water bath, Precision GP 2SThermoFisherTSGP2S

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
  2. Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyATP InternalizationMacropinocytosisHuman Tumor CellsTumor Xenograft MiceExtracellular ATPEndocytosis TracersFluorescent DextranEpifluorescence ImagingCryosectioning Procedure

Related Articles