Method Article

Fluorescentiemicroscopie voor ATP-internalisatie gemedieerd door macropinocytose in menselijke tumorcellen en tumor-xenogetransplanteerde muizen

DOI:

10.3791/62768

⸱

June 30th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ohio University, 2Molecular and Cellular Biology Program, Ohio University, 3Neuroscience Program, Ohio University, 4Edison Biotechnology Institute, Ohio University, 5Translational Biomedical Sciences Program, Ohio University, 6Honors Tutorial College, Ohio University, 7Department of Biomedical Sciences, Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We ontwikkelden een reproduceerbare methode om de internalisatie van niet-hydrolyseerbaar fluorescerend adenosinetrifosfaat (ATP), een ATP-surrogaat, met hoge cellulaire resolutie te visualiseren. We hebben onze methode gevalideerd met behulp van onafhankelijke in vitro en in vivo assays - menselijke tumorcellijnen en immunodeficiënte muizen xenografeerd met menselijk tumorweefsel.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Van adenosinetrifosfaat (ATP), inclusief extracellulaire ATP (eATP), is aangetoond dat het een belangrijke rol speelt in verschillende aspecten van tumorigenese, zoals geneesmiddelresistentie, epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) en metastase. Intratumorale eATP is 103 tot 104 keer hoger in concentratie dan in normale weefsels. Terwijl eATP functioneert als een boodschapper om purinerge signalering voor EMT-inductie te activeren, wordt het ook geïnternaliseerd door kankercellen door middel van upregulated macropinocytose, een specifiek type endocytose, om een breed scala aan biologische functies uit te voeren. Deze functies omvatten het leveren van energie aan ATP-vereisende biochemische reacties, het doneren van fosfaatgroepen tijdens signaaltransductie en het vergemakkelijken of versnellen van genexpressie als een transcriptionele cofactor. ATP is direct beschikbaar en de studie op kanker en andere gebieden zal ongetwijfeld toenemen. EATP-studie blijft echter in een vroeg stadium en onopgeloste vragen blijven onbeantwoord voordat de belangrijke en veelzijdige activiteiten van eATP en geïnternaliseerde intracellulaire ATP volledig kunnen worden ontrafeld.

De bijdragen van de laboratoria van deze auteurs aan deze vroege eATP-studies omvatten microscopische beeldvorming van niet-hydrolyseerbare fluorescerende ATP, gekoppeld aan fluorescentie dextrans met een hoog en laag molecuulgewicht, die dienen als macropinocytose en endocytose tracers, evenals verschillende endocytoseremmers, om het eATP-internalisatieproces te controleren en te karakteriseren. Deze beeldvormingsmodaliteit werd toegepast op tumorcellijnen en op immunodeficiënte muizen, xenogegrafeerd met menselijke kankertumoren, om eATP-internalisatie in vitro en in vivo te bestuderen. Dit artikel beschrijft deze in vitro en in vivo protocollen, met de nadruk op het modificeren en finetunen van assaycondities, zodat de macropinocytose-/endocytose-gemedieerde eATP-internalisatie assays met succes kunnen worden uitgevoerd in verschillende systemen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De opportunistische opname van intratumorale extracellulaire (dwz) voedingsstoffen is onlangs uitgeroepen tot een belangrijk kenmerk voor kankermetabolisme1. Een van deze belangrijke voedingsstoffen is ATP, omdat de concentratie van ieATP 103 en 104 keer hoger is dan die in normale weefsels, in het bereik van enkele honderden μM tot lage mM2,3,4,5. Als een belangrijk energie- en signaalmolecuul speelt ATP een centrale rol in het cellulaire metabolisme in kankerachtige en gezonde cellen6,7,8. Extracellulaire ATP is niet alleen betrokken bij de groei van kankercellen, maar bevordert ook de resistentie tegen geneesmiddelen9. Eerder niet-herkende functies van ATP, zoals hydrotrope activiteit, zijn onlangs geïdentificeerd, waardoor ATP-betrokkenheid bij ziekten zoals de ziekte van Alzheimer wordt geïmpliceerd10. Inderdaad, het lijkt erop dat ons begrip van ATP en zijn functies in kankercellen, gezonde cellen en andere zieke cellen verre van compleet is. Vanwege de instabiliteit van ATP en de hoge omloopsnelheden in cellen is het echter technisch een uitdaging om de beweging van ATP over het celmembraan en in de cel te volgen.

Om dit probleem aan te pakken en in de behoefte van dit onderzoeksgebied te voorzien, werd een methode ontwikkeld waarbij niet-hydrolyseerbare fluorescerende ATP (NHF-ATP) (Figuur 1) werd gebruikt als surrogaat om de internalisatie van ATP te visualiseren en de intracellulaire ruimtelijke lokalisatie van geïnternaliseerde ATP te observeren, zowel in vitro als in vivo11,12 . Van NHF-ATP is aangetoond dat het endogene ATP vervangt om ATP-beweging over dierlijke celmembranen te onderzoeken, zowel in kankercellijnen als in menselijk tumorweefsel xenogetransplanteerd op immunodeficiënte muizen11,12. Bovendien blokkeerde het toedienen van macropinocytoseremmers aan cellen eATP-internalisatie, wat suggereert dat intracellulaire opname van eATP een macropinocytotisch mechanismeomvat 9,11,12. Dit protocol maakt immunobased colabeling tegen celspecifieke eiwitten mogelijk en dus identificatie van welk celtype NHF-ATP internaliseert. Met behulp van in vivo tumor xenografts en hoge resolutie microscopie kan NHF-ATP ruimtelijk worden gevisualiseerd over het weefselmonster en zelfs binnen een enkele cel. Deze methoden maken ook kwantitatieve analyse mogelijk, zoals het percentage cellulaire opname, het aantal macropinocytotische blaasjes en internalisatiekinetiek. Dit artikel beschrijft in detail hoe NHF-ATP, alleen of samen met endocytose-tracer fluorescerende dextrans13,14,15,16, kan worden gebruikt in verschillende experimentele omgevingen om de internalisatie en intracellulaire lokalisatie van ATP te bestuderen, na internalisatie in cellen.

figure-introduction-1
Figuur 1: Structuren van niet-hydrolyseerbare fluorescerende ATP en tetramethylrhodamine gelabeld met hoog molecuulgewicht fluorescerend dextran. (A) Structuur van NHF-ATP. (B) Schematische weergave van HMWFD. Afkortingen: ATP = adenosinetrifosfaat; NHF-ATP = niet-hydrolyseerbare fluorescerende ATP; TMR = tetramethylrhodamine; HMWFD = fluorescerend dextran met hoog molecuulgewicht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hierin gerapporteerde procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de IACUC van Ohio University en met de NIH.

1. Selectie van niet-hydrolyseerbare fluorescerende ATP (NHF-ATP) en dextrans

  1. Selecteer een fluorofoor-geconjugeerde NHF-ATP (Figuur 1A) en endocytose tracers, hoge en lage moleculaire gewicht fluorescerende dextrans (TMR-HMWFD en TMR-LMWFD) (Figuur 1B), op basis van de gewenste emissiegolflengten (bijv. beeldvormingssysteem uitgerust met geschikte filters) en het specifieke endocytoseproces dat moet worden bestudeerd.

2. ATP-lokalisatiestudies, in vitro (figuur 2)

figure-protocol-1
Figuur 2: In vitro procedure om ATP internalisatie te onderzoeken. Schematische weergave van het protocol om de internalisatie van extracellulaire ATP in gekweekte kankercellen te visualiseren met behulp van fluorescentiemicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Celkweek en bereiding van cellen
    OPMERKING: Voer celkweek uit onder steriele omstandigheden in een weefselkweekkap.
    1. Bereid Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), dat 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS) en 1% (v/v) penicilline/streptomycine (hierna DMEM/FBS genoemd), steriele fosfaatbuffered saline (PBS) en 0,25% trypsine/ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) bevat, in een waterbad van 37 °C.
    2. Kweek menselijke kankercellen in DMEM/FBS in een 100 mm weefselkweekschaal. Houd de cellen in een incubator ingesteld op 37 °C met een 5% CO2-atmosfeer.
    3. Wanneer de cellen samenvloeiing bereiken, passeert u de cellen door eerst het kweekmedium te verwijderen. Spoel vervolgens de schaal af met 5 ml steriel PBS, verwijder de PBS en voeg 3 ml 0,25% trypsine toe. Incubeer bij 37 °C in een 5% CO2 atmosfeer gedurende 5 min.
    4. Haal het gerecht op en voeg vervolgens 6 ml DMEM / FBS toe om de trypsinisatie te stoppen. Breng de cellen in suspensie over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 800 × g om de cellen te pelleteren.
    5. Na centrifugeren, zuig het supernatant op en gebruik 10 ml DMEM / FBS om de celkorrel opnieuw op te suspenderen door pipetteren.
    6. Tel de celdichtheid en levensvatbaarheid met behulp van een hemocytometer. Gebruik DMEM/FBS om de celsuspensie te verdunnen tot een dichtheid van ~7,5 × 104 cellen/ml.
  2. Bereiding van coverslips en zaaicellen
    1. Was 12 mm coverslips met 70% ethanol en veeg ze voorzichtig af met delicate taakdoekjes. Steriliseer de coverslips en één tang via autoclaveren.
    2. Gebruik in een weefselkweekkap een tang om één afdekplaat in elke put van een 24-well tissuekweekplaat te plaatsen.
      OPMERKING: Later zal de coverslip, met cellen, rechtstreeks op een microscoopglaasje worden gemonteerd voor beeldvorming.
    3. Doseer 300 μL van de celsuspensie (cellen in DMEM/FBS), met een zaaidichtheid van ~2,5 × 104 cellen per put, in de 24-putplaat met de gesteriliseerde coverslips. Incubeer in steriele omstandigheden bij 37 °C met 5% CO 2-debiet.
  3. Uithongering van cellen
    1. Verwijder vierentwintig uur na het zaaien de DMEM/FBS uit elke put. Voeg onmiddellijk 300 μL voorgewarmde serumvrije DMEM toe aan elke put om de cellen gedurende 15-18 uur uit te hongeren om de opname van extracellulaire voedingsstoffen te induceren.
      OPMERKING: De hongerperiode van 15-18 uur is een kritische parameter.
  4. Voorbereiding van NHF-ATP en HMWFD/LMWFD oplossingen
    1. Gebruik een analytische balans om fluorescerend TMR-dextran (TMR-HMWFD, 1 mg/ml), een tracer voor het visualiseren van macropinosomen of NHF-ATP (10 μmol/L) in serumvrije DMEM in een microcentrifugebuis van 1,5 ml te wegen. Plaats de buizen, beschermd tegen licht, gedurende 15 minuten in een waterbad van 37 °C.
    2. Centrifugeer bij 12.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng het heldere supernatant voorzichtig over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml, waarbij eventuele pellets of vuil intact blijven om onverbrekelijke kristallen te verwijderen.
    3. Voeg de oplossingen uit stap 2.4.1 toe aan de cellen in elke put en incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 °C.
      OPMERKING: Als HMWFD- en NHF-ATP-oplossingen moeten worden gemengd voor co-incubatie met de cellen, bereidt u beide oplossingen voor op 2x de uiteindelijke concentraties. De oplossingen worden later gemengd in een verhouding van 1:1 om de uiteindelijke nauwkeurige werkconcentraties te bereiken. Vermijd licht omdat de reagentia lichtgevoelig zijn.
  5. Behandeling van cellen en fixatie
    1. Doseer in een verse 24-well plaat 500 μL voorverwarmde PBS in elk van de vijf putten.
    2. Pak na de celincubatie elke deklip voorzichtig op met een tang. Spoel elke coverslip door deze in 500 μL voorverwarmd PBS te dopen. Herhaal dit vijf keer met behulp van de vijf met PBS gevulde putten.
      OPMERKING: Het zacht wassen van cellen-op-coverslips is van cruciaal belang voor het succes van dit experiment.
    3. Tik na de laatste PBS-was op de coverslip op een delicaat taakdoekje om extra PBS te absorberen en breng de coverslip onmiddellijk over op koude (4 °C) 3,7% formaldehyde, vooraf geladen in een 24-well plaat. Bevestig de cellen gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
    4. Terwijl de cellen worden gefixeerd, reinigen microscoopglaasjes vooraf met 70% ethanol. Verwijder de afdekplaten uit de putjes en monteer ze op de platen met behulp van 5 μL waterig montagemedium met daarin de kernvlek 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), per coverslip. Dep overtollige PBS voorzichtig met een papieren handdoek of een delicaat taakdoekje.
  6. Fluorescentiemicroscopie en beeldverwerving
    1. Leg twee tot 24 uur na de bovenstaande stappen beelden vast van cellen en geïnternaliseerde HMWFD en / of NHF-ATP met behulp van een epifluorescentiebeeldvormingssysteem en software voor gegevensverzameling.
      OPMERKING: In deze subsectie worden stappen beschreven voor het verkrijgen van afbeeldingen met behulp van een Nikon NiU-microscoop, uitgerust met epifluorescentiebeeldvorming, en Nikon NIS Elements-software. Er kunnen echter andere vergelijkbare beeldvormingssystemen en acquisitiesoftware worden gebruikt. Volg de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.
      1. Plaats de dia op het podium van een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop in binoculaire modus. Open het beeldvormingsprogramma.
      2. Selecteer het 10x-objectief, pas het werkgebied aan om de focus te definiëren en scan de dia van links naar rechts op een kronkelige manier om de interessegebieden te identificeren.
        OPMERKING: Het identificeren van interessante regio's zal variëren tussen celtypen, waarbij sommige cellijnen / kankertypen verschillende en verschillende graden van TMR-HMWFD en / of NHF-ATP-opname vertonen.
      3. Selecteer het 40x-objectief en schakel over van de verrekijkermodus naar de beeldopnamemodus met behulp van de schakelaar op de microscoop.
      4. Klik op het pictogram Live Quality in het beeldvormingsprogramma om afbeeldingen te bekijken en vervolgens te verkrijgen.
      5. Definieer met behulp van het deelvenster Oc op de werkbalk Annotaties en metingen de belichtingsparameters voor elke filterkubus of fluorescerend kanaal.
        OPMERKING: Selecteer de juiste belichtingstijd voor elk kanaal, omdat de signaalintensiteiten anders zijn. Selecteer bijvoorbeeld een belichtingstijd van 200 ms voor DAPI, 2 s voor HMWFD en 4 s voor NHF-ATP. Zodra de belichtingstijd per kanaal is bepaald, gebruikt u deze instelling voor alle beelden, per kanaal, met verschillende behandeling of omstandigheden.
      6. Nadat de belichtingsinstellingen voor elk kanaal zijn ingesteld, gebruikt u de werkbalk voor meerkanaalsacquisitie om een 3-kanaalsafbeelding te verkrijgen met de gedefinieerde belichtingsinstellingen.
        OPMERKING: Beeldacquisitie via de meerkanaals ND-acquisitiemodus maakt automatische beeldopname mogelijk voor elk kanaal van hetzelfde gezichtsveld. De sluiter wordt automatisch gesloten tussen de veranderingen van het torentje.
      7. U kunt ook handmatig meerkanaalsafbeeldingen verkrijgen door te schakelen tussen filterkubussen, de belichtingstijd in te stellen, de sluiter te sluiten/openen tussen beeldacquisitie voor elk kanaal en elke afbeelding die voor afzonderlijke kanalen is gemaakt, over elkaar te leggen.
        OPMERKING: De ND-acquisitiemodus automatiseert dit proces en biedt samengevoegde afbeeldingen.
      8. Sla de afbeelding op als .nd2-bestand (In nikon elements-indeling worden metagegevens opgeslagen). Sla TIF-bestanden op, inclusief de samengevoegde kanaalafbeelding en afzonderlijke kanaalafbeeldingen.
        OPMERKING: TIF-bestanden kunnen worden gebruikt met een bredere selectie van softwaretoepassingen.
      9. Gebruik de functie Object Count op de werkbalk Analyse om het aantal NHF-ATP-, TMR-HMWFD- en/of TMR-LMWFD-positieve cellen op een opgeslagen .nd2-afbeeldingsbestand te tellen.
      10. Exporteer de gegevens naar een spreadsheet via het analyseprogramma.
  7. Kwantificering en analyse van gegevens
    1. Stel voor elke geteste aandoening 50 tot 100 cellen af voor kwantificering. Gebruik de data-analysesoftware (software die is opgenomen in het epifluorescentiebeeldvormingssysteem of andere software) en bereken het gemiddelde aantal fluorescerende blaasjes per cel.
    2. Gebruik geschikte statistische methoden om de gekwantificeerde resultaten te analyseren.

3. ATP-internalisatie in tumoren, ex vivo (Figuur 3)

figure-protocol-2
Figuur 3: In vivo procedure om ATP internalisatie te onderzoeken. Schematische weergave van het protocol om de internalisatie van extracellulaire ATP in tumor xenografts te visualiseren met behulp van cryosectie en fluorescentiemicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Voorbereiding van celculturen voor implantatie
    1. Kweek kankercellen tot 80% confluentie bij 37 °C in een kolf van 225 cm2, met DMEM aangevuld met FBS, tot een eindconcentratie van 10% (v/v) en penicilline/streptomycine bij 1% (v/v).
    2. Was de cellen twee keer met 10 ml PBS. Verwarm 0,25% trypsine/EDTA voor tot 37 °C. Voeg 8 ml trypsine/EDTA toe en incubeer bij 37 °C gedurende 2 minuten.
    3. Zodra de cellen zich beginnen los te maken van de bodem van de kolf, gebruikt u een steriele serologische pipet van 10 ml om 8 ml DMEM / FBS toe te voegen. Aspirateer twee keer om eventuele aanhangende cellen los te maken. Gebruik de pipet om de losgemaakte cellen uit de kolf over te brengen in een conische buis van 50 ml.
    4. Voeg 10 ml DMEM/FBS toe met een pipet van 10 ml en verzamel alle resterende drijvende cellen in dezelfde conische buis van 50 ml.
    5. Centrifugeer de celsuspensie bij 600 × g, 4 °C gedurende 4 minuten. Verwijder het supernatant en resuspend de cellen in 1 ml ijskoude PBS.
    6. Tel de celdichtheid met behulp van een hemocytometer. Houd de celsuspensie op ijs tijdens het tellen.
    7. Centrifugeer de celsuspensie bij 600 × g, 4 °C gedurende 4 minuten. Verwijder het supernatant en hang de cellen in ijskoud PBS zodanig op dat de celdichtheid 5 × 106 cellen per 100 μL PBS wordt. Breng de celsuspensie over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  2. Subcutane injectie van kankercellen voor xenograft tumor ontwikkeling
    1. Gebruik een latexvrije spuit (1 ml) met een precisienaald (27 G naald) voor injectie in kankercellen.
    2. Breng de celsuspensie (5 ×10 6 op 100 μL PBS) over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Trek de cellen in de spuit.
    3. Selecteer een injectieplaats op de flank van een immunodeficiënte (naakte) muis en reinig de huid voorzichtig met 75% ethanol. Veeg overtollige ethanol af met een delicate taakdoek.
    4. Voor subcutane injectie houdt u de naald in een hoek van ongeveer 10° ten opzichte van de huid. Steek de naaldpunt, schuine kant naar boven, net onder de huid, zodat slechts 1-2 mm van de naald zichtbaar is buiten de huid. Doseer de cellen uit de spuit langzaam gedurende ongeveer 10 s.
    5. Na het injecteren van het volledige volume, blijft u de naald 3-5 s op zijn plaats houden, trekt u de naald terug en gebruikt u een vinger om nog 3-5 seconden zachte maar stevige druk op de injectieplaats uit te oefenen om lekken van de geïnjecteerde inhoud te voorkomen.
    6. Monitor en meet tumorgroei met behulp van vernier remklauwen totdat de tumoren een volume van 200-500 mm bereiken3.
  3. Bereiding van HMWFD- en NHF-ATP-oplossingen voor gebruik na tumorresectie
    1. Los 300 μL van 16 mg/ml HMWFD op in serumvrij DMEM (kweekmedium), incubeer gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 12.000 × g zoals hierboven beschreven. Breng de oplossing over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    2. Voeg 40 μL NHF-ATP analoge bouillon (1 mM) toe aan 160 μL serumvrije DMEM om een 0,2 mM NHF-ATP-oplossing te bereiden.
  4. Voorbereiding van experimentele putten
    OPMERKING: Dit experimentele ontwerp zal de intracellulaire internalisatie van HMWFD + NHF-ATP testen, indicatief voor opname door macropinosomen.
    1. Bereid de putten als volgt voor: Put #1, Controle: 200 μL serumvrije DMEM; Nou #2, Controle: 100 μL van 16 mg/ml LMWFD + 100 μL serumvrije DMEM = 200 μL van 8 mg/ml LMWFD; Nou #3, Controle: 100 μL van 0,2 mM NHF-ATP + 100 μL serumvrije DMEM = 200 μL van 0,1 mM NHF-ATP; Nou #4; Experimenteel: 100 μL van 16 mg/ml HMWFD + 100 μL van 0,2mM NHF-ATP = 200 μL van 0,1 mM NHF-ATP en 8 mg/ml HMWFD.
  5. Bereiding van tumorweefsels
    1. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie of volgens het IACUC-goedgekeurde protocol.
    2. Gebruik een scalpel van maat 10 om de geïsoleerde tumoren te snijden met een dikte van ~ 500-1.000 μm.
    3. Incubeer de tumorschijfjes in serumvrije DMEM aangevuld met 100 μM NHF-ATP en/of 8 mg/ml H/LMWFD in microcentrifugebuizen gedurende 40 minuten bij 37 °C met 5% CO2-stroom.
      OPMERKING: Na incubatie zorgt het tumorweefselmetabolisme ervoor dat de kleur van het medium verandert.
    4. Spoel de weefsels in 37 °C voorverwarmd PBS (2 ml voor elke spoeling in een 24-well plaat).
    5. Breng het weefsel over op een nieuwe 24-well plaat met voorverwarmde verse PBS, spoel af en herhaal vier keer met zacht schudden.
  6. Cryo-embedding (het voorbereiden van bevroren weefselblokken)
    1. Bereid identificatielabels voor elke tumor voor die moet worden geoogst. Knip een stuk laboratoriumtape van 2 cm en vouw de kleefzijden in de lengte doormidden. Gebruik een markeerpen om de tag te labelen, bijvoorbeeld met een muis-/tumoridentificatienummer.
    2. Bereid inbeddingsmallen voor door roestvrijstalen weefselmallen rechtstreeks op droogijs te plaatsen.
      OPMERKING: Droogijs kan bevriezing, brandwonden en verstikking veroorzaken. Draag geïsoleerde handschoenen bij het hanteren van droogijs. Gebruik droogijs in een goed geventileerde ruimte. Bewaar droogijs niet in een goed afgesloten container. Bewaar in plaats daarvan in een container (zoals een piepschuimkoeler) die gas laat ontsnappen.
    3. Terwijl de schimmel afkoelt, plaatst u een kleine plas weefselbevriezingsmedium in een weefselkweekplaat van 10 mm. Zorg ervoor dat het volume voldoende is om het tumorweefsel dat zal worden geoogst onder te dompelen.
    4. Gebruik een geperforeerde lepel om het gereseceerde tumorweefsel op te scheppen en plaats het weefsel onmiddellijk in een vriesmedium, zodat het weefsel ondergedompeld is. Rol met behulp van de geperforeerde lepel het weefsel voorzichtig in het vriesmedium en zorg ervoor dat het medium alle weefseloppervlakken baadt.
    5. Verplaats het weefsel voorzichtig in de insluitvorm met het vriesmedium. Plaats de bijbehorende labeltag verticaal in het vriesmedium /de mal om op zijn plaats te bevriezen. Zorg ervoor dat het geschreven label zichtbaar is buiten het medium.
    6. Wanneer het bevriezen is voltooid (het vriesmedium wordt ondoorzichtig-wit), verwijdert u het weefselblok uit de mal, plaatst u het op droogijs en herhaalt u dit voor elke tumor. Bewaar de weefselblokken bij -80 °C gedurende enkele maanden vóór de cryosectioneringsprocedure.
  7. Bereiding van dia's van weefselmonsters
    1. Om de kans op het vinden van internalisatie-positieve cellen en het hebben van meer representatieve weefselgebieden te maximaliseren, verzamelt u seriële cryosecties bij -18 tot -20 °C met behulp van een cryostaat.
      1. Prechill cryostaatgereedschappen (mesje, scheermesje, antirolplaat, tissue chuck holder, paintbrush) en breng de tumorweefselblokken in evenwicht door ze in een cryostaatkamer bij -18 tot -20 °C te plaatsen. Stel de hoek van de bladhouder in op 5-10°. Snijd het weefselblok zo nodig voorzichtig bij met een scheermesje en monteer het op de chuckhouder met behulp van weefselbevriezingsmedium als "lijm".
      2. Vergrendel de klauwplaathouder in de verticale positie op de microtoomeenheid, die bij elke draai van de handslinger naar de ingestelde afstand (bijv. 10 μm) gaat. Plaats de antirolplaat om net boven de hoogte van het blad te rusten. Om te voorkomen dat het weefsel krult voordat u het microtoom opschuiven, schuift u de duim voorzichtig over de onderrand van het weefselblok.
      3. Naarmate het microtoom vordert en het weefselgedeelte op de metalen plaat valt, gebruikt u een penseel om het weefselgedeelte te begeleiden en het weefsel indien nodig uit te rollen.
      4. Beweeg de microscoopglaas over het weefselgedeelte zonder aan te raken, zodat het gedeelte naar de dia wordt aangetrokken.
        OPMERKING: Cryostat-messen (spraakmakend, wegwerpbaar) zijn extreem scherp en kunnen ernstig letsel veroorzaken. Wees voorzichtig bij het hanteren van messen en het bedienen van de cryostaat. Gebruik een mesbeschermer, indien beschikbaar. Een goede training is vereist.
      5. Snijd de tumor in secties van 10 μm dikte. Breng de gesneden delen onmiddellijk over op een positief geladen glazen microscoopglaasje.
        OPMERKING: Verzamel voor seriële secties eerst een 10 μm dik gedeelte in de linkerbovenhoek van elk van de acht positief geladen dia's. Breng de cryostaat door de daaropvolgende 100-200 μm weefsel en gooi het weefsel weg. Breng onmiddellijk alle gesneden secties over op glazen microscoopglaasjes.
      6. Verzamel vervolgens nog een 10 μm dik gedeelte, naast het eerder geplaatste weefselgedeelte, voor elk van de acht dia's. Herhaal dit seriële verzamelproces totdat elk van de acht dia's acht weefselsecties bevat, elk 100-200 μm uit elkaar. Bewaar de weefselsecties in het donker om de fluorescentie te behouden.
        OPMERKING: Weefselsecties op dia's kunnen gedurende enkele maanden in een diadoos bij -80 °C worden bewaard.
  8. Fixatie van weefselglaasjes
    1. KRITISCHE STAP: Fixeer de weefselsecties in 95% ethanol bij -18 tot -20 °C tot 5 min.
    2. Was het vaste gedeelte gedurende 5 minuten met PBS bij kamertemperatuur en monteer vervolgens de vaste tumorsecties onder een glazen afdekplaat met behulp van 10 μL van een waterig montagemedium met DAPI.
    3. Onderzoek twaalf tot 24 uur na montage de vaste tumorsecties door fluorescentiemicroscopie en verkrijg beelden, zoals beschreven voor de gekweekte cellen hierboven.
  9. Fluorescentiemicroscopie en beeldverwerving
    1. Identificeer interessante regio's en verkrijg afbeeldingen, zoals beschreven in paragraaf 2.6.
  10. Kwantificering en analyse van gegevens
    1. Kwantificeer de cellen en pas passende statistische analyses toe, zoals in punt 2.7.

4. ATP-internalisatie in tumoren, in vivo

  1. Celculturen voorbereiden voor implantatie zoals beschreven in rubriek 3.1.
  2. Subcutane injectie van kankercellen voor xenograft tumor ontwikkeling
    1. Genereer xenogetransplanteerde tumoren zoals beschreven in rubriek 3.2.
  3. ATP en/of dextran injectie in xenograft tumoren
    1. Bereid de behandelingsoplossingen van DMEM (medium) of 8 mg/ml HMWFD of LMWFD, met of zonder NHF-ATP (100 μM) in DMEM, zoals hierboven beschreven.
    2. Gebruik een spuit van 1 ml om 50 μL van één behandelingsoplossing op te vangen en injecteer de oplossing rechtstreeks in elke xenotransplantaattumor. Herhaal de procedure voor vier biologische replicaties van elke behandeling.
  4. Weefseloogst en cryo-inbedding
    1. Bereid identificatielabels voor elke tumor voor die moet worden geoogst. Knip een stuk laboratoriumtape van 2 cm en vouw de kleefzijden in de lengte doormidden. Gebruik een markeerpen om de tag te labelen, bijvoorbeeld met een muis-/tumoridentificatienummer.
    2. Ongeveer 5 minuten na de injectie, euthanaseer de muis door cervicale dislocatie of volgens het IACUC goedgekeurde protocol.
    3. Maak met behulp van een scalpel van maat 10 een incisie naast de tumor en ongeveer loodrecht op de richting van de naaldinjectie. Gebruik een tang en een chirurgische schaar om het tumorweefsel uit het omliggende weefsel te reseceren.
    4. Verdeel de tumor in twee tot vier stukken van 1 cm2, afhankelijk van de totale tumorgrootte.
    5. Bereid de insluitvormen voor en sluit het weefsel in, zoals hierboven beschreven in rubriek 3.6. Zorg ervoor dat de oogsttijd, van intratumorale dextran-injectie tot cryo-inbedding, niet meer dan 7-8 minuten is.
  5. Bereiding van dia's van weefselmonsters
    1. Verzamel seriële tumorsecties, zoals beschreven in rubriek 3.7.
  6. Fixatie van weefselglaasjes
    1. Fixeer het weefsel, zoals beschreven in rubriek 3.8.
  7. Fluorescentiemicroscopie en beeldverwerving
    1. Identificeer de interessante regio's en verkrijg afbeeldingen, zoals beschreven in paragraaf 2.6.
  8. Kwantificering en analyse van gegevens
    1. Kwantificeer de cellen en pas passende statistische analyses toe, zoals beschreven in punt 2.7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro studie
Intracellulaire internalisatie van NHF-ATP werd aangetoond door co-lokalisatie van NHF-ATP met HMWFD of LMWFD(figuur 4). Het succes van deze procedure hangt voornamelijk af van het gebruik van geschikte concentraties NHF-ATP en dextrans en van het bepalen van het juiste type of de juiste type(n) dextrans (poly-lysine vs. neutraal). Om bijvoorbeeld macropinocytose te onderzoeken, werd HMWFD gekozen omdat het alleen wordt geïnterna...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er werd een methode ontwikkeld voor ruimtelijke, temporele en kwantitatieve analyse van de cellulaire internalisatie van niet-hydrolyseerbare ATP. Deze methode is breed toepasbaar voor gebruik in diverse biologische systemen, waaronder verschillende tumorogene modellen, waarvoor we technische instructies en representatieve gegevens verstrekken. Om interpreteerbare gegevens te verkrijgen tijdens in vivo ATP-internalisatiestudies (sectie 4 van het protocol), is het van cruciaal belang om de experimentele tijd die ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryosectie werd ter plaatse uitgevoerd in de Ohio University Histopathology Core. Dit werk werd deels ondersteund door start-upfondsen (Ohio University College of Arts & Sciences) aan C Nielsen; NIH-subsidie R15 CA242177-01 en RSAC-toekenning aan X Chen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A549-cellen, menselijke longepitheel, carcinoomNationaal Kankerinstituutn/aGoedkopere bron
AcetonFisher ScientificS25904
Aluminiumfolie, ReynoldsGrainger6CHG6
Aqueous Montage Medium, ProLong Gold Anti-fade ReagensThermoFisherP36930
ATP analoogJena BiosciencesNK-101
Autoclaaf, sterilisatorGrainger33ZZ40
Blades, cryostat, hoog profielC. L. Sturkey, Inc.DT554550
Calipers, vernierGrainger4KU77
Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-vrijMillipore Sigma51651C-1000ML
Centrifuge, gekoeld met zwevende emmerrotorEppendorf5810R
ChloroformAcros Organics423555000
Conische buis, 15 mLVWR21008-216
Conische buis, 50 mLVWR21008-242
Dekglasjes, glas, 12 mmCorning2975-245
Cryostat, Leica CM1950Leica BiosystemsCM1950
Delicate task wipe, Kim WipesKimberly-Clark34155
Dextran, Lysine fixable, Hoog Moleculair Gewicht (HMW)InvitrogenD1818MW = 70.000, Tetramethylrhodamine
Dextran, Neutraal, Hoog Moleculair Gewicht (HMW)InvitrogenD1819
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-vrijFisher Scientific11885076
Droge ijsLokale leveringAangepast order
Epifluorescent beeldvormingssysteem, Nikon NiU en Nikon NIS Elements acquisitiesoftwareNikonAangepast order
EthanolFisher ScientificBP2818-4
Foetaal bovien serum (FBS)ThermoFisher16000044
Forceps, Dumont #7, gebogenFine Science Tools11274-20
Forceps, Dumont #5, rechtFine Science Tools11254-20
Handschoenen (klein, medium, groot)MicroflexN191, N192, N193
Handschoenen, MAPA Temp-Ice 700 Thermisch (voor het hanteren van droogijs)Fisher Scientific19-046-563
HemocytometerDaiggerEF16034F EA
Incubator, celcultuurEppendorfGalaxy 170 S
Labelling tapeFisher Scientific159015R
Markeerstift, Sharpie (ultra-fijn)Staples642736
Muizen, immuundeficiënt (Nu/J)Jackson Laboratory2019
Microcentrifuge, accuSpin Micro17Fisher Scientific13-100-675
Microcentrifgue buizen, Eppendorf buizen (1,5 mL)AxygenMCT-150-C
Microscoop dia doosFisher Scientific50-751-4983
Naald, 27 gaugeBecton-Dickinson752 0071
VerfkwastGrainger39AL12
PapierhanddoekenStaples33550
ParaformaldehydeAcros Organics416785000
Penicilline/StreptomycineGibco15140122
Geperforeerde lepel, 15 mm diameter, 135 mm lengteRoboz Surgical Instrument Co.RS-6162
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)Fisher ScientificBP3991
Pipet tips (10 µL)Fisher Scientific02-707-438
Pipet tips (200 µL)Fisher Scientific02-707-411
Pipet tips (1000 µL)Fisher Scientific02-707-403
Pipetten, serologisch (10 mL)VWR89130-910
Pipettor, Gilson P2DaiggerEF9930A
Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 µL, 20-200 µL, 200-1000 µL)DaiggerEF9931A
Platform shaker - orbitaal, tafelmodelCole-ParmerEW-51710-23
Positief geladen microscoopglaasjes, SuperfrostFisher Scientific12-550-15
Scalpel, maat 10, Surgical Design, Inc.Fisher Scientific22-079-707
Schaar, chirurgisch - scherp, gebogenFine Science Tools14005-12
Software voor beeldanalyse, Nikon ElementsNikonAangepast order
Software voor beeldanalyse, ImageJ (FIJI)National Institutes of Healthn/aOnline downloaden (gratis)
Specimen schijf 30 mm (chuck houder), cryostat accessoireLeica Biosystems14047740044
Kleurbak, 245 mm BioAssay DishCorning431111
Spuit, 1 ccBecton-Dickinson309623
Laboratorium tape, 19 mm breedFisher Scientific15-901-5R
TimerFisher Scientific14-649-17
Weefselkweekschaal, 100 x 15 mm diameterFisher Scientific08-757-100D
Weefselkweekflacon, 225 cm2ThermoFisher159933
Weefselkweekplaat, 24-putjesBecton-Dickinson353226
Weefsel inbedding mal, roestv

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
  2. Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 3, 25992008(2008).
  3. Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space. Interface Focus. 3 (3), 20120101(2013).
  4. Michaud, M., et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science. 334, 1573-1577 (2011).
  5. Wilhelm, K., et al. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).
  6. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
  7. Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 85-95 (2011).
  8. Chen, X., Qian, Y., Wu, S. The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept. Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).
  9. Wang, X., et al. Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase. Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).
  10. Patel, A., et al. ATP as a biological hydrotrope. Science. 356, 753-756 (2017).
  11. Qian, Y., et al. Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells. Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).
  12. Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms. Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).
  13. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
  14. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
  15. Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline. Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).
  16. Hoppe, H. C., et al. Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).
  17. Chaudry, I. H. Does ATP cross the cell plasma membrane. Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).
  18. Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).
  19. Chaudry, I. H., Baue, A. E. Further evidence for ATP uptake by rat tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).
  20. Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).
  21. Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes & Development. 26, 877-890 (2012).
  22. Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. ATP consumption promotes cancer metabolism. Cell. 143, 669-671 (2010).
  23. Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection. Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).
  24. Szendroedi, J., et al. Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes. PLoS Medicine. 4, 154(2007).
  25. Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyATP InternalizationMacropinocytosisHuman Tumor CellsTumor Xenograft MiceExtracellular ATPEndocytosis TracersFluorescent DextranEpifluorescence ImagingCryosectioning Procedure

Related Articles