Hyperbare zuurstof gebruiken om de stralingsgevoeligheid van menselijke U251-glioomcellen te verbeteren

Samenvatting

Dit protocol toont aan dat hyperbare zuurstof de proliferatieremming en apoptose van U251-glioomcellen die met röntgenbestraling zijn behandeld, kan versterken door de cellen in de G2/M-fase te blokkeren. Dit verbetert de stralingsgevoeligheid van menselijke glioomcellijnen.

Samenvatting

Het doel van deze studie was om het gebruik van hyperbare zuurstof te onderzoeken om de stralingsgevoeligheid van menselijke glioomcellen te verbeteren. Subgekweekte U251 menselijke glioomcellen werden willekeurig verdeeld in vier groepen: een onbehandelde controlegroep, cellen die alleen werden behandeld met hyperbare zuurstof (HBO), cellen die alleen met röntgenstraling (röntgenstraling) werden behandeld en cellen die werden behandeld met zowel HBO als röntgenstraling. Celmorfologie, celproliferatieactiviteit, celcyclusverdeling en apoptose werden in deze groepen geobserveerd om de rol van HBO bij het verbeteren van de stralingsgevoeligheid van glioomcellen te evalueren. Met de toename van de röntgendoses (0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy) nam de overlevingsfractie (SF) van glioomcellen geleidelijk af.

Significant lagere SF werd waargenomen voor de cellen die samen met de HBO- en röntgenfoto werden behandeld dan in de röntgengroep voor elke dosis (alle P < 0,05). De proliferatieremming was significant hoger in de HBO-groep in combinatie met röntgenstralen dan in de röntgengroep voor elke dosis (alle P < 0,05) voor de U251-cellijn. Het percentage cellen in de G2/M-fase was significant hoger in de HBO-groep in combinatie met röntgencellen (2 Gy) (26,70% ± 2,46%) en de HBO-groep (22,36% ± 0,91%) dan in de controlegroep (11,56% ± 2,01%) en röntgengroep (2 Gy) (10,35% ± 2,69%) (allemaal P < 0,05). U251-celapoptose was significant hoger in de HBO-groep in combinatie met röntgenstraling (2 Gy) dan in de HBO-groep, de röntgengroep (2 Gy) en de controlegroep (allemaal P < 0,05). We concluderen dat HBO de proliferatieremming en apoptose van glioom U251-cellen kan versterken door glioomcellen in de G2/M-fase te blokkeren en de stralingsgevoeligheid van U251-glioomcellen te verbeteren.

Inleiding

Glioom is een primaire intracraniële tumor die afkomstig is van gliacellen van het centrale zenuwstelsel¹. De huidige behandelingsstrategie voor glioom is chirurgie in combinatie met radiotherapie en chemotherapie. Postoperatieve radiotherapie voor glioom kan overlevingsvoordelen bieden (graad I bewijs), en vroege postoperatieve radiotherapie kan de overleving van de patiënt effectief verlengen (graad II bewijs)². Voor gliomen van hogere graad (graad III of IV), met name zeer kwaadaardig en invasief glioblastoom (graad III bewijs)³, moet postoperatieve radiotherapie zo vroeg mogelijk (<6 weken) worden uitgevoerd. Ondanks vroege interventie heeft glioom echter nog steeds een hoog recidiefpercentage en een slechte prognose na uitgebreide behandeling. Deze uitkomsten houden voornamelijk verband met de lage stralingsgevoeligheid van glioom. Factoren die verband houden met stralingsgevoeligheid van tumoren zijn onder meer de inherente stralingsgevoeligheid van tumorcellen, hypoxische of niet-hypoxische tumorcellen, het aandeel hypoxische tumorcellen en het vermogen van peritumoraal weefsel om stralingsschade te herstellen⁴.

Van deze factoren hebben hypoxische of niet-hypoxische tumorcellen en het aandeel hypoxische tumorcellen belangrijke effecten op de stralingsgevoeligheid van tumoren. Hyperbare zuurstof (HBO) kan de zuurstofopslag in het weefsel verbeteren door de zuurstofspanning in het weefsel en de zuurstofdiffusie in het bloed te verhogen. HBO kan ook een reeks gunstige biochemische, cytologische en fysiologische effecten veroorzaken⁵. HBO heeft bijvoorbeeld een duidelijk herstellend effect op door radiotherapie veroorzaakte stralingsschade. Hoewel wordt gemeld dat HBO in combinatie met radiotherapie of chemotherapie de klinische werkzaamheid van radiotherapie of chemotherapie voor glioom⁶ verbetert, is er veel discussie over hoe HBO alleen de groei van kwaadaardig glioom beïnvloedt. Ding et ^al.7 en Wang et ^al.8 toonden beide aan dat HBO de groei van in situ glioom bij muizen bevordert via mechanismen die de remming van apoptose en de bevordering van tumorangiogenese inhouden. Onder fysiologische omstandigheden wordt gemeld dat HBO tumorangiogenese bevordert door oxidatieve stress te induceren⁹.

Eén studie gaf echter aan dat kortdurende blootstelling aan HBO de proliferatie van tumorcellen bevordert, terwijl langdurige blootstelling aan HBO apoptose bevordert en de proliferatie remt¹⁰. Daarom zijn verdere studies nodig om te onderzoeken of HBO de groei van glioom bevordert of remt en hoe HBO in combinatie met radiotherapie of chemotherapie therapeutische sensibilisatie kan induceren. Er zijn met name mechanistische details nodig over hoe HBO de stralingsgevoeligheid van glioom verbetert. Om in deze studie te onderzoeken hoe HBO de stralingsgevoeligheid van menselijke U251-glioomcellen verbetert, gebruikten we HBO in combinatie met röntgenbestraling op de proliferatie van glioomcellen en observeerden we de effecten op de verdeling van de celcyclus en apoptose.

Protocol

Alle onderzoeksmethoden zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board en de Ethics Committee van het Second Hospital Affiliated to Lanzhou University en werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften.

1. Behandeling van glioomcellen

OPMERKING: De U251-glioomcellijn werd in dit experiment gebruikt.

1. U251 celcultuur
   1. Zaai U251-cellen in meerdere schalen met DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS) en kweek ze bij 37 °C met 5% CO₂.
   2. Bij het bereiken van 50%-60% confluentie, dissocieert u de cellen met behulp van trypsine-EDTA-oplossing (0,25%, zonder fenolrood) en laat u ze vervolgens groeien tot 80% confluentie.
2. Röntgenstraling
   1. Bedek de kweekplaten of kolven met een gelijkwaardige weefselcompensator met een dikte van maximaal 1 cm. Stel de cellen vervolgens bloot aan röntgenstraling die wordt geleverd door een lineaire versneller van 6 MV met een broncelafstand van 100 cm, aangepast door op de draaiknop op de afstandsbedieningskaart te klikken.
   2. Laat een natuurkundige de stralingsdosis meten en corrigeren voor verzwakking. Plaats ter controle kolven met media in een detector vóór de röntgenbestraling.
3. Hyperbare zuurstof (HBO)
   1. Desinfecteer de HBO-kamer door het ultraviolette licht 15 minuten aan te zetten en vervolgens gedurende 5 minuten te overspoelen met 0,02 MPa zuivere zuurstof.
   2. Nadat u de cellen in platen of kweekkolven in de kamer hebt geplaatst, klikt u op de drukregelaarknop op de besturingskaart buiten de kamer om de HBO-druk in de kamer te verhogen tot 0.2 MPa (2.0 ATA) binnen 30 minuten na bestraling.
   3. Klik dertig minuten later op de knop van de drukregelaar om de HBO-druk te verlagen naar het vorige drukniveau (0,1 MPpa). Behandel de kweekflesjes of -platen vervolgens 1x per dag gedurende 3 opeenvolgende dagen met HBO.

2. U251 glioomcellen in verschillende groepen

1. Stel een controlegroep, röntgengroep (2 Gy) en HBO in combinatie met röntgengroep (2 Gy) in voor het berekenen van de celgroeicurves.
2. Bereid eencellige suspensies van de glioom U251-cellen met de maximale groeisnelheden (zie stap 1.1.2). Pas de celdichtheid aan op 1 × 10⁶/ml door de cellen te tellen met behulp van een hemocytometerglaasje. Voeg vervolgens 1 ml van de celsuspensie toe aan een kweekfles (celdichtheid: 1 × 10⁶/fles) met drie afzonderlijke flessen voor elke groep.
3. Beoordeel de celmorfologie bij een vergroting van 100x met een helderveldmicroscoop om de aanhangende cellen te tellen op 24 uur, 48 uur en 72 uur cultuur.

3. Stralingsgevoeligheid van U251-glioomcellen (kloonvormingstest) binnen 30 minuten na HBO

1. Zaai de U251 eencellige suspensie door de putjes bij 5 × 10² cellen/ml in platen met 6 putjes en stel ze vervolgens bloot aan de aangegeven dosis röntgenstraling (0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy en 8 Gy), waarbij drie parallelle monsters worden onderzocht voor elke röntgendosis.
2. Voor de HBO in combinatie met röntgen (2 Gy) groep worden de cellen binnen 30 minuten na de HBO-behandeling blootgesteld aan röntgenbestraling. Na de behandeling worden de cellen gedurende 14 dagen gekweekt bij 37 °C met 5% CO₂ .
3. Nadat de klonen zichtbaar zijn, verwijder je het medium en was je de klonen 2x met PBS.
4. Fixeer de cellen gedurende 15 minuten in 1 ml 10% methanol voordat u gedurende 20 minuten kleurt met 1 ml 0,1% kristalviolet.
5. Was de cellen na het kleuren met 6 ml gedestilleerd water met behulp van een pipet en zuig vervolgens de kristalviolette oplossing op. Laat de cellen aan de lucht drogen.
6. Tel de klonen met een diameter tussen 0,3 mm en 1,0 mm onder een microscoop om er zeker van te zijn dat er >50 cellen per kloon zijn.
7. Bereken de overlevingsbreuk (SF) met behulp van vergelijking (1):
   SF = × 100% (1)
8. Genereer met behulp van statistische software een stralingsdosis-overlevingscurve op basis van het single-hit multitarget (SHMT)-model met behulp van vergelijking (2):
   S = 1 - (1 - )^N (2)
   Waarbij S = de overlevingskans; k = de gemiddelde dodelijke dosis (de dosis die een gemiddelde van één treffer per cel veroorzaakt); x = het aantal treffers per cel; N = het aantal doelen (het aantal treffers voor celdood).
9. Bereken de radiobiologische parameters, waaronder de gemiddelde letale dosis (D₀), quasi-drempeldosis (Dq), extrapolatiegetal (N), overlevingsfractie bij een bestralingsdosis van 2 Gy (SF₂), sensibilisatieverbeteringsratio (D₀) (SER = D₀ in de controlegroep/D₀ in de experimentele groep) en SER (Dq) (SER = Dq in de controlegroep/Dq in de experimentele groep) om het effect van HBO op de stralingsgevoeligheid van U251-glioomcellen te evalueren.
   Waarbij D₀ = de wederkerige waarde van de helling van het lineaire deel van de overlevingscurve (de dosis vermindert het overlevingspercentage met 63%)
   N = de waarde van het snijpunt gevormd door extrapolatie van het lineaire gedeelte om aan de ordinaat te voldoen (een weerspiegeling van het cellulaire vermogen om de door straling veroorzaakte schade te herstellen)
   Dq = de waarde van het snijpunt-projectieve punt op de abscis en het snijpunt gevormd door het trekken van een lijn door 1,0 op de ordinaat en evenwijdig aan de abscis om de extrapolatielijn te ontmoeten.

4. Test op het tellen van cellen om de proliferatie van U251-glioomcellen te beoordelen

1. Stel een controlegroep, een HBO-groep en groepen in die worden behandeld met röntgenfoto's (0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 8 Gy) alleen of in combinatie met HBO.
2. Pas de celdichtheid aan op 1 × 10⁴ cellen/ml met behulp van U251-cellen in eencellige suspensiespen.
3. Zaai de celsuspensies (100 μL, dichtheid: 1 × 10³/putje) in platen met 96 putjes (vijf putjes per groep). Voer de celtellingstest uit (zie de materiaaltabel) en bepaal vervolgens de optische dichtheid (OD) bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer na 48 uur kweken met het reagens.
4. Bereken de remmingssnelheid van de celproliferatie (IR) volgens vergelijking (3):
   IR = × 100% (3)

5. Detectie van apoptose van U251-glioomcellen

1. Instellen besturing, HBO, röntgen (2 Gy) en HBO in combinatie met röntgengroepen (2 Gy).
2. Verwijder het medium na kweek en was de cellen met 1x PBS.
3. Maak de cellen los met trypsine en deactiveer vervolgens de trypsine door DMEM toe te voegen wanneer een afgeronde celmorfologie onder een microscoop wordt waargenomen.
4. Breng de cellen over in een centrifugebuis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 × g.
5. Gooi het supernatant weg, voeg 3 ml 1x PBS toe aan de pellet en pipetteer voorzichtig om de cellen opnieuw te suspenderen.
6. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 200 × g gedurende 5 minuten. Zuig vervolgens het bovenstaande PBS op en was de cellen 2x voordat u ze opnieuw suspendeert door voorzichtig te pipetteren in 50 μl bindingsbuffer.
7. Voeg 5 μL annexine V-FITC toe aan de cellen bij 4 °C en incubeer de cellen in het donker bij 4 °C gedurende 15 minuten alvorens 400 μL Binding Buffer toe te voegen. Breng het mengsel over in een flowcytometriebuis met 5 μl propidiumjodide (PI) kleurstofoplossing (10 mg/ml). Detecteer apoptotische cellen 5 minuten later door middel van flowcytometrie¹¹.
8. Neem rode fluorescentie op bij de excitatiegolf van 488 nm, voer ze in een computer in om het percentage van elke celcyclus in 5.000 cellen te analyseren en druk vervolgens de pieken van apoptotische cellen af.
9. Verzamel rode en groene fluorescentie door annexine V en PI dubbel te labelen, voer ze in de computer in om te analyseren en druk vervolgens de puntplot af.

6. Detectie van de verdeling van de U251-glioomcelcyclus

1. Was de bovengenoemde cellen 2x met 1 ml PBS voordat u ze met trypsine behandelt.
2. Wanneer een afgeronde celmorfologie wordt gedetecteerd door lichtmicroscopie, voeg dan DMEM toe dat 10% FBS bevat.
3. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 200 × g bij kamertemperatuur.
4. Verwijder het bovenstaande en suspendeer deze cellen opnieuw in 1 ml PBS voordat u voorgekoelde 75% ethanoloplossing toevoegt.
5. Incubeer het mengsel gedurende ten minste 4 uur of een nacht bij -20 °C.
6. Was de cellen 2x met ijskoude PBS en 180 μL EDTA (0,1 mM, 3,7 mg EDTA + 100 ml PBS), 20 μL RNase A (10 mg/ml), 35 μL Triton X-100 (2%, 2 ml Triton + 98 ml FBS),en 96,5 μL PBS. Voeg vervolgens 17,5 μL PI-oplossing (1 mg/ml) toe.
7. Incubeer het mengsel gedurende 10 minuten bij 4 °C in het donker.
8. Was de cellen in 200 μL PBS en plaats ze vervolgens in een flowcytometer om de verdeling van de celcyclus te beoordelen, zoals eerder beschreven¹².
9. Gebruik de flowcytometer in dual-laser, driedimensionale ruimte, excitatiemodus met een spotgrootte van 22 μm x 66 μm en 13 μm x 66 μm. Gebruik een flowroom van 430 μm x 180 μm, 300-1.100 nm spectrum, ≤100 MESF-detecteerbaarheid en CV <2% resolutie. Stel de cellen vervolgens bloot aan excitatielicht van 488 nm en detecteer en meet de fluorescentiesignalen met instrumentsoftware om de celcyclusverdeling te bepalen¹³.
10. Bepaal de DNA-inhoud en analyseer vervolgens op basis van de DNA-inhoud de celcyclus.

7. Statistische analyse

1. Statistische analyses uitvoeren.
2. Presenteer de gegevens als gemiddelde ± standaarddeviatie.
3. Gebruik een t-toets van de student om de groepen te vergelijken, met statistische significantie ingesteld als P < 0,05.

Resultaten

Cultuur van U251 glioomcellen
U251-glioomcellen hadden 24 uur tot 48 uur na kweek in DMEM een spoelvormige vorm en waren aanhangend. Deze cellen werden gebruikt voor verder onderzoek (Figuur 1).

Morfologie en telling van glioomcellen
Het celgetal voor de U251-glioomcellen in de HBO-groep in combinatie met röntgenstraling (2 Gy) was significant lager dan die voor de röntgengroep (2 Gy) na 24 ...

Discussie

De glioomcellijn U251 is een van de meest klassieke menselijke glioomcellijnen en wordt in veel onderzoeken veel gebruikt als glioommodel.

Effecten van HBO op de proliferatie van U251-glioomcellen
HBO verwijst meestal naar het inademen van zuivere zuurstof (100% zuurstofconcentratie) in een afgesloten kamer met een druk die 1,5-3 keer hoger is dan de normale atmosferische druk, wat het zuurstofgehalte in microvasculair plasma kan verhogen

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Binding Buffer	Dickinson and Company	RH10 9RR
CCK-8 test kit	DOJINDO	NJ	Celtellingstest
CELL FIT			celcyclusanalyse (DNA-gehalte)
CELLQUEST			apoptotische celanalyse
DMEM en Annexin V-FITC	Gibco BRL
flow cytometer	Dickinson
Glioma U251 en U87-cellijn	Shanghai Institute of Cell Biology
hyperbare zuurstofkamer	Hongyuan Institute
medische lineaire versneller	Elekta Limited Company
microplaatlezer
MOD FITLT formac v1.01			celanalyse--celcyclusfase
trypsine	Hyclone Laboratories Inc