Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van monsterrasters bij temperaturen tot 70 °C, voorafgaand aan het invriezen van de duik voor cryo-EM-experimenten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Voorbereiding van hoge temperatuur monsterroosters voor Cryo-EM
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De monsterrasters voor cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) experimenten worden meestal voorbereid bij een temperatuur die optimaal is voor de opslag van biologische monsters, meestal bij 4 °C en soms bij kamertemperatuur. Onlangs ontdekten we dat de eiwitstructuur die bij lage temperatuur wordt opgelost, mogelijk niet functioneel relevant is, met name voor eiwitten uit thermofiele archaea. Er werd een procedure ontwikkeld om eiwitmonsters bij hogere temperaturen (tot 70 °C) voor cryo-EM-analyse voor te bereiden. We toonden aan dat de structuren van monsters die bij hogere temperaturen worden bereid, functioneel relevant en temperatuurafhankelijk zijn. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van monsterroosters bij hoge temperatuur, met 55 °C als voorbeeld. Het experiment maakte gebruik van een verglazingsapparaat dat was aangepast met behulp van een extra centrifugebuis en monsters werden geïncubeerd bij 55 °C. De gedetailleerde procedures werden verfijnd om dampcondensatie te minimaliseren en een dunne laag ijs op het rooster te verkrijgen. Voorbeelden van succesvolle en mislukte experimenten worden gegeven.
Inleiding
De cryo-EM-technologie voor het oplossen van de structuren van eiwitcomplexen is blijven verbeteren, met name in de richting van het verkrijgen van structuren met hoge resolutie 1,2. In de tussentijd is het landschap van de toepassing ervan ook uitgebreid door de monsteromstandigheden te variëren, zoals pH of liganden voorafgaand aan het vitrificatieproces3, waarbij monsterroosters worden voorbereid, gevolgd door dompelbevriezing 4,5. Een andere belangrijke voorwaarde is de temperatuur. Hoewel cryo-EM-experimenten, zoals röntgenkristallografie, worden uitgevoerd bij lage temperaturen, weerspiegelt de structuur die door cryo-EM wordt opgelost de structuur in de oplossingstoestand voorafgaand aan vitrificatie. Tot voor kort gebruikten de meeste cryo-EM-onderzoeken met enkelvoudige deeltjesanalyse (SPA) monsters die op ijs worden bewaard (d.w.z. bij 4 °C) voorafgaand aan vitrificatie6, hoewel een aantal studies monsters gebruiken bij ongeveer kamertemperatuur 7,8,9,10 of zo hoog als 42 °C11. In een recent rapport voerden we temperatuurafhankelijke studies uit van het enzym ketolzuurreductoisomerase (KARI) van het thermofiele archaeon Sulfolobus solfataricus (Sso) bij zes verschillende temperaturen van 4 °C tot 70 °C12. Onze studies suggereren dat het belangrijk is om monsterrasters voor te bereiden op functioneel relevante temperaturen en dat cryo-EM de enige structurele methode is die praktisch haalbaar is voor het oplossen van de structuur van hetzelfde eiwitcomplex bij meerdere temperaturen.
De grootste moeilijkheid voor vitrificatie bij hoge temperaturen is het minimaliseren van dampcondensatie en het bereiken van dun ijs. Hier rapporteren we het gedetailleerde protocol dat wordt gebruikt voor het voorbereiden van monsterroosters bij hoge temperaturen in onze eerdere studie van de Sso-KARI 12. We gaan ervan uit dat de lezers of kijkers al ervaring hebben met de algemene monstervoorbereiding en gegevensverwerkingsprocedures voor cryo-EM-experimenten en benadrukken de aspecten die relevant zijn voor hoge temperaturen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Dit protocol heeft tot doel een gemodificeerd commercieel verglazingsapparaat te gebruiken om de cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) monsters voor te bereiden bij specifieke temperaturen, vooral hoger dan 37 °C. De algemene experimentele opzet is weergegeven in figuur 1. Het protocol gebruikt 55 °C als voorbeeld. Voor de specifieke omstandigheden bij andere temperaturen wordt verwezen naar aanvullende tabel 2 in referentie12.
1. Bereiding van het verglazingsapparaat
- Maak een gat van 1 cm in een centrifugebuis van 50 ml aan het gesloten uiteinde.
- Plaats de buis in de vitrificatiekamer bij de ultrasone wateruitlaat, zoals weergegeven in figuur 2.
OPMERKING: Het doel is om watercondensatie te minimaliseren door waterdamp door de buis naar de warmtewisselaar te leiden voordat deze de hele kamer bereikt. - Stel de temperatuur van het vitrificatieapparaat in op de gespecificeerde temperatuur (bv. 55 °C, zoals weergegeven in figuur 3) en laat de vitrificatie-apparaatkamer tot 55 °C en 100% relatieve vochtigheid bereiken. Laat het minstens een half uur staan om de omstandigheden te stabiliseren voordat u met het experiment begint.
2. Het monster en de gereedschappen opwarmen
- Plaats het waterbad op een kookplaat en zet de kookplaat op de gewenste temperatuur (hier 55 °C). Controleer met een thermometer of het water 55 °C bereikt.
- Incubeer het monster in het waterbad en verwarm de pipetpunt aan de rand van de kookplaat gedurende 2 minuten of langer voor het blotting-experiment.
OPMERKING: De hoogste temperatuurinstelling voor de vitrificatie-apparaatkamer is 60 °C. Om roosters met een hogere temperatuur voor cyro-EM-experimenten voor te bereiden (bv. 70 °C), wordt het monster geïncubeerd in het waterbad bij 80 °C en wordt het gemiddelde tussen de monstertemperatuur en de temperatuur van het verglazingsapparaat geschat op de werkelijke temperatuur van het monster op het rooster (70 °C in dit geval). Zie het gedeelte Discussie voor meer informatie en beperkingen van deze schatting.
3. Voorbereiding op het vloeiexperiment
- Gloeiafvoer een gatvormig koolstofondersteund raster bij 25 mA gedurende 30 s, of een alternatief voor de waarden afhankelijk van het gebruikte apparaat.
- Incubeer het pincet met het rooster in het vitrificatieapparaat gedurende 2 minuten of langer.
- Vul de ethaancontainer met ethaan volgens standaardprocedures. Laat het ethaan niet overlopen.
OPMERKING: Deze stap duurt ongeveer 10 minuten en moet onmiddellijk worden gevolgd met het blotting-experiment om bevriezing te voorkomen. - Plaats het vitrificatiefilterpapier niet eerder dan 5 minuten voor het vloeiexperiment in de vitrificatiekamer.
OPMERKING: Als u het filterpapier te vroeg in de kamer plaatst, wordt het te nat.
4. Blotting experiment
OPMERKING: Wanneer u het rooster vasthoudt, moet u ervoor zorgen dat het rooster stabiel is en dat er een minimaal contactoppervlak is met het pincet (figuur 4). Dit wordt gedaan om de beste koelefficiëntie van ethaan te behouden en om niet-glasachtig ijs te vermijden.
- Gebruik een pipetpunt om 7-9 μL van het monster op het rooster aan te brengen. Wacht vervolgens op 1-2 s, dep 1-1,5 s en dompel het monster snel in vloeibaar ethaan.
- Breng het rooster over van vloeibaar ethaan naar de cryobox, die wordt opgeslagen in vloeibare stikstof.
OPMERKING: Deze stap moet zeer zorgvuldig worden uitgevoerd omdat het pincet nog steeds heet is, dus de hele koeltank zit op dit moment vol damp.
5. Kwaliteitscontrole voor de roosters
- Knip de rasters en upload ze naar een cryo-EM-instrument.
- Gebruik het beeldscherm van het cryo-EM-instrument en de lage dosisfunctie van de software om de ijsconditie op het rooster en de verdeling van het monster op het rooster te screenen.
OPMERKING: Vaak zijn de roosters erg droog of is de ijslaag te dik. Het slagingspercentage van de roosters die bij hoge temperaturen worden bereid, is aanzienlijk lager dan dat bij kamertemperatuur of 4 °C. Representatieve resultaten van goede rasters en niet-bevredigende rasters worden weergegeven in de volgende sectie. - Als de kwaliteit van het resulterende raster niet goed is, herhaal dan het proces van rastervoorbereiding met verschillende omstandigheden (zoals wachttijd, blotting-tijd, enz.). Als de kwaliteit van het resulterende raster goed is, herhaalt u dezelfde stappen om rasters met een andere temperatuur te maken.
6. Gegevensverzameling
- Breng de roosters van goede kwaliteit over naar een cryo-EM-instrument met hoge resolutie.
- Voer gegevensverzameling en gegevensanalyses uit volgens vastgestelde procedures.
OPMERKING: Zoals getoond in onze vorige publicatie, wordt de resolutie van de structuur niet beïnvloed door de hoge temperatuur12.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het overzicht van de lage vergroting is weergegeven in figuur 5A,B. Paneel A is een voorbeeld van een succesvol raster. Er is een ijsgradiënt van linksboven (dikker) naar rechtsonder (dunner of leeg). Zo'n raster maakt het gemakkelijker om een geschikte dikte van de ijslaag in het middengebied te vinden die geschikt is voor gegevensverzameling, zoals de blauwe en groene dozen. Het rooster B is te droog. De vierkanten in het raster hebben een helder contrast, wat betekent dat...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Zorg er in stap 1 van het protocol voor dat de centrifugebuis goed is geïnstalleerd en niet valt wanneer het experiment aan de gang is. Vanwege de accumulatie van een groot aantal waterdruppels in de kamer, die de adsorptiecapaciteit van het filterpapier kunnen veranderen, wordt aanbevolen dat de totale tijd van het experiment niet langer mag zijn dan 30 minuten nadat de vitrificatieapparaatkamer de evenwichtstemperatuur heeft bereikt. Als de bedrijfstijd langer is dan 30 minuten, moet de operator het filterpapier vervan...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken Dr. Hervé Remigy van Thermo Fisher Scientific voor nuttig advies. De cryo-EM experimenten werden uitgevoerd in de Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). ASCEM wordt ondersteund door Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) en Taiwan Protein Project (subsidienr. AS-KPQ-109-TPP2). De auteurs bedanken ook mevrouw Hui-Ju Huang voor de hulp bij de monstervoorbereiding.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Falcon tube | Falcon | 352070 | grootte: 50 mL |
| Filter papier | Ted Pella | 47000-100 | Ø55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Leica | waterbad | |
| K100X | Electron Microscopy Sciences | glow discharge | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu raster | Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | beeldvorming met lage dosis |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Vitrobot Tweezer | Ted Pella | 47000-500 |
Referenties
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al. Use of Cryo-EM to uncover structural bases of pH effect and cofactor bi-specificity of ketol-acid reductoisomerase. Journal of the American Chemical Society. 141, 6136-6140 (2019).
- Cabra, V., Samsó, M. Do's and don'ts of cryo-electron microscopy: A primer on sample preparation and high quality data collection for macromolecular 3D reconstruction. Journal of Visualized Experiments. (95), e52311(2015).
- Klebl, D. P., et al. Need for speed: Examining protein behavior during CryoEM grid preparation at different timescales. Structure. 28 (11), 1238-1248 (2020).
- Passmore, L. A., Russo, C. Specimen preparation for high resolution cryo-EM. J. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
- Laughlin, T. G., Bayne, A. N., Trempe, J. -F., Savage, D. F., Davies, K. M. Structure of the complex I-like molecule NDH of oxygenic photosynthesis. Nature. 566, 411-414 (2019).
- Gao, Y., et al. Structures and operating principles of the replisome. Science. 363, (2019).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. -J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364, 355-362 (2019).
- Chen, B., et al. Structural dynamics of ribosome subunit association studied by mixing-spraying time-resolved cryogenic electron microscopy. Structure. 23, 1097-1105 (2015).
- Singh, A. K., et al. Structural basis of temperature sensation by the TRP channel TRPV3. Nature Structure and Molecular Biology. 26, 994-998 (2019).
- Chen, C. Y., Chang, Y. C., Lin, B. L., Huang, C. H., Tsai, M. D. Temperature-resolved cryo-EM uncovers structural bases of temperature-dependent enzyme functions. Journal of the American Chemical Society. 141, 19983-19987 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
