1. Teststicks voorbereiden
- Nadat alle behandelingsprocessen zijn voltooid, snijdt u droog hout in teststokken tot de grootte 2 mm x 4 mm x 20 mm (figuur 1). Luchtdrogen blijft aan een constant gewicht, onder laboratoriumomstandigheden. Gebruik ten minste 5 replica's van elk hout dat wordt getest.

Figuur 1: Teststicks die worden gebruikt in kortdurende laboratoriumtests om de voersnelheid van gribbels te beoordelen. Testhouten sticks van 2 mm x 4 mm x 20 mm. Van links naar rechts: ekki, terpentijn, tamme kastanje en beukenhout en grove dennen spinthout. Schaalbalk 4 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Vacuüm impregneren
- Plaats na de houtbereiding (d.w.z. snijden en behandelen, indien van toepassing), de sticks onder een gaas in een voedselveilige plastic container, in de vacuümsiccator en vervang het deksel zodat er een strakke afdichting is, vergemakkelijkt door een coating van vacuümvet (figuur 2).
- Bevestig een driewegklep tussen de buis die de exsiccator en de pomp verbindt, met een derde buis die naar open lucht leidt (figuur 2). Zorg ervoor dat de driewegklep is afgesloten voor de lucht en laat de pomp draaien om een vacuüm van -0,75 tot -1,0 bar in de vacuümsiccator te bereiken en houd dit vacuüm 45 minuten - 1 uur vast.
- Dompel het open uiteinde van de derde buis onder in een container met zeewater. Schakel de pomp uit en sluit de klep die naar de pomp leidt en open vervolgens langzaam de klep totdat zeewater door het vacuüm in de exsiccator wordt getrokken. Laat het water stromen totdat het de plastic container vult, boven het niveau van het gaas.
- Trek vervolgens de buis terug uit het zeewater in de container en laat lucht binnen, totdat de exsiccator terugkeert naar de atmosferische druk. Houd de stokjes onder het gaas totdat ze naar de bodem van de plastic container zinken.

Figuur 2: Apparatuur die wordt gebruikt om houtstokken met zeewater te zuigen, ter voorbereiding op het voeren aan gribbles tijdens een laboratoriumvoedingstest. A) Vacuüm exsiccator; B) Pomp; C) Manometer voor de vacuümsiccator; D) De driewegklep die leidt naar de vacuümsiccator, pomp en naar open lucht of zeewater (oranje buis). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Uitlogend hout
- Dompel met zeewater verzadigde teststicks onder in zeewater in buizen van 50 ml (figuur 3). Vervang water regelmatig gedurende een periode van 20 dagen.
OPMERKING: Het uitlogingsproces is van toepassing op elk experimenteel hout dat wordt getest, inclusief behandeld of natuurlijk hout.

Figuur 3: Percolaat uit houten stokken voor bereiding voor het voeren aan gribbles tijdens een laboratoriumvoedingstest. Hout dat volledig werd ondergedompeld in zeewater in een Falcon-buis van 50 ml, met regelmatige waterverversing (1-3 dagen), produceerde duidelijk gekleurd percolaat. Van links naar rechts percolaat uit kernhout van; tamme kastanje, terpentijn, ekki en beuken en grove dennen spinthout. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Gribble extraheren
- Haal individuele exemplaren van gribble uit een aangetast houtblok. Gebruik een fijne tang en een dunne (maat 000/0,4 mm of kleiner) kwast. Pel voorzichtig al het hout dat het gribblehol bedekt met de tang
OPMERKING: Holen bevinden zich op het oppervlak van hout en zijn te herkennen aan kleine gaatjes (figuur 4).
- Zodra gribble is blootgesteld, gebruik je een penseel om voorzichtig individuen van onderaf op te pakken en af te zetten in een petrischaal gevuld met zeewater. Controleer gribble onder een microscoop om soorten te identificeren en om er zeker van te zijn dat er geen schade is veroorzaakt tijdens het extraheren.
OPMERKING: Het verslaan van pleopoden is een teken van vitaliteit.
- Gooi alle vrouwtjes die eieren broeden weg, omdat gravid vrouwtjes een verminderde voedingscapaciteit hebben.

Figuur 4: Afbeelding van een gribblehol met twee typische ventilatiegaten. L. quadripunctata hol op een stok van Radiata dennenhout, afmeting 2 mm x 4 mm x 20 mm. Naast de ingang van het hol zijn twee kleinere ventilatiegaten te zien. Schaalbalk 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Limnoria quadripunctata identificeren
- Identificeer Limnoria quadripunctata onder een stereomicroscoop door de vier verschillende knobbeltjes, gerangschikt in een vierkant patroon, op het pleotelson van het dier, naast een X-vormige carina op het vijfde pleoniet19 (figuur 5).

Figuur 5: Limnoria quadripunctata identificerende kenmerken. Afbeelding van dorsaal oppervlak Limnoria quadripunctata, genomen op een stereomicroscoop bij x20 vergroting. Identificerende kenmerken weergegeven door rode pijl - geeft de X-vormige carina en blauwe pijl aan - duidt op vier knobbeltjes op pleotelson. Schaalbalk 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Putplaten bereiden
- Plaats in meerputplaten met putten met een diameter van 20 mm één teststick en 5 ml ongefilterd zeewater, tussen 32-35 PSU, per put (figuur 6).
- Plaats behandelingen/houtsoorten systematisch door de putplaat, zodat elke houtsoort minstens één keer per plaat wordt weergegeven. Voeg één gribbel per put toe.
OPMERKING: De temperatuur moet in een incubator stabiel worden gehouden bij 20 °C ± 2 °C voor de soort L. quadripunctata, andere soorten Limnoria kunnen worden gebruikt met aanpassingen aan de temperatuur die zijn aangepast aan de specifieke soort.
- Houd platen in constante donkere omstandigheden, omdat de fotoperiode geen effect heeft op de voersnelheid van de gribble15.

Figuur 6: Experimentele opstelling voor gribble feeding assay. Een voorbeeld van een 12 multi-well plaat die wordt gebruikt in het laboratorium testen van de voersnelheid van gribble. Elke put bevat 5 ml zeewater en één teststick (20 mm x 4 mm x 2 mm) van verschillende houtsoorten; Grove dennen spinthout en ekki, beuk, tamme kastanje en terpentijn kernhout. Schaalbalk 20 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Fecale pellets verzamelen en tellen en vitaliteit beoordelen.
- Verwijder tweemaal per week de teststick en elke gribble (één per put) van de putplaat en plaats deze in een vers voorbereide putplaat (met 5 ml zeewater per put [32-35 PSU, 18-22 °C]).
- Gebruik een verfkwast om eventuele fecale pellets voorzichtig van de stok af te borstelen voordat u ze overbrengt en bewaar de fecale pellets in de oorspronkelijke put.
OPMERKING: Voordat de gribble naar een verse putplaat wordt overgebracht, kan de vitaliteit worden beoordeeld op een schaal van 1-5; 1= dood, 2 = passief, niet op het hout, 3 = actief zwemmen of pleopoden slaan, niet op het hout, 4 = kruipen op het oppervlak van het hout, 5 = ingegraven in het hout.
- Beeldverwerking
- Gebruik een fijne verfkwast om eventuele klonten te scheiden, zodat individuele pellets zichtbaar zijn en borstel pellets weg van de randen van de put. Maak een gedetailleerde foto onder een stereomicroscoop, bij vergroting x4 en upload naar een computer (figuur 7).
OPMERKING: Zorg ervoor dat de pellets scherp zijn en dat de achtergrond uniform is, zonder schaduwen of lichtreflecties op het wateroppervlak.

Figuur 7: Afbeelding van gribble fecale pellets. L. quadripunctata fecale pellets (kleine, cilindrische, bruine pellets) van het voeden met Radiata dennenhout in één put van een multi-well plaat. Genomen bij x4 vergroting. Beelden voorafgaand aan manipulatie voor beeldanalyse (zie figuur 7). A) Voorbeeld van een geschikte afbeelding die kan worden gebruikt voor geautomatiseerd tellen in ImageJ. Pellets zijn voldoende verspreid en weg van de randen van de put. De put is gecentreerd en er zijn geen obstakels of reflecties. B) Een voorbeeld van een afbeelding die niet geschikt is voor beeldanalyse. De put is uit het midden en snijdt de onderste helft af. Blauwe (gestippelde) cirkel toont lichtreflectie van het wateroppervlak. Oranje (vaste) cirkel toont pellets die te dicht op elkaar en te dicht bij de rand van de put zijn samengeklonterd. Rode (onderbroken) cirkel toont een houtsnipper die niet is verwijderd. Schaalbalk 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Proces om fecale pellettelling te genereren met behulp van ImageJ.
- Download ImageJ (nieuwste versie vanaf 03/08/21, 1.8.0_172) van https://imagej.nih.gov/ij/download.html of voer uit vanuit de browser van de computer.
- Upload een stapel afbeeldingen door te slepen en neer te zetten of door Bestand | | importeren | van de afbeeldingsreeks Bladeren. Wijzig geen parameters en selecteer oke.
- Gebruik vervolgens het cirkelgereedschap om het onderste gedeelte van de put met de fecale pellets te selecteren. Verwijder de randen van het putje en selecteer Bewerken | Helder buiten. Maak de afbeelding binair, selecteer Proces | Binair maken.
- Kalibreren door Analyse | te selecteren Stel schaal in en kies het aantal pixels per millimeter voor de afbeelding (bijvoorbeeld 10 pixels = 1 mm). Tel de pellets, selecteer Analyse | Analyseer deeltjes.
- Selecteer in het vak naast Grootte (eenheid2) een lagere drempel die gelijk is aan de kleinste maat pellet, met behulp van de eenheidsschaal die eerder is ingesteld (bijvoorbeeld als 10 pixels = 1 mm en de kleinste pellet 0,5 mm is, kiest u 5-oneindig).
- Selecteer in de vervolgkeuzelijst Weergeven de optie Contouren en schakel vervolgens Samenvatten in en druk op OK (figuur 8).
OPMERKING: Meer informatie is te vinden op https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/index.html


Figuur 8: Een stroomdiagram van het proces dat in ImageJ wordt gebruikt om fecale pellets te tellen. A) Een afbeeldingsreeks importeren op het tabblad Bestand van AfbeeldingJ. B) De bladerknop in het dialoogvenster 'Afbeeldingsreeks importeren' om een reeks afbeeldingen van een lokaal apparaat te importeren. C) Gebruik het cirkelgereedschap om een gebied met fecale pellets te selecteren D) Wis de knop Buitenkant in het tabblad Bewerken om buiten het geselecteerde gebied te verwijderen. E) Binaire knop maken op het procestabblad. F) Schaalknop instellen op het tabblad Analyseren. Afstand in pixels is gelijk aan het aantal pixels tot één maateenheid (mm). G) Knop Deeltjes analyseren op het tabblad Analyseren. Grootte (eenheid^2) ingesteld op de onderste drempel van fecale pelletgrootte, in pixels, tot oneindig. Toon 'contouren' en 'samenvatting' zijn geselecteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
-
Data-analyse
- Zet pellettellingen om in pellets per dag, wat een indirecte meting van de voedingssnelheid geeft. Gooi gegevens weg van ruiende personen op dagen dat de rui plaatsvond (figuur 9).
OPMERKING: Rui vindt plaats gedurende 1-3 dagen en kan worden geïdentificeerd wanneer een volledige rui van het exoskelet kan worden gezien.

Figuur 9: Voorbeeld van een gribble rui. Rui van gribble (L. quadripunctata), op een Radiata dennenhouten teststok van 20 mm x 4 mm x 2 mm. Ruien worden aangegeven door rode cirkels. Schaalbalk 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.