Method Article

Kernisolatie en superresolutie gestructureerde verlichtingsmicroscopie voor het onderzoeken van nucleoporineveranderingen in menselijke neurodegeneratie

DOI:

10.3791/62789

⸱

September 10th, 2021

 , 
1Brain Science Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurology, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde workflow voor kernisolatie en superresolutie gestructureerde verlichtingsmicroscopie om individuele nucleoporinen in het nucleoplasma en NPC's te evalueren in geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen en postmortale menselijke weefsels.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het nucleaire poriecomplex (NPC) is een complexe macromoleculaire structuur die bestaat uit meerdere kopieën van ~30 verschillende nucleoporine-eiwitten (Nups). Gezamenlijk functioneren deze Nups om de genoomorganisatie, genexpressie en nucleocytoplasmatisch transport (NCT) te reguleren. Onlangs zijn defecten in NCT en veranderingen aan specifieke Nups geïdentificeerd als vroege en prominente pathologieën bij meerdere neurodegeneratieve ziekten, waaronder amyotrofische laterale sclerose (ALS), de ziekte van Alzheimer (AD)/frontotemporale dementie (FTD) en de ziekte van Huntington (HD). Vooruitgang in zowel licht- als elektronenmicroscopie maakt een grondig onderzoek van subcellulaire structuren, inclusief de NPC en zijn Nup-bestanddelen, mogelijk met verhoogde precisie en resolutie. Van de veelgebruikte technieken biedt superresolutie gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) de ongeëvenaarde mogelijkheid om de lokalisatie en expressie van individuele Nups te bestuderen met behulp van conventionele op antilichamen gebaseerde labelstrategieën. Isolatie van kernen voorafgaand aan SIM maakt de visualisatie van individuele Nup-eiwitten binnen de NPC en het nucleoplasma mogelijk in een volledig en nauwkeurig gereconstrueerde 3D-ruimte. Dit protocol beschrijft een procedure voor kernisolatie en SIM om de expressie en distributie van Nup in menselijke iPSC-afgeleide CZS-cellen en postmortale weefsels te evalueren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De prevalentie van leeftijdsgebonden neurodegeneratieve ziekten neemt toe naarmate de bevolking ouder wordt1. Hoewel de genetische onderbouwing en pathologische kenmerken goed gekarakteriseerd zijn, blijven de precieze moleculaire gebeurtenissen die leiden tot neuronale beschadiging slecht begrepen2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Onlangs heeft een G4C2 hexanucleotide repeat expansie in het eerste intron van het C9orf72-gen werd geïdentificeerd als de meest voorkomende genetische oorzaak van de verwante neurodegeneratieve ziekten amyotrofische laterale sclerose (ALS) en frontotemporale dementie (FTD)13,14. Verschillende studies ondersteunen nu een centrale rol voor verstoringen in de nucleaire transportmachinerie, waaronder nucleaire poriecomplexen (NPC's) en nucleaire transportreceptoren (NTR's, karyopherinen), als zijnde veroorzaker van C9orf72 ALS15,16. In niet-delende cellen in de hersenen van ratten hebben steigernucleoporinen (Nups) een extreem lange levensduur. Als gevolg hiervan zijn veranderingen in NPC's en NCT gemeld tijdens veroudering17,18,19,20. Bovendien zijn sommige nucleoporinen of transportines, wanneer ze gemuteerd zijn, gekoppeld aan specifieke neurologische aandoeningen21,22. Mutaties in Nup62 zijn bijvoorbeeld in verband gebracht met infantiele bilaterale striatale necrose (IBSN), een neurologische aandoening die de nucleus caudatus en het putamen aantast23; mutaties in Gle1 zijn betrokken bij de foetale motorneuronziekte Humaan Dodelijk Congenitaal Contractuur Syndroom-1 (LCCS1)24; en mutaties in Aladin zijn de oorzaak van het Triple-A-syndroom25. Veranderingen in functionele NCT worden verergerd bij leeftijdsgebonden neurodegeneratieve ziekten zoals ALS, de ziekte van Huntington (HD) en de ziekte van Alzheimer (AD)16,26,27,28,29,30,31. Bovendien zijn specifieke Nups en NTR's gerapporteerd als modificatoren van C9orf72-gemedieerde toxiciteit in de Drosophila oog28 of biochemisch de aggregatietoestand van ziektegerelateerde eiwitten zoals FUS en tau wijzigen27,32,33,34. Gezamenlijk suggereren deze vroege studies dat veranderde NCT een primair en vroeg pathologisch kenmerk van ALS en FTD kan zijn. Studies in een op overexpressie gebaseerd modelsysteem hebben gesuggereerd dat mislokalisatie van specifieke Nups en karyopherinen van invloed kan zijn op NCT16,35,36,37,38. Deze pathologiestudies koppelen cytoplasmatische accumulaties van NPC-eiwitten echter niet aan defecten in de structuur of functie van de NPC. Deze pathologie kan bijvoorbeeld eenvoudigweg een weerspiegeling zijn van de ontregeling van cytoplasmatische pools van Nup-eiwitten met weinig invloed op de samenstelling en functie van NPC's. Daarentegen toont een recente studie met behulp van superresolutie gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM) de opkomst aan van een significante verwonding van de NPC zelf, gekenmerkt door vermindering van specifieke Nup-niveaus in het nucleoplasma en NPC's van menselijke C9orf72 ALS/FTD-neuronen, wat uiteindelijk leidt tot een veranderde NPC-functie als een vroege initiërende gebeurtenis in pathogene ziektecascades15.

De doorgang van macromoleculen tussen de kern en het cytoplasma wordt geregeld door het nucleaire poriecomplex (NPC). De NPC is een groot macromoleculair complex ingebed in de nucleaire envelop en bestaat uit meerdere kopieën van 30 nucleoporine-eiwitten (Nups)39,40,41. Hoewel Nup-stoichiometrie varieert tussen celtypen 42,43,44, is het behoud van de algehele NPC-samenstelling van cruciaal belang voor NCT, genoomorganisatie en algehele cellulaire levensvatbaarheid 39,41,45,46. Als gevolg hiervan zullen gewijzigde NPC-samenstelling en daaropvolgende defecten in functioneel transport waarschijnlijk een groot aantal stroomafwaartse cellulaire functies beïnvloeden. De Nup-bestanddelen van de NPC zijn sterk georganiseerd in meerdere subcomplexen, waaronder de cytoplasmatische ring en filamenten, het centrale kanaal, de buitenring, de binnenste ring, de transmembraanring en de nucleaire mand. Gezamenlijk verankeren steiger-Nups van de binnenste, buitenste en transmembraanringen NPC's in de nucleaire envelop en bieden ze ankerpunten voor Nups van de cytoplasmatische ring, het centrale kanaal en de nucleaire mand. Terwijl kleine moleculen (<40-60 kD) passief door de NPC kunnen diffunderen, wordt het actieve transport van grotere ladingen vergemakkelijkt door interacties tussen nucleaire transportreceptoren (NTR's, karyoferinen) en de FG Nups van de cytoplasmatische filamenten, het centrale kanaal en de nucleaire mand 39,40,41,45. Ook kan een handvol Nups ook buiten de NPC, binnen het nucleoplasma, functioneren om genexpressie te reguleren46,47.

Aangezien de laterale dimensie van een enkele menselijke NPC ongeveer 100-120 nm40 is, is standaard breedveld- of confocale microscopie onvoldoende om individuele NPC's48 op te lossen. Elektronenmicroscopie (EM) technieken zoals TEM of SEM worden vaak gebruikt om de algehele structuur van NPC's39,40 te evalueren. Ondanks de voordelen van deze technieken voor het oplossen van NPC-ultrastructuur, worden ze minder vaak gebruikt om de aanwezigheid van individuele Nup-eiwitten in de NPC te evalueren. De technische beperkingen van het combineren van antilichaam- of tag-gebaseerde labeling met deze state-of-the-art technologieën, TEM en SEM, maken een nauwkeurige en betrouwbare beoordeling van individuele Nups zelf binnen NPC's of het nucleoplasma niet altijd mogelijk. Verder kunnen deze technieken technisch uitdagend zijn en zijn ze nog niet breed toegankelijk voor alle onderzoekers. Recente ontwikkelingen op het gebied van licht- en fluorescentiemicroscopie hebben echter de toegankelijkheid van beeldvormingstechnologieën met superresolutie vergroot. In het bijzonder biedt SIM de ongeëvenaarde mogelijkheid om individuele Nups af te beelden met een resolutie die de laterale dimensies van één menselijke NPC benadert 40,48,49,50,51. In tegenstelling tot andere superresolutiebenaderingen zoals stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM) en gestimuleerde emissiedepletie (STED), is SIM compatibel met conventionele immunokleuring op basis van antilichamen49. SIM maakt dus een uitgebreide analyse mogelijk van alle Nups waarvoor een specifiek Nup-antilichaam beschikbaar is. De mogelijkheid om meerdere verschillende Nups in hetzelfde preparaat te bemonsteren en af te beelden, biedt aanzienlijke voordelen voor andere beeldvormingsmethoden bij het onderzoeken van de vele eiwitten waaruit de NPC bestaat. De volgende procedure beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor het evalueren van individuele Nup-componenten van de NPC met behulp van kernen die zijn geïsoleerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide neuronen (iPSN's) en postmortale weefsels van het menselijke centrale zenuwstelsel (CZS).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle bloedmonsters voor het genereren van iPSC en het afnemen van autopsie van weefsel zijn goedgekeurd door Johns Hopkins IRB onder ethisch toezicht van Johns Hopkins. Alle patiëntinformatie is HIPPA-compatibel. Het volgende protocol voldoet aan alle bioveiligheidsprocedures van Johns Hopkins.

1. Voorbereiding van objectglaasjes voor immunokleuring en beeldvorming

  1. Plaats een positief geladen glazen microscoopglaasje in een lege cytotrechter en teken een cirkel met een hydrofobe barrièrepen om een gebied te schetsen waar de kernen kunnen worden afgezet.
  2. Voeg 50 μL 1 mg/ml collageenoplossing (verdund in 1x PBS) toe aan het midden van de cirkel getekend in stap 1.1 en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Zuig de collageenoplossing op en laat de glaasjes ongeveer 1 uur aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.

2. Bereiding van lysisbuffer- en sacharosegradiënten

  1. Bereid de lysisbuffer- en sucrosegradiëntoplossingen voor volgens het protocol van de nuclei-isolatiekit.
    1. Bereid voor elk monster een conische buis van 50 ml lysisbuffer voor door 11 ml van de meegeleverde lysisbuffer, 110 μl van de meegeleverde 10% Triton X-100-oplossing en 11 μl vers bereide of ontdooide 1 M DTT (dithithhreitol) te combineren.
    2. Gebruik voor elk monster een conische buis van 50 ml om een sacharosekussenoplossing van 1,85 ml te bereiden door 27,75 ml van de meegeleverde 2 M sacharosekussenoplossing, 2,25 ml van de meegeleverde sacharosekussenbuffer en 30 μl vers bereide of ontdooide 1 M DTT te combineren.
      OPMERKING: Een sucrosekussenoplossing van 1,85 M is optimaal voor iPSN's en postmortaal menselijk CZS-weefsel, maar pas deze aan voor andere celtypen of weefselmonsters. Aanvullende details voor HEK293-cellen, iPSC-afgeleide astrocyten en verrijking van oligodendrocytkernen uit postmortale CZS-weefsels zijn onlangs gepubliceerd15.
  2. Meng voorzichtig lysisbuffer- en sucrosekussenoplossingen door conische buizen om te keren en bewaar deze op ijs.

3. Lysis van iPSN's en postmortaal menselijk CZS-weefsel

  1. Voordat u verder gaat met de lysis, plaatst u de ultracentrifugerotor (zonder monsterhouders) in de ultracentrifuge en laat u deze voorkoelen tot 4 °C.
  2. Lysis van iPSN's.
    OPMERKING: Lysisprotocollen verschillen voor iPSN's en postmortaal menselijk CZS-weefsel. Volg het protocol voor het onderstaande monstertype (stap 3.2: iPSN's, stap 3.3: postmortaal menselijk CZS-weefsel).
    1. Haal de iPSN's uit de broedmachine en zuig de media op. Spoel kort af met 1x PBS en voeg de lysisbuffer direct toe aan het putje of de plaat.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u iPSN's voldoende spoelt met een voldoende hoeveelheid 1x PBS om vuil en dode cellen te verwijderen. Het volume lysisbuffer dat aan iPSN-platen moet worden toegevoegd, zal variëren. Zie tabel 1. Zorg ervoor dat het uitgangsmateriaal > 2,5 miljoen iPSN's is.
    2. Schraap de iPSN's met een celschraper en breng ze over naar de resterende lysisbuffer in de conische buis van 50 ml.
    3. Sluit elke conische buis af en vortex de monsters gedurende 20 s om iPSN-lysis te vergemakkelijken.
    4. Laat de monsters 1-2 minuten op ijs liggen voordat u verder gaat.
  3. Lysis van postmortale menselijke CZS-weefsels.
    1. Weeg ~100 mg bevroren postmortaal menselijk CZS-weefsel af door met een scheermesje in een petrischaaltje op een bed van droogijs te snijden. Zorg ervoor dat u werkt op een oppervlak dat is omgeven door wegwerppads om lokale weefselbesmetting te voorkomen. Besteed aandacht aan specifieke dissecties van grijze stof versus witte stof (bijv. corticale mantel versus onderliggende witte stof) die zichtbaar zijn op het moment van weefseldissectie.
      OPMERKING: Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, inclusief oogbeschermende kleding en handschoenen bij het hanteren van ingevroren postmortale monsters van menselijk weefsel. Deze stap kan ook van tevoren worden voltooid en weefselaliquots kunnen worden bewaard bij -80 °C. 50 mg is een voldoende hoeveelheid voor de isolatie van kernen. Meer dan 100 mg weefsel levert echter vaak een onvolledige isolatie van kernen op, zoals blijkt uit de aanwezigheid van intact cytoplasma rond sommige kernen.
    2. Bereid de Dounce-homogenisator voor door deze schoon te maken en grondig af te spoelen met gedestilleerd water. Koel de homogenisator door hem op ijs te leggen.
    3. Voeg 100 mg tissue toe aan een pas gereinigde, gespoelde en gekoelde (op ijs) Dounce-homogenisator die 2 ml van de voorbereide lysisbuffer bevat.
    4. Homogeniseer in Dounce-homogenisator met behulp van de standaardprocedure op ijs.
      OPMERKING: Doorgaans zijn 10-20 slagen per stamper voldoende om zonder weerstand door het monster te bewegen.
    5. Breng 2 ml postmortem menselijk hersenhomogenaat over naar de resterende 9 ml lysisbuffer in conische buisjes.
    6. Draai krachtig gedurende 30 s en laat het 5 minuten op ijs zitten om de lysis te vergemakkelijken.

4. Isolatie van kernen uit iPSN's en postmortaal menselijk CZS-weefsel

  1. Breng 10 ml 1,85 M sacharosekussenoplossing (gemaakt in stap 2.1.2) aan op de bodem van een ultracentrifugebuis en voeg 18 ml 1,85 M sacharosekussenoplossing toe aan elk lysaat.
  2. Meng de lysaat/sucrosekussenoplossing (gecombineerd in stap 4.1) voorzichtig door de conische buis van 50 ml om te keren.
  3. Voeg langzaam 28 ml lysaat/sucrosekussenoplossing toe aan de bovenkant van de 10 ml 1,85 ml sacharosekussenoplossing in de ultracentrifugebuis (vanaf stap 4.1).
    OPMERKING: Er zit in totaal 29 ml lysaat/sucrosekussenoplossing mengsel in de conische buis van 50 ml (stappen 4.1-4.2). Laat 1 ml van deze lysaat/sucrosekussenoplossing in de conische buis van 50 ml zitten. Dit zorgt voor nauwkeurig en consistent pipetteren tussen alle monsters vanwege de viscositeit van de sucrosekussenoplossing.
  4. Plaats de ultracentrifugebuisjes in de houders en voeg zo nodig een extra sacharosekussenoplossing van 1,85 M toe (gemaakt in stap 2.1.2) om de monsters in evenwicht te brengen.
  5. Plaats de monsterhouders in de rotor in de gekoelde ultracentrifuge en draai gedurende 45 minuten op 30.000 x g, 4 °C.
  6. Verwijder de ultracentrifugebuisjes uit de monsterhouders en gooi de bovenstaande middelen weg. Kernen zullen zichtbaar zijn als pellets aan de onderkant van de ultracentrifugebuis.
  7. Resuspendeer de kernpellets in 1 ml van de meegeleverde kernopslagbuffer door vortexing en breng ze over naar een microcentrifugebuis.
  8. Centrifugeer de microcentrifugebuisjes 5 minuten bij 2.500 x g, 4 °C.
  9. Verwijder het bovenstaande en suspendeer de kernen opnieuw door 1 ml van de meegeleverde kernopslagbuffer in verse werveltex te draaien.
  10. Ga verder met immunokleuring of bewaar de kernen bij -80 °C.
    OPMERKING: Kernen kunnen tot 6 maanden bij -80 °C worden bewaard en worden onderworpen aan twee vries-/dooicycli voordat de structurele integriteit in het gedrang komt.

5. Immunokleuring van de geïsoleerde kernen

  1. Neem een aliquot van 10 μl van de kernsuspensie en tel deze met behulp van een hemacytometer of een geautomatiseerde celteller.
  2. Monteer de voorbereide objectglaasjes (uit stap 1.3) in de cytotrechters.
  3. Leg op elke cytotrechter 200 μL opslagbuffer voor verse kernen en ~100.000 kernen.
  4. Draai de kernen voorzichtig op de objectglaasjes door de cytotrechters in een cytospin te plaatsen en gedurende 3 minuten te centrifugeren op 100 x g.
  5. Maak de cytotrechters los en voeg onmiddellijk ~100 μL 4% PFA (paraformaldehyde) toe aan de objectglaasjes en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Kernen kunnen ook worden gefixeerd met methanol. Gebruik een fixatiemethode die geschikt is voor elk antilichaam. Als u methanol gebruikt, sla dan de permeabilisatiestap (5.7) over. Cytotrechters zijn voor eenmalig gebruik; Gooi ze nu weg.
  6. Was de kernen 3x gedurende 5 minuten met 1x PBS.
  7. Permeabiliseer de kernen met 0,1% Triton X-100 in 1x PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Blokkeer de kernen in blokoplossing (10% geiten- of ezelserum in 1x PBS) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Incubeer de kernen met primaire antilichamen die een nacht bij 4 °C in blokoplossing zijn verdund.
  10. Was de kernen 3x gedurende 5 minuten met 1x PBS.
  11. Incubeer de kernen met secundaire antilichamen verdund in blokoplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Alexa Fluor 488, 568 en 647 secundaire antilichamen hebben de voorkeur.
  12. Was de kernen 3x gedurende 5 minuten met 1x PBS.
  13. OPTIONEEL: Incubeer de kernen gedurende 5 minuten met DAPI of Hoechst, gevolgd door twee extra wasbeurten van 5 minuten met 1x PBS.
  14. Houd een pluisvrij doekje aan de rand van de cirkel met kernen om de laatste PBS-wasbeurt volledig te verwijderen.
  15. Voeg 1 druppel (~10 μL) van een hard mount antifade montagemedium (zonder DAPI) toe aan elk glaasje en plaats voorzichtig vierkante dekglaasjes met een hoge tolerantie van 18 mm x 18 mm op elk glaasje.
    OPMERKING: Bij gebruik van een vast gemonteerd medium is het afdichten van de dia's niet nodig als de dia's binnen een geschikt tijdsbestek worden afgebeeld. De immunoreactiviteit van Nup is doorgaans stabiel gebleven op niet-verzegelde objectglaasjes die gedurende ~6 maanden bij 4 °C zijn bewaard. De randen van het dekglaasje kunnen echter worden verzegeld met een dun laagje nagellak als een natgemonteerd medium wordt gebruikt of voor langdurige opslag.
  16. Houd de objectglaasjes beschermd tegen licht en laat ze een nacht uitharden bij kamertemperatuur.
  17. Beeld van de kernen kan door middel van super-resolutie gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM).
    OPMERKING: Zeiss, Nikon en GE Healthcare produceren allemaal SIM-microscopen. Volg de systeemspecifieke protocollen voor beeldacquisitie en -verwerking. Gebruik beeldvormingsparameters (laservermogen, filtersets, belichtingstijd) die geschikt zijn voor elke Nup en fluorofoor. Vermijd bij beeldvorming de randen van de cirkel (vanaf stap 1.1), aangezien deze kernen doorgaans afgeplat en verspreid zijn als gevolg van de centrifugatiestap (5.4). Volledig gedeconvoleerde en bewerkte beelden kunnen worden onderworpen aan een aantal analyses, waaronder spotdetectie en volumemetingen met behulp van standaard 3D-analysemodules in FIJI- of imaris-beeldanalysesoftware. Aanvullende details over analysemethoden zijn onlangs gepubliceerd15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de NPC- en nucleoplasmatische distributie en expressie van POM121 in menselijke neuronale kernen te onderzoeken, werden controle- en C9orf72 iPSN's gedifferentieerd zoals eerder beschreven15. Postmortale menselijke motorische cortex en dag 32 iPSN's werden gelyseerd en onderworpen aan kernisolatie en immunokleuring zoals hierboven beschreven. NeuN-positieve geïsoleerde kernen werden in beeld gebracht door middel van superresolutie gestructureerde verlichtingsmi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gezien de recente identificatie van NCT-tekorten als een vroeg en prominent fenomeen bij meerdere neurodegeneratieve ziekten 16,27,28,30,31, bestaat er een kritieke behoefte om het mechanisme waarmee deze pathologie optreedt grondig te onderzoeken. Aangezien de NPC en zijn individuele Nup-eiwitten functionele NCT kritisch cont...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postmortem humaan CZS-weefsel werd geleverd door de Johns Hopkins ALS Autopsy Bank en de Target ALS Postmortem Tissue Core. Dit werk werd ondersteund door de ALSA Milton Safenowitz Postdoctoral Fellowship (ANC), evenals financiering van NIH-NINDS, het ministerie van Defensie, de ALS Association, de Muscular Dystrophy Association, F Prime, het Robert Packard Center for ALS Research Answer ALS Program en het Chan Zuckerberg Initiative.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL conische buizenFisher Scientific14-959-49A
Beckman UltracentrifugeBeckman Coulter
CelkrabbersSarstedt83.183
CollageneAdvanced Biomatrix5005
DekglasjesMatTekPCS-170-1818
CytofunnelThermo Fisher ScientificA78710020
Cytospin 4Fisher ScientificA78300003
Dounce HomogenisatorenDWK Life Sciences357542
DTTSigma AldrichD0632
Eppendorf buizenFisher Scientific05-408-129
Goat Anti-Chicken Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21449
Goat Anti-Mouse Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11029
Goat Anti-Mouse Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11031
Goat Anti-Mouse Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21236
Goat Anti-Rabbit Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11034
Goat Anti-Rabbit Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11036
Goat Anti-Rabbit Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21245
Goat Anti-Rat Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11006
Goat Anti-Rat Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11077
Goat Anti-Rat Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21247
HemacytometerFisher Scientific267110
MicroscoopglaasjesFisher Scientific12-550-15
Normaal GeitenserumVector LabsS-1000
Nuclei PURE Prep Nuclei Isolation KitSigma AldrichNUC201Bevat Lysis Buffer, 10% Triton X-100, 2 M Sucrose Gradient, Sucrose Cushion Solution en Nuclei Storage Buffer; Aangeduid in het protocol als 'nuclei isolation kit'
PBSThermo Fisher Scientific10010023
PFAElectron Microscopy Sciences15714-S
Prolong Gold AntifadeInvitrogenP36930Aangeduid in het protocol als 'hard mount antifade mounting media'
SW 32 Ti Ultracentrifuge RotorBeckman Coulter369694Aangeduid in het protocol als 'ultracentrifuge rotor'
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Trypan BlauwThermo Fisher Scientific15-250-061
UltracentrifugebuizenBeckman Coulter344058
Nucleoporiner primaire antilichamenPrimaire antilichamen geschikt voor immunofluorescente detectie van individuele nucleoporins zijn verkrijgbaar bij meerdere bedrijven 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hou, Y., et al. Ageing as a risk factor for neurodegenerative disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (10), 565-581 (2019).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Bang, J., Spina, S., Miller, B. L. Frontotemporal dementia. Lancet. 386 (10004), 1672-1682 (2015).
  4. Blauwendraat, C., Nalls, M. A., Singleton, A. B. The genetic architecture of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 19 (2), 170-178 (2020).
  5. Cacace, R., Sleegers, K., Van Broeckhoven, C. Molecular genetics of early-onset Alzheimer's disease revisited. Alzheimer's & Dementia. 12 (6), 733-748 (2016).
  6. Di Resta, C., Ferrari, M. New molecular approaches to Alzheimer's disease. Clinical Biochemistry. 72, 81-86 (2019).
  7. Karch, C. M., Cruchaga, C., Goate, A. M. Alzheimer's disease genetics: from the bench to the clinic. Neuron. 83 (1), 11-26 (2014).
  8. Kovacs, G. G. Molecular pathology of neurodegenerative diseases: principles and practice. Journal of Clinical Pathology. 72 (11), 725-735 (2019).
  9. McColgan, P., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: a clinical review. European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).
  10. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. The Lancet. Neurology. 10 (1), 83-98 (2011).
  11. Dugger, B. N., Dickson, D. W. Pathology of neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 028035(2017).
  12. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  13. DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72 (2), 245-256 (2011).
  14. Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72 (2), 257-268 (2011).
  15. Coyne, A. N., et al. G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD. Neuron. 107 (4), 1124-1140 (2020).
  16. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  17. D'Angelo, M. A., Raices, M., Panowski, S. H., Hetzer, M. W. Age-dependent deterioration of nuclear pore complexes causes a loss of nuclear integrity in postmitotic cells. Cell. 136 (2), 284-295 (2009).
  18. Hetzer, M. W. The role of the nuclear pore complex in aging of post-mitotic cells. Aging (Albany NY). 2 (2), 74-75 (2010).
  19. Savas, J. N., Toyama, B. H., Xu, T., Yates, J. R., Hetzer, M. W. Extremely long-lived nuclear pore proteins in the rat brain. Science. 335 (6071), 942(2012).
  20. Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
  21. Nofrini, V., Di Giacomo, D., Mecucci, C. Nucleoporin genes in human diseases. European Journal of Human Genetics. 24 (10), 1388-1395 (2016).
  22. Sakuma, S., D'Angelo, M. A. The roles of the nuclear pore complex in cellular dysfunction, aging and disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 68, 72-84 (2017).
  23. Basel-Vanagaite, L., et al. Mutated nup62 causes autosomal recessive infantile bilateral striatal necrosis. Annals of Neurology. 60 (2), 214-222 (2006).
  24. Nousiainen, H. O., et al. Mutations in mRNA export mediator GLE1 result in a fetal motoneuron disease. Nature Genetics. 40 (2), 155-157 (2008).
  25. Cronshaw, J. M., Matunis, M. J. The nuclear pore complex: disease associations and functional correlations. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15 (1), 34-39 (2004).
  26. Chou, C. C., et al. TDP-43 pathology disrupts nuclear pore complexes and nucleocytoplasmic transport in ALS/FTD. Nature Neuroscience. 21 (2), 228-239 (2018).
  27. Eftekharzadeh, B., et al. Tau protein disrupts nucleocytoplasmic transport in Alzheimer's disease. Neuron. 99 (5), 925-940 (2018).
  28. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  29. Gasset-Rosa, F., et al. Polyglutamine-expanded huntingtin exacerbates age-related disruption of nuclear integrity and nucleocytoplasmic transport. Neuron. 94 (1), 48-57 (2017).
  30. Grima, J. C., et al. Mutant huntingtin disrupts the nuclear pore complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  31. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  32. Guo, L., et al. Nuclear-import receptors reverse aberrant phase transitions of RNA-binding proteins with prion-like domains. Cell. 173 (3), 677-692 (2018).
  33. Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
  34. Yoshizawa, T., et al. Nuclear Import Receptor Inhibits Phase Separation of FUS through Binding to Multiple Sites. Cell. 173 (3), 693-705 (2018).
  35. Chew, J., et al. Aberrant deposition of stress granule-resident proteins linked to C9orf72-associated TDP-43 proteinopathy. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 9(2019).
  36. Zhang, Y. J., et al. Poly(GR) impairs protein translation and stress granule dynamics in C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis. Nat Medicine. 24 (8), 1136-1142 (2018).
  37. Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nature Neuroscience. 19 (5), 668-677 (2016).
  38. Zhang, Y. J., et al. Heterochromatin anomalies and double-stranded RNA accumulation underlie C9orf72 poly(PR) toxicity. Science. 363 (6428), (2019).
  39. Beck, M., Hurt, E. The nuclear pore complex: understanding its function through structural insight. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (2), 73-89 (2017).
  40. Lin, D. H., Hoelz, A. The structure of the nuclear pore complex (an update). Annual Review of Biochemistry. 88, 725-783 (2019).
  41. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (11), 687-699 (2012).
  42. Kinoshita, Y., Kalir, T., Dottino, P., Kohtz, D. S. Nuclear distributions of NUP62 and NUP214 suggest architectural diversity and spatial patterning among nuclear pore complexes. PLoS One. 7 (4), 36137(2012).
  43. Ori, A., et al. Cell type-specific nuclear pores: a case in point for context-dependent stoichiometry of molecular machines. Molecular Systems Biology. 9, 648(2013).
  44. Rajoo, S., Vallotton, P., Onischenko, E., Weis, K. Stoichiometry and compositional plasticity of the yeast nuclear pore complex revealed by quantitative fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), 3969-3977 (2018).
  45. Li, C., Goryaynov, A., Yang, W. The selective permeability barrier in the nuclear pore complex. Nucleus. 7 (5), 430-446 (2016).
  46. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complexes and regulation of gene expression. Current Opinion in Cell Biology. 46, 26-32 (2017).
  47. Pascual-Garcia, P., Capelson, M. Nuclear pores in genome architecture and enhancer function. Current Opinion in Cell Biology. 58, 126-133 (2019).
  48. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  49. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nature Neuroscience. 16 (7), 790-797 (2013).
  50. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  51. Wu, Y., Shroff, H. Faster, sharper, and deeper: structured illumination microscopy for biological imaging. Nature Methods. 15 (12), 1011-1019 (2018).
  52. Hampoelz, B., et al. Pre-assembled nuclear pores insert into the nuclear envelope during early development. Cell. 166 (3), 664-678 (2016).
  53. Hampoelz, B., et al. Nuclear pores assemble from nucleoporin condensates during oogenesis. Cell. 179 (3), 671-686 (2019).
  54. Agote-Aran, A., et al. Spatial control of nucleoporin condensation by fragile X-related proteins. The EMBO Journal. 39 (20), 104467(2020).
  55. Colombi, P., Webster, B. M., Fröhlich, F., Lusk, C. P. The transmission of nuclear pore complexes to daughter cells requires a cytoplasmic pool of Nsp1. The Journal of Cell Biology. 203 (2), 215-232 (2013).
  56. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  57. Löschberger, A., Franke, C., Krohne, G., van de Linde, S., Sauer, M. Correlative super-resolution fluorescence and electron microscopy of the nuclear pore complex with molecular resolution. Journal of Cell Science. 127, Pt 20 4351-4355 (2014).
  58. Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. Journal of Cell Science. 125, Pt 3 570-575 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nuclei IsolationStructured Illumination MicroscopyNuclear Pore ComplexNucleoporin AlterationsNucleocytoplasmic TransportSuper Resolution MicroscopyHuman NeurodegenerationiPSC Derived CNS CellsAntibody LabelingPostmortem Tissues
Video Coming Soon

Related Articles