Methodenartikel

Imaging Replicative Domains in Ultrastructurally Preserved Chromatin door Electron Tomography

DOI:

10.3791/62803

⸱

20 mei 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Belozersky Institute of Physico-chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, 2Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University, 3Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 4National Research Center, Kurchatov Institute, 5V.I. Kulakov National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology, and Perinatology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert een techniek voor het in kaart brengen van replicatielocaties met hoge resolutie in structureel geconserveerd chromatine in situ die een combinatie van pre-embedding EdU-streptavidin-Nanogold-labeling en ChromEMT gebruikt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Principes van DNA-vouwing in de celkern en de dynamische transformaties die optreden tijdens de vervulling van fundamentele genetische functies (transcriptie, replicatie, segregatie, enz.) blijven slecht begrepen, deels als gevolg van het gebrek aan experimentele benaderingen voor hoge resolutie visualisatie van specifieke chromatine loci in structureel bewaard gebleven kernen. Hier presenteren we een protocol voor de visualisatie van replicerende domeinen in monolaagcelcultuur in situ, door EdU-labeling van nieuw gesynthetiseerd DNA te combineren met daaropvolgende labeldetectie met Ag-amplificatie van Nanogold-deeltjes en ChromEM-kleuring van chromatine. Dit protocol maakt de contrastrijke, zeer efficiënte pre-embedding etikettering mogelijk, compatibel met traditionele glutaaraldehydefixatie die de beste structurele conservering van chromatine biedt voor monsterverwerking op kamertemperatuur. Een ander voordeel van pre-embedding labeling is de mogelijkheid om vooraf cellen te selecteren die van belang zijn voor secties. Dit is vooral belangrijk voor de analyse van heterogene celpopulaties, evenals compatibiliteit met elektronentomografiebenaderingen voor hoge-resolutie 3D-analyse van chromatine-organisatie op replicatieplaatsen, en de analyse van postreplicatieve chromatineherschikking en zusterchromatidenscheiding in de interfase.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-replicatie is een fundamenteel biologisch proces dat nodig is voor het getrouw kopiëren en overbrengen van de genetische informatie tijdens de celdeling. Bij hogere eukaryoten wordt DNA-replicatie onderworpen aan een strakke spatio-temporele regulatie, die zich manifesteert in sequentiële activering van replicatieoorsprong1. Naburige replicatieoorsprongen die synchroon worden afgevuurd, vormen clusters van repliconen2. Op het niveau van optische microscopie worden plaatsen van voortdurende DNA-replicatie gedetecteerd als replicatiehaarden van verschillende aantallen en groottes. Replicatiehaarden vertonen specifieke patronen van ruimtelijke verdeling binnen de celkern, afhankelijk van de replicatietiming van het gelabelde DNA 3,4, dat op zijn beurt nauw gecorreleerd is met zijn genactiviteit. Dankzij de goed gedefinieerde sequentie van DNA-replicatie, strikt geordend in ruimte en tijd, is replicative labeling een krachtige methode voor nauwkeurige DNA-labeling, niet alleen voor de studie van het replicatieproces op zich, maar ook om een specifieke DNA-subfractie te onderscheiden met gedefinieerde transcriptieactiviteit en verdichtingsniveau. Visualisatie van replicerend chromatine wordt meestal uitgevoerd door de detectie van belangrijke eiwitcomponenten van DNA-replicatiemachines (hetzij door immunostaining of door expressie van fluorescerende eiwittags 5,6) of door de integratie van gemodificeerde DNA-syntheseprecursoren 7,8,9,10 . Hiervan maken alleen methoden op basis van de opname van gemodificeerde nucleotiden in nieuw gerepliceerd DNA het mogelijk om conformationele veranderingen in chromatine tijdens replicatie vast te leggen en het gedrag van replicerende domeinen te traceren nadat hun replicatie is voltooid.

Bij hogere eukaryoten voegt DNA-verpakking in chromatine een ander niveau van complexiteit toe aan de regulatie van genetische basisfuncties (transcriptie, replicatie, reparatie, enz.). Chromatinevouwing beïnvloedt de toegankelijkheid van DNA tot regulerende transfactoren en DNA-conformatieveranderingen (dubbele helixafwikkeling) die nodig zijn voor de sjabloonsynthese. Daarom wordt algemeen aanvaard dat DNA-afhankelijke synthetische processen in de celkern een structurele overgang van chromatine vereisen van zijn gecondenseerde, repressieve toestand naar een meer toegankelijke, open conformatie. Cytologisch worden deze twee chromatinetoestanden gedefinieerd als heterochromatine en euchromatine. Er is echter nog steeds geen consensus over de wijze van DNA-vouwing in de kern. De hypothesen variëren van een "polymeersmelt" model11, waarbij nucleosomale vezel zich gedraagt als een willekeurig polymeer waarvoor de pakkingsdichtheid wordt geregeld door fasescheidingsmechanismen, tot hiërarchische vouwmodellen die sequentiële vorming van chromatinevezelachtige structuren van toenemende diktepostuleren 12,13. Hiërarchische vouwmodellen kregen onlangs steun van moleculaire benaderingen op basis van de analyse van in situ DNA-DNA-contacten (chromosoomconformatievangst, 3C), wat het bestaan van de hiërarchie van chromatine structurele domeinen14 aantoont. Het is belangrijk op te merken dat replicatie-eenheden zeer goed correleren met deze chromatinedomeinen15. De belangrijkste kritiek op deze modellen is gebaseerd op mogelijke kunstmatige chromatineaggregatie veroorzaakt door monstervoorbereidingsprocedures, zoals permeabilisatie van celmembranen en verwijdering van niet-chromatinecomponenten, om het chromatinecontrast voor ultrastructurele studies te verbeteren en tegelijkertijd de toegankelijkheid van chromatine voor verschillende probes (bijv. Antilichamen) te verbeteren. Recente technische vooruitgang in selectieve DNA-kleuring voor elektronenmicroscopie door DNA-bindende fluorofoor-gemedieerde foto-oxidatie van diaminobenzidine (ChromEMT6) heeft de eliminatie van dit obstakel mogelijk gemaakt. Dezelfde overwegingen gelden echter voor elektronenmicroscopievisualisatie van het repliceren van DNA17,18. Hier beschrijven we een techniek die het mogelijk maakt om tegelijkertijd ultrastructurele mapping met hoge resolutie nieuw gesynthetiseerd DNA en totaal chromatine in intacte aldehyde-gekruiste cellen mogelijk te maken. De techniek combineert detectie van EdU-gelabeld DNA door Click-chemie met gebiotinyleerde probes en streptavidin-Nanogold en ChromEMT.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol is geoptimaliseerd voor adherente cellen en is getest op HeLa, HT1080 en CHO cellijnen.

1. Celletikettering en fixatie

  1. Plaatcellen op zuur gereinigde coverslips in een petrischaaltje van 3 cm. Laat de cellen in de media die worden aanbevolen voor de cellijn die wordt gebruikt, groeien tot 70% confluentie.
  2. Voeg EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) toe van 10 mM voorraad tot 10 μM eindconcentratie en plaats de cellen gedurende 10 minuten of langer in de incubator (afhankelijk van het experimentdoel). Voor kortere pulsen (tot 2 min), bereid een petrischaal met voorverwarmde verse kweekmedia aangevuld met 10 μM EdU, en breng coverslips erin over, in plaats van EdU direct aan de cellen toe te voegen.
    OPMERKING: Alle volgende stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur als dit niet anders is aangegeven.
  3. Fixeer de gelabelde cellen met 2,5% glutaaraldehyde, vers gemaakt door 25% bouillon te verdunnen in 100 mM cacodylaatbuffer, gedurende 1 uur.
    OPMERKING: De volgende EdU-detectiestappen zijn gevoelig voor fixatietiming. Langere fixatietijden kunnen de EdU-etikettering nadelig beïnvloeden, waardoor de signaal-ruisverhouding lager is.
  4. Verwijder glutaaraldehyde door de monsters daarna te wassen met PBS aangevuld met 5 mM MgCl2 (PBS*). Was drie keer met een incubatietijd van 10 minuten voor elke wasbeurt.
  5. Plasmameabiliseren met 1% Triton X-100 in PBS* (PBS*T daarna). Was tweemaal met een incubatietijd van 5 minuten voor elke wasbeurt.
  6. Was het monster uitgebreid met PBS*. Voer vijf wijzigingen uit en incubeer gedurende 5 minuten in elke wijziging.
  7. Blus de restvrije aldehydegroepen met 20 mM glycine in PBS*, tweemaal gedurende elk 10 minuten.
  8. Blokkeer de monsters in 1% BSA in PBS* gedurende 30 minuten.

2. Klikreactie

OPMERKING: Deze procedure is gewijzigd ten opzichte van een eerder gepubliceerd protocol19.

  1. Bereid onmiddellijk voor gebruik een klikreactiemengsel voor EdU-detectie: meng in een microcentrifugebuis 430 μL van 100 mM Tris-HCl (pH = 8,5), 20 μL van 100 mM CuSO4, 1,2 μL biotine-azide (10 mM in DMSO) en 50 μL van 0,5 M ascorbinezuur. Voor kwaliteitscontrole van de replicatieve etikettering en Click-procedure op het niveau van fluorescerende microscopie kan biotine-azide worden vervangen door AlexaFluor 488-azide.
    OPMERKING: De volgorde van toevoeging van componenten in de bovenstaande reactie is belangrijk.
  2. Voer een klikreactie uit in een vochtige kamer om de verdamping en concentratieverschuivingen in de reactiecocktail te minimaliseren. Bereid de vochtige kamer voor door een nat vel filtreerpapier op de bodem van de petrischaal te leggen en deze te bedekken met een paraffinefilm. Plaats de coverslips op het oppervlak van de film met de cellen naar boven gericht en leg 50-100 μL van de reactiecocktail op de coverslip. De reactie duurt 30 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Stop de reactie door het monster te wassen in 0,1% Triton X-100 in PBS* (PBS*T), vijf keer gedurende elk 5 minuten.
  4. Blok 1% BSA in PBS*T gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
  5. Bereid streptavidin-Nanogold oplossing met PBS*T met 1% BSA. Incubeer het monster met streptavidin, geconjugeerd met 1,4 nm Nanogold-deeltjes (Nanoprobes) in 1% BSA + PBS*T gedurende de nacht bij +4 °C in de nieuw bereide vochtige kamer.
  6. Stop de reactie en was het monster in PBS*T, vijf keer gedurende elk 10 minuten.
  7. Stabiliseer het biotine streptavidin complex door postfixing in 1% glutaaraldehyde in PBS* gedurende 30 min.
  8. Verwijder glutaaraldehyde door intensief te wassen met gedeïoniseerd water en was het monster in PBS*, vijfmaal gedurende elk 20 minuten.
  9. Blus vrije aldehydegroepen met vers bereide 1 mg/ml NaBH4 in water, twee keer gedurende elk 10 minuten. Tijdens de incubatie worden bubbels van H2 gevormd die de dekenslips kunnen optillen. Duw ze voorzichtig naar beneden met het pincet.
  10. Was vijf keer met gedeïoniseerd water gedurende elk 5 minuten.
    OPMERKING: Voor kwaliteitscontrole bij de etiketteringsstap is het raadzaam om controle-etikettering uit te voeren met fluorescerend gelabelde streptavidin (figuur 2). Dit zou een schatting geven van de labelintensiteit en het achtergrondniveau voordat wordt overgeschakeld naar vervelende en artefact-gevoelige vervolgstappen.

3. Ag-amplificatie

OPMERKING: Deze procedure is gewijzigd ten opzichte van Gilerovitch et al., 1995 (zie 20,21).

  1. Resuspend 50 g acaciapoeder in 100 ml gedeïoniseerd water. Los gedurende 3 dagen op, ontgas en filtreer door vier lagen kaasdoek. Bewaren bevroren in 5 ml aliquots in buizen van 50 ml. Ontdooi direct voor gebruik.
  2. Voeg 2 ml 1 M MES (pH = 6,1) toe aan 5 ml ontdooide aliquot acaciapoederoplossing om 7 ml van 0,28 M MES (pH = 6,1) in acaciapoederoplossing te maken. Meng door de buis gedurende 30 minuten langzaam te wiegen. Wikkel de tube in met folie ter bescherming tegen licht.
  3. Gelijktijdig met stap 3.2., waszeilen met wasbuffer (50 mM MES, pH = 5,8, 200 mM sucrose), drie keer gedurende 10 minuten elk.
  4. Bereid de verse oplossing van N-propylgallaat (NPG). Los in een buis van 15 ml 10 mg NPG op in 250 μl 96% ethanol en pas aan tot 5 ml met gedeïoniseerd water.
  5. Doe 36 mg zilverlactaat in een met folie omwikkelde tube van 15 ml.
  6. Na stap 3.2. is voltooid, voeg 1,5 ml NPG-oplossing toe aan acaciapoedermengsel en rock nog eens 3 minuten.
    OPMERKING: Alle volgende stappen worden uitgevoerd in een donkere kamer. Gebruik niet-actinisch safelight (geel of rood).
  7. Breng het monster in evenwicht met de wasbuffer en ga naar de donkere kamer. Voeg tegelijkertijd 5 ml gedeïoniseerd water toe aan zilverlactaat en los op door krachtig schudden gedurende 1-2 minuten.
  8. Voeg 1,5 ml zilverlactaatoplossing toe aan acaciapoedermengsel, laat langzaam 1 minuut schommelen. Vermijd bubbelvorming, omdat zuurstof in het mengsel de reactie zal vertragen.
  9. Giet de oplossing uit de schaal met coverslips en giet 3 ml zilverlactaat-acaciapoedermengsel op de cellen. Rock het gerecht meerdere keren en incubeer gedurende 2-5 minuten. De incubatietijd is afhankelijk van de acaciapoederbatch en de temperatuur. Dit moet experimenteel worden gedefinieerd.
    OPMERKING: Een langere incubatietijd kan resulteren in niet-specifieke zilverbinding.
  10. Om de reactie te stoppen, giet u het reactiemengsel af en wast u het gerecht uitgebreid met drie tot vijf verversing van gedeïoniseerd water, gevolgd door nog drie veranderingen gedurende elk 5 minuten.
  11. Controleer de kleuring onder de brightfield microscoop. Goede vlekken moeten licht tot donkerbruin zijn met een zeer zwakke gelige achtergrond.
    OPMERKING: Als de kleuring zich niet ontwikkelt, is het mogelijk om onmiddellijk te herhalen met de reeds gemaakte mix (de mix is ongeveer 15 minuten actief als deze in het donker wordt bewaard). De vlekken kunnen zich in dit geval echter te snel ontwikkelen.

4. Goud toning

OPMERKING: Om zilveren nanodeeltjes te beschermen tegen oplossing door OsO4-oxidatie in de daaropvolgende procedures, wordt bij deze stap een impregnatie met goud gebruikt (Sawada, Esaki, 1994)22.

  1. Spoel coverslips af met gedeïoniseerd water.
  2. Om zilveren nanodeeltjes te beschermen tegen oplossing door OsO4-oxidatie , incubeer de monsters in 0,05% tetrachloorzuur gedurende 2 minuten in het donker.
  3. Was grondig met gedeïoniseerd water gedurende 10 minuten.
    OPMERKING: In dit stadium wordt extra contrast toegevoegd aan het DNA-bevattende materiaal. De kleur van het monster moet veranderen van bruin naar zwart.

5. ChromEM

OPMERKING: Dit protocol is gewijzigd van Ou et al., 201716.

  1. Incubeer de coverslips en verzadig de monsters in 10 μM DRAQ5 in PBS gedurende 10 minuten in het donker.
  2. Bereid 0,2% diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) oplossing in 50 mM Tris of PBS:
    los DAB op in 90% van het uiteindelijke volume door krachtig te roeren in het donker en pas vervolgens de pH aan op 7,0-7,4 met NaOH. Stel het volume in op 100% en filter door een filter van 0,22 μM, bewaar gewikkeld in folie.
  3. Voeg DAB-oplossing toe aan cellen (2 ml per petrischaaltje van 3 cm) en incubeer gedurende 1 minuut.
  4. Verplaats de dekselslip in de petrischaal met glazen bodem en plaats deze op het podium van een omgekeerde microscoop. Bestraal het monster (verschillende gezichtsvelden) op een omgekeerde microscoop met metaalhalogenide lichtbron en Cy5 filterset (640 nm, 1 W/cm2 bij het brandpuntsvlak) door plan Apo λ 40х (NA = 0,95) lens gedurende 10 minuten.
    OPMERKING: Een indicatie van succesvolle DAB-fotoconversie is volledige DRAQ5-fotobleaching en donkere DAB-neerslagvorming in bestraalde kernen. Dit laatste is echter niet altijd duidelijk over een intens EdU-zilver-goudsignaal (vooral wanneer uitgebreide EdU-pulsen worden gebruikt).
  5. Was drie keer met gedeïoniseerd water gedurende elk 5 minuten.

6. Uitdroging en inbedding van epoxyhars

  1. Bereid in een microcentrifugebuis gedeeltelijk gereduceerde osmiumtetraoxideoplossing door 2% waterige oplossing van K4Fe(CN)6 te mengen met een gelijke hoeveelheid van 2% waterige oplossing van OsO4, om 1% eindconcentratie van beide componenten te verkrijgen. Incubeer coverslips in gereduceerd OsO4 gedurende 1 uur en was drie keer in gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten elk.
    OPMERKING: In dit stadium reageert de gereduceerde osmiumverbinding met DAB-afzettingen en verhoogt het contrast van DNA.
    LET OP: Osmium is giftig, werkt onder een zuurkast en verwerkt afval volgens de lokale veiligheidsvoorschriften.
  2. Droog de monsters uit in een reeks gegradeerde ethanoloplossingen in toenemende percentages: 50% EtOH - 3 x 10 min; 70% EtOH - 3 x 10 min, 80% EtOH - 3 x 10 min, 96% EtOH - 3 x 10 min, 100% EtOH - 3 x 10 min.
  3. Gebruik voor infiltratie en inbedding de harsformule met de componentvolumetrische verhouding als volgt: epoxyharsmonomeer:DDSA:MNA:DMP-30 = 9:6:4:0.23 (w/w). Deze formule is mengbaar met ethanol.
    1. Incubeer de coverslip in het ethanol-harsmengsel (3 delen 100% EtOH:1 deel epoxyhars) gedurende 30 min.
    2. Incubeer de coverslip in het ethanol-harsmengsel (1 deel 100% EtOH:1 deel epoxyhars) gedurende 2 uur.
    3. Incubeer de coverslip in het ethanol-harsmengsel (1 deel 100% EtOH:3 delen epoxyhars) 's nachts.
    4. Vervang ethanol-harsmengsel door vers bereide pure hars. Incubeer in pure harsmix gedurende 8 uur. Open de schaal om resten ethanol te laten verdampen.
    5. Breng coverslips over in een nieuwe schaal met pure hars en incubeer gedurende 2 uur bij 37-42 °C.
    6. Vul een siliconen mal met vers bereide hars. Plaats de coverslips met de cellen naar beneden gericht op de juiste siliconen mal gevuld met epoxyhars. Laat de hars 24 uur uitharden bij 37 °C en daarna minstens 2 dagen bij 60 °C.
      LET OP: Componenten van epoxyharsmengsel zijn potentieel kankerverwekkend. Draag handschoenen en werk onder de zuurkast.
  4. Verwijder de harsplaat uit de mal, reinig het oppervlak van de coverslip met het scalpel of scheermesje. Om de coverslip te verwijderen, laat u de coverslip in vloeibare stikstof vallen en brengt u de plaat vervolgens over in het kokende water. Herhaal indien nodig.
  5. Lokaliseer het bestraalde gebied onder een stereomicroscoop en knip het uit de plaat met een ijzerzaag of een ander geschikt instrument. Verwarm de plaat zo nodig voor op 70 °C op een hete plaat.
  6. Bevestig de uitsparing in een ultramicrotome monsterhouder voor het laatste bijsnijden van blokken. Bereid met het scheermes het piramidevormige monster voor. Monteer de houder met piramide op de ultramicrotoom en installeer het mes.
    1. Snijd het blok bij zodat de bestraalde cellen met het EdU-label worden meegeleverd. Bereid een halfdunne sectie (250 nm dikte) voor die geschikt is voor elektronentomografie.
      OPMERKING: De dikte van de sectie kan worden aangepast aan de experimentele vereisten.
  7. Maak het gedeelte los van de rand van het mes en plaats ze op de roosters met één sleuf. Voor elektronentomografie worden 250 nm-secties op 1 mm enkelsluimerroosters geplukt en na het drogen kunnen deze secties van beide zijden koolstofcoating krijgen. Er is geen extra contrastering nodig.
    OPMERKING: Aangezien de secties al Au-Ag-deeltjes met een hoog contrast bevatten, is het niet nodig om fiduciale gouddeeltjes aan het oppervlak van de sectie toe te voegen.
  8. Onderzoek de rasters in een transmissie-elektronenmicroscoop bij lage vergroting (ongeveer 600x) om de cellen met de juiste replicatiepatronen te lokaliseren.
    OPMERKING: Dit protocol genereert een labeldichtheid die hoog genoeg is voor eenvoudige detectie van replicatiehaarden, zelfs bij lage vergroting. Het is raadzaam om eerst een kaart van de sectie te maken voor latere navigatie en hoekprojecties voor tomografie. Schakel over naar een hogere vergroting en maak afbeeldingen met een hoge resolutie.

7. Elektronentomografie

  1. Plaats het rooster in de transmissie-elektronenmicroscoop met een high-tilt houder. Laad het monster in de elektronenmicroscoop en lokaliseer het interessegebied.
  2. Lijn de microscoop uit in EFTEM-modus in bijna parallelle verlichtingsmodus. Stem het energiefilter af met een energieselectie van 20 eV die op een nulverliespiek is geplaatst.
  3. Bestraal het tomografische acquisitiegebied vooraf met een dosissnelheid van 40 e/Å2/s gedurende ten minste 1,5-2 min, wat overeenkomt met de totale dosis van ten minste 3000 e/Å2.
  4. Pas de eucentrische hoogte aan met automatische taak in SerialEM. Controleer de autofocustaak om er zeker van te zijn dat deze correct werkt bij nul kantelhoek en -0,8 mkm doelonscherpte.
  5. Kantel de monsterhouder naar -60° met de Walk-Up taak.
  6. Stel de tomografie-acquisitie in van -60 tot +60° met stap 2,0°. De belichting moet afhankelijk van de kantelhoek worden ingesteld om de gemiddelde intensiteit op de camera te behouden. Beperk de beeldverschuiving in het geval dat het een energieverschuiving veroorzaakt en dus een verkeerde uitlijning van de spleet veroorzaakt. De tomografiegegevens moeten worden opgeslagen als .mrc-bestand.
  7. Importeer het .mrc-bestand in IMOD-software voor tomografiereconstructie. Verwijder de uitschieter pixelwaarden als gevolg van röntgenstralen.
  8. Lijn de kantelreeks uit. Voer de eerste kruiscorrelatie uit en markeer vervolgens handmatig 10-12 gouddeeltjes als fiducials. Volg het fiduciale model en inspecteer of elke fiducial correct wordt gevolgd door de kantelserie. Maak voorbeeldtomogrammen (segmenten) en markeer handmatig de dunne sectieranden om te voorkomen dat de gereconstrueerde dichtheid in het volume kan kantelen. De gemiddelde restfout voor fijne uitlijning was minder dan 1,2 pix.
  9. Reconstrueer het tomogram met een gefilterd backprojectiealgoritme en snijd vervolgens de uitvoer bij zodat deze in het uiteindelijke volume past.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Replicatiehaarden in celkernen van zoogdieren vertonen verschillende distributiepatronen binnen de kern, afhankelijk van de progressie in de S-fase. Deze patronen correleren met transcriptionele activiteit van de loci die wordt gerepliceerd. Aangezien de hier gepresenteerde methode gebruik maakt van een vrij sterkefixatieprocedure, is het vrij eenvoudig om replicatieve pulsetikettering te gebruiken voor specifieke detectie van chromatine loci in verschillende transcriptionele toestanden, zelfs onder omstandigheden die de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven methode heeft verschillende voordelen ten opzichte van eerder gepubliceerde protocollen. Ten eerste elimineert het gebruik van Click-chemie voor het labelen van gerepliceerd DNA de noodzaak van DNA-denaturatievoorwaarde voor BrdU-detectie met antilichamen, waardoor chromatine ultrastructuur beter behouden blijft.

Ten tweede minimaliseert het gebruik van biotine als secundair ligand dat wordt gegenereerd na glutaaraldehydefixatie en het correct blussen van ongebonden aldehyd...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd deels ondersteund door RSF (subsidie #17-15-01290) en RFBR (subsidie #19-015-00273). De auteurs bedanken lomonosov Moscow State University development program (PNR 5.13) en Nikon Center of Excellence in correlative imaging aan het Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology voor toegang tot beeldvormingsinstrumenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens
5-ethynyl-2`-deoxyuridine (EdU)Thermo FisherA10044
2-(4-Morpholino)ethaan sulfonzuur (MES)Fisher ScientificBP300-100
AlexaFluor 555-azideTermo FisherA20012
biotin-azideLumiprobeC3730
Bovine Serum AlbumineBovalLY-0080
DDSASPI-CHEM26544-38-7
DMP-30SPI-CHEM90-72-2
DRAQ5Thermo Scientific62251
EpoxyharsmonomeerSPI-CHEM90529-77-4
Glutaraldehyde (25%, EM Grade)TED PELLA, INC18426
Gom arabicumACROS Organics258850010
MagnesiumchloridePanreac141396.1209
NaBH4SIGMA-ALDRICH213462
NMASPI-CHEM25134-21-8
N-propylgallaatSIGMA-ALDRICHP3130
PBSMP Biomedicals2810305
ZilverlactaatALDRICH359750-5G
Streptavidine-AlexaFluor 488-conjugaatTermo FisherS11223
Streptavidine-Nanogold-conjugaatNanoprobes2016
TetrachloorauraatSIGMA-ALDRICHHT1004
Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris)CHEM-IMPEX INT'L298
Triton X-100Fluka Chemica93420
Instrumenten
Carbon CoaterHitachi
Koperen single slot gridsTed Pella1GC10H
Cy5 fluorescentiefilterset (Ex620/60 DM660 Em700/75)NikonCy5 HQAlternatieven: Zeiss, Leica, Olympus
Diamantmesje Ultra Wet 45oDiatomeDUAlternatieven: Ted Pella
FluorescentiemicroscoopNikonTi-EAlternatieven: Zeiss, Leica, Olympus
High-tilt monsterhouderJeol
RotatorBiosanMulti Bio RS-24
Transmissie-elektronenmicroscoop werkend op 200 kV in EFTEM-modus, met high-tilt goniometerJeolJEM-2100Alternatieven: FEI, Hitachi
PincetTed Pella523
UltramicrotoomLeicaUltraCut-EAlternatieven: RMC
Software
BeeldverwervingOpen SourceSerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)
BeeldverwerkingOpen SourceIMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rivera-Mulia, J. C., Gilbert, D. M. Replicating large genomes: divide and conquer. Molecular Cell. 62 (5), 756-765 (2016).
  2. Méchali, M. Eukaryotic DNA replication origins: Many choices for appropriate answers. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 11 (10), 728-738 (2010).
  3. Chagin, V. O., Stear, J. H., Cardoso, M. C. Organization of DNA replication. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 2 (4), 000737(2010).
  4. Su, Q. P., et al. Superresolution imaging reveals spatiotemporal propagation of human replication foci mediated by CTCF-organized chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Science. 117 (26), 15036-15046 (2020).
  5. Leonhardt, H., et al. Dynamics of DNA replication factories in living cells. Journal of Cell Biology. 149 (2), 271-280 (2000).
  6. Philimonenko, A. A., Hodný, Z., Jackson, D. A., Hozák, P. The microarchitecture of DNA replication domains. Histochemistry and Cell Biology. 125 (1), 103-117 (2006).
  7. Nakamura, H., Morita, T., Sato, C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental Cell Research. 165 (2), 291-297 (1986).
  8. Ma, H., et al. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 143 (6), 1415-1425 (1998).
  9. Zink, D., Bornfleth, H., Visser, A., Cremer, C., Cremer, T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research. 247 (1), 176-188 (1999).
  10. Manders, E. M., Stap, J., Brakenhoff, G. J., van Driel, R., Aten, J. A. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the S-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. Journal of Cell Science. 103 (3), 857-862 (1992).
  11. Maeshima, K., Tamura, S., Hansen, J. C., Itoh, Y. Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell. Current Opinion in Cell Biology. 64, 77-89 (2020).
  12. Kireeva, N., Lakonishok, M., Kireev, I., Hirano, T., Belmont, A. S. Visualization of early chromosome condensation: A hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. Journal of Cell Biology. 166 (6), 775-785 (2004).
  13. Belmont, A. S., Hu, Y., Sinclair, P. B., Wu, W., Bian, Q., Kireev, I. Insights into interphase large-scale chromatin structure from analysis of engineered chromosome regions. Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. 75, 453-460 (2010).
  14. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 236 (5950), 289-293 (2009).
  15. Pope, B. D., et al. Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation. Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).
  16. Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), (2017).
  17. Hozák, P., Jackson, D. A., Cook, P. R. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. Journal of Cell Science. 107 (8), 2191-2202 (1994).
  18. Deng, X., Zhironkina, O. A., Cherepanynets, V. D., Strelkova, O. S., Kireev, I. I., Belmont, A. S. Cytology of DNA replication reveals dynamic plasticity of large-scale chromatin fibers. Current Biology. 26 (18), 2527-2534 (2016).
  19. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Science. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  20. Gilerovitch, H. G., Bishop, G. A., King, J. S., Burry, R. W. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1.4-nm gold particles to localize GAD in the cerebellar nuclei. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 337-343 (1995).
  21. Kireev, I., Lakonishok, M., Liu, W., Joshi, V. N., Powell, R., Belmont, A. S. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nature Methods. 5 (4), 311-313 (2008).
  22. Sawada, H., Esaki, K. Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues. Journal of Electron Microscopy. 43 (6), 361-366 (1994).
  23. He, W., et al. A freeze substitution fixation-based gold enlarging technique for EM studies of endocytosed Nanogold-labeled molecules. Journal of Structural Biology. 160 (1), 103-113 (2007).
  24. Weipoltshammer, K., Schéfer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochemistry and Cell Biology. 114 (6), 489-495 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ChromatineorganisatieEdU labelingnanogouddeeltjeszilverversterkingChromEM kleuringglutaraldehydefixatielabeling v r inbeddingimaging van DNA replicatie

Gerelateerde artikelen