Het meten van mitochondriale elektronenoverdrachtscomplexen in eerder bevroren hartweefsel van de nakomelingen van zeug: een model om door inspanning geïnduceerde mitochondriale bio-energetische veranderingen te beoordelen

Daniel Barrera; Sierra Upton; Megan Rauch; Tara Notarianni; Ki Suk Eum; Megan Liberty; Sarmila Venkoba Sah; Robert Liu; Sean Newcomer; Linda E. May; Emre Agbas; Jessica Sage; Edina Kosa; Abdulbaki Agbas

doi:10.3791/62809

Method Article

Het meten van mitochondriale elektronenoverdrachtscomplexen in eerder bevroren hartweefsel van de nakomelingen van zeug: een model om door inspanning geïnduceerde mitochondriale bio-energetische veranderingen te beoordelen

DOI:

10.3791/62809

⸱

August 16th, 2021

Daniel Barrera¹ , Sierra Upton² , Megan Rauch³ , Tara Notarianni⁴ , Ki Suk Eum⁵ , Megan Liberty⁶ , Sarmila Venkoba Sah⁷ , Robert Liu⁸ , Sean Newcomer⁹ , Linda E. May¹⁰ , Emre Agbas¹¹ , Jessica Sage¹² , Edina Kosa⁷ , Abdulbaki Agbas⁷^,¹³

¹AdventHelath, ²University of Illinois Chicago School of Public Health, ³Lincoln Memorial University, ⁴Children’s Mercy Hospital, ⁵Scripps Clinic, ⁶Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, ⁷Kansas City University, ⁸Roblex Rex Veterans Affairs Medical Center, ⁹California State University San Marcos, ¹⁰East Carolina University, ¹¹Massachusetts Institute of Technology, ¹²Boehringer Ingelheim Norway KS, ¹³Heartland Center for Mitochondrial Medicine

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bereiding van mitochondriën-verrijkte monsters van eerder bevroren gearchiveerde vaste weefsels stelde de onderzoekers in staat om zowel functionele als analytische beoordelingen van mitochondriën uit te voeren in verschillende experimentele modaliteiten. Deze studie toont aan hoe mitochondria-verrijkte preparaten kunnen worden bereid uit bevroren hartweefsel en analytische beoordelingen van mitochondriën kunnen worden uitgevoerd.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het mitochondriale elektronenoverdrachtscomplex (ETC) -profiel wordt gewijzigd in het hartweefsel van de nakomelingen die zijn geboren uit een geoefende zeug. De hypothese die werd voorgesteld en getest was dat een regelmatige maternale oefening van een zeug tijdens de zwangerschap de mitochondriale efficiëntie van de hart-energetica van het nageslacht zou verhogen. Deze hypothese werd getest door mitochondriën te isoleren met behulp van een milde isolatieprocedure om mitochondriale ETC en supercomplexprofielen te beoordelen. De hier beschreven procedure maakte de verwerking van eerder bevroren gearchiveerde hartweefsels mogelijk en elimineerde de noodzaak van verse mitochondriale voorbereiding voor de beoordeling van mitochondriale ETC-complexcomplexen, supercomplexen en ETC-complexe activiteitsprofielen. Dit protocol beschrijft de optimale ETC-eiwitcomplexmeting in multiplexed antilichaamgebaseerde immunoblotting en supercomplexe beoordeling met behulp van blue-native gel-elektroforese.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit protocol was om gedetailleerde stappen te bieden om mitochondria-verrijkte preparaten te verkrijgen uit eerder bevroren hartweefsel met een nieuwe technologie van lage energie mechanische verstoring van weefsel die weefsellysis en extractie van mitochondriën verbetert. Met deze methode wordt een verbeterde extractie-efficiëntie zonder hoge schuifspanning of hoge temperatuur en een korte homogenisatietijd (10-12 s) ^haalbaar1.

Het verkrijgen van mitochondriën uit gearchiveerd bevroren weefsel is een waardevolle aanwinst om zowel ^functionele2 - als biochemische studies

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bevroren hartweefsels van nakomelingen werden ontvangen van Dr. Sean Newcomer samen met de institutionele IACUC-goedkeuringsbrief. De hartweefsels werden verkregen uit een longitudinaal onderzoek, flash-bevroren in vloeibare stikstof, en opgeslagen bij -80 °C voor toekomstig gebruik. Alle protocollen met betrekking tot de verwerking van het hartweefsel van nakomelingen volgden de richtlijnen van de IBC- en IACUC-commissies van de Kansas City University.

1. Bereiding van buffers en reagentia

OPMERKING: Bereid alle monsters voor volgens de richtlijnen van de fabrikant. Gebruik ultragezuiverd water of gelijkwaardig in....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens het protocol werd een goede opbrengst van mitochondriën-verrijkt eiwitmengsel uit hartweefsel bereid. Ongeveer 15 mg /ml mitochondriaal verrijkt eiwitmengsel werd verkregen uit gemiddeld 1,2 g bevroren hartweefsel geoogst van de nakomelingen van de zeug. Observaties gaven aan dat minder dan 0,5 g bevroren hartweefsel niet voldoende mitochondriaal verrijkt eiwitmengsel opleverde om een BN-PAGE-test uit te voeren. De hoeveelheid mitochondriaal preparaat was voldoende om (i) een standaard immunoblotanalyse uit te vo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De kritieke stappen voor dit protocol worden hier aangegeven. Ten eerste moet weefselhomogenisatie zorgvuldig worden behandeld, zodat overmatige pure effecten niet worden toegepast tijdens het weefselhomogenisatieproces. Er moet een weefselversnipperaar worden gebruikt, die deel uitmaakt van de drukcyclustechnologie (PCT) voor initiële weefselhomogenisatie9. Deze stap zal de overmatige slagcyclus van glas-op-glas homogenisator verminderen (figuur 1B) die de toch al fr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd financieel ondersteund door de intramurale beurs van de Kansas City University voor Abdulbaki Agbas en de Summer Research Fellowship voor Daniel Barrera. De auteurs zijn dankbaar voor het redactionele werk van Dr. Jan Talley.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Amino caproic acid	Sigma/Aldrich	A2504-100G
Anti-Hu Total OxPhos complex kit	Invitrogen	458199
anti-VDAC antibody	abcam	ab15895	use 1 µg/mL
Coomassie G-250	ThermoSientific	20279
Coomassie GelCode Blue	ThermoScientific	24592
Digitonin	Cabiochem	300410
Glass-Glass pestle homogenizer	VWR	KT885451-0020
Image Studio	LICOR
IR-Dye conjugated anti-Rabbit Ab	LICOR	LC0725
Multiwell plate reader	BioTek	Synergy HT
Native molecular weight marker	ThermoFisher	BN2001
Nylon mesh monofilament	Small Part Inc	CMN-74
Orbital shaker	ThermoScientfic
PCT Shredder	Pressure Bioscience Inc
SEA BLOCK Blocking buffer	ThermoScienctific	37527
Shredder PULSE Tube	Pressure Bioscience Inc	FT500-PS
Table top centrifuge	Eppendorf	5418
Trypsin	Amresco	M150-1G
Trypsin inhibitor	Amresco	M191-1G	Requires fresh preparation

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
Osto, C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Het meten van mitochondriale elektronenoverdrachtscomplexen in eerder bevroren hartweefsel van de nakomelingen van zeug: een model om door inspanning geïnduceerde mitochondriale bio-energetische veranderingen te beoordelen

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles