Het meten van mitochondriale elektronenoverdrachtscomplexen in eerder bevroren hartweefsel van de nakomelingen van zeug: een model om door inspanning geïnduceerde mitochondriale bio-energetische veranderingen te beoordelen

Samenvatting

Bereiding van mitochondriën-verrijkte monsters van eerder bevroren gearchiveerde vaste weefsels stelde de onderzoekers in staat om zowel functionele als analytische beoordelingen van mitochondriën uit te voeren in verschillende experimentele modaliteiten. Deze studie toont aan hoe mitochondria-verrijkte preparaten kunnen worden bereid uit bevroren hartweefsel en analytische beoordelingen van mitochondriën kunnen worden uitgevoerd.

Samenvatting

Het mitochondriale elektronenoverdrachtscomplex (ETC) -profiel wordt gewijzigd in het hartweefsel van de nakomelingen die zijn geboren uit een geoefende zeug. De hypothese die werd voorgesteld en getest was dat een regelmatige maternale oefening van een zeug tijdens de zwangerschap de mitochondriale efficiëntie van de hart-energetica van het nageslacht zou verhogen. Deze hypothese werd getest door mitochondriën te isoleren met behulp van een milde isolatieprocedure om mitochondriale ETC en supercomplexprofielen te beoordelen. De hier beschreven procedure maakte de verwerking van eerder bevroren gearchiveerde hartweefsels mogelijk en elimineerde de noodzaak van verse mitochondriale voorbereiding voor de beoordeling van mitochondriale ETC-complexcomplexen, supercomplexen en ETC-complexe activiteitsprofielen. Dit protocol beschrijft de optimale ETC-eiwitcomplexmeting in multiplexed antilichaamgebaseerde immunoblotting en supercomplexe beoordeling met behulp van blue-native gel-elektroforese.

Inleiding

Het doel van dit protocol was om gedetailleerde stappen te bieden om mitochondria-verrijkte preparaten te verkrijgen uit eerder bevroren hartweefsel met een nieuwe technologie van lage energie mechanische verstoring van weefsel die weefsellysis en extractie van mitochondriën verbetert. Met deze methode wordt een verbeterde extractie-efficiëntie zonder hoge schuifspanning of hoge temperatuur en een korte homogenisatietijd (10-12 s) ^haalbaar1.

Het verkrijgen van mitochondriën uit gearchiveerd bevroren weefsel is een waardevolle aanwinst om zowel ^functionele2 - als biochemische studies ^{uit te voeren3} anders niet gemakkelijk herhaalbaar onder de exacte experimentele omstandigheden. Een klassieke Potter-Elvehjem Teflon stamperglashomogenisator of Dounce-homogenisator is gebruikt en wordt nog steeds gebruikt in onderzoekslaboratoria om zachte weefsels zoals lever, nieren en hersenen te homogeniseren. Het homogeniseren van harde weefsels zoals spieren en hart vereist echter meer homogenisatietijd, enzymbehandeling, snelle homogenisatie en uitgebreide gebruikerservaring. Dit is nadelig voor het extraheren van intacte organellen zoals mitochondriën uit hard weefsel zoals spieren en hart. De methode die in dit protocol wordt beschreven, wordt gebruikt om mitochondriaal verrijkt preparaat met hoge opbrengst te verkrijgen om mitochondriale elektronentransportketen (ETC) eiwitcomplexen en hun supercomplexe vorming te analyseren in hartweefsels geoogst van nakomelingen geboren uit geoefende en sedentaire zeug, flash-bevroren in vloeibare stikstof en opgeslagen bij -80 ° C voor toekomstig gebruik. Met deze methode kan de gebruiker mitochondriaal verrijkt preparaat isoleren uit eerder bevroren gearchiveerde weefsels.

Blootstelling aan externe nanomaterialen aan zwangere knaagdieren kan de hartfunctie en mitochondriale ademhaling en bio-energetica op nakomelingen tijdens de zwangerschap negatief ^{beïnvloeden4}. Niettemin moeten aërobe door inspanning geïnduceerde positieve veranderingen in foetale myocytenbio-energetica tijdens de zwangerschap nog worden gedocumenteerd. Opkomende studies leveren echter bewijs dat maternale aerobe oefening tijdens de zwangerschap een positieve invloed heeft op de foetale ^hartfunctie5. Om verder bewijs te leveren, werd een analyse uitgevoerd van de longitudinale effecten van maternale oefening op de cardiale mitochondriale respiratoire ketencomplexen van nakomelingen (d.w.z. Complex I tot en met Complex V) tijdens de zwangerschap.

Deze studie heeft een aanzienlijke gezondheidsrelevantie omdat de resultaten kunnen suggereren dat maternale oefening de efficiëntie van de energieproductie in de hartochondriën van het nageslacht verbetert. In deze studie werden zeugen (vrouwelijk varken) om twee redenen als diermodel gebruikt: (i) hartfysiologie is vergelijkbaar met die van de ^mens6, en (ii) hartweefseloogst van nakomelingen uit verschillende tijdspunten is haalbaar onder een institutionele IACUC-goedkeuring. De voorgestelde studie is bedoeld om veel van de fundamentele vragen te beantwoorden die moederlijke oefening en de potentiële positieve effecten ervan op de cellulaire en biochemische samenstelling van het hartweefsel van de nakomelingen verbinden. Deze aanpak vereist zachte maar effectieve mitochondriale isolatietechnieken van eerder bevroren hartweefsel verkregen uit de langdurige en kostbare longitudinale studies die de problemen van de bio-energetische veranderingen in foetale hartmyocyten tijdens de zwangerschap aanpakten. De methode die in deze studie wordt beschreven, maakt het mogelijk om grote sommen eerder bevroren gearchiveerd weefsel te gebruiken voor mitochondria-verrijkte voorbereiding voor zowel analytische als functionele studies. De studie zal ook helpen de kenniskloof op dit gebied te dichten door voorlopige gegevens te verstrekken, wat zou kunnen leiden tot toekomstige studies die de effecten van maternale lichaamsbeweging op de gezondheid van het hart in de baarmoeder en daarbuiten bepalen.

Protocol

Bevroren hartweefsels van nakomelingen werden ontvangen van Dr. Sean Newcomer samen met de institutionele IACUC-goedkeuringsbrief. De hartweefsels werden verkregen uit een longitudinaal onderzoek, flash-bevroren in vloeibare stikstof, en opgeslagen bij -80 °C voor toekomstig gebruik. Alle protocollen met betrekking tot de verwerking van het hartweefsel van nakomelingen volgden de richtlijnen van de IBC- en IACUC-commissies van de Kansas City University.

1. Bereiding van buffers en reagentia

OPMERKING: Bereid alle monsters voor volgens de richtlijnen van de fabrikant. Gebruik ultragezuiverd water of gelijkwaardig in alle recepten en protocolstappen. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumkleding, mondkapje, handschoenen en bril/gezichtsscherm) tijdens deze procedure. Buffervolumes zijn geschikt voor het verwerken van zes weefselmonsters.

1. Bereid 1,5 l weefselwasbuffer door 154,035 g sucrose (0,3 m definitief), 3,904 g HEPES (10 mM finale), 0,111 g EDTA (0,2 mM finale) te combineren. Voeg ingrediënten toe aan 1,0 l water op de roerplaat, stel de pH in op 7,2 met verdunde HCl en make-up tot het uiteindelijke volume tot 1,5 l.
   OPMERKING: Er is ongeveer 200 ml wasbuffer nodig per monster (50-300 mg). Zes weefselmonsters kunnen op een dag worden verwerkt. Gebruik de resterende wasbuffer om een isolatiebuffer te maken.
2. Bereid de isolatiebuffer voor uit de wasbuffer die eerder in stap 1.1 is beschreven door 210 mg BSA toe te voegen aan 210 ml wasbuffer. Stel de pH in op 7,4 met verdunde NaOH-oplossing.
   OPMERKING: Er is ongeveer 35 ml isolatiebuffer nodig per weefselmonster; daarom is 210 ml isolatiebuffer vereist voor zes monsters. Bereid deze buffer door op de dag van bereiding verse BSA-oplossing (1 mg / ml finale) toe te voegen. BSA wordt gebruikt om mitochondriën te isoleren omdat het de mitochondriale eigenschappen verbetert door natuurlijke ontkoppelaars zoals vrije vetzuren te verwijderen. BSA blijkt antioxiderende activiteit te hebben door de oxidatiesnelheid van substraten, vooral succinaat, ^{in de} mitochondriën van de hersenen7 te verhogen. Als alternatief kan runderserumalbumine worden vervangen door goedkopere zuurvrije analogen zoals ovalbumine.
3. Bereid 150 ml resuspensiebuffer voor door 0,011 g EDTA (eindconcentratie van 0,2 mM EDTA) te combineren of gebruik 150 μL 200 mM voorraad EDTA-oplossing voor 150 ml resuspensiebuffer), 12,836 g sucrose (0,25 M sucrose eindconcentratie) en 0,236 g Tris (10 mM Tris-HCl final). Stel de pH in op 7,8 met 0,1 N NaOH. Voeg vlak voor gebruik 60 μL van de proteaseremmercocktail toe.
4. Bereid de trypsineoplossing door 7,5 mg trypsine op te lossen in 3,0 ml 1 mM HCl (2,5 mg trypsine/ml finale). Deze hoeveelheid is voldoende voor één monster.
   OPMERKING: Bereid de trypsineoplossing op basis van het aantal weefselmonsters dat zal worden verwerkt.
5. Bereid de trypsineremmeroplossing uit sojabonen door 13,0 mg trypsineremmer te combineren in 20 ml isolatiebuffer met BSA (0,65 mg/ml trypsineremmer final).
   OPMERKING: Bereid een verse trypsineremmeroplossing.
6. Bereid het ammoniumpersulfaatreagens door 0,1 g ammoniumpersulfaat toe te voegen in 1 ml water (10% ammoniumpersulfaatfinale).
   OPMERKING: Het ammoniumpersulfaatreagens moet vers worden bereid of een groot volume kan worden gealiquoteerd en bewaard in een vriezer van -20 °C.
7. Bereid de aminocapronzuuroplossing (ACA) door 0,131 g 6-aminocapronzuur te combineren in 1,0 ml ultragezuiverd water en bewaar het in 4 °C (1 M 6-aminocapronzuur definitief).
8. Bereid de Coomassie briljante blauwe kleurstofoplossing door 1 g Coomassie G-250 op te lossen in 0,5 ml water en 0,5 ml 1 m aminocapronzuur (eindconcentratie van 10% kleurstofoplossing).
9. Bereid 5% Digitonin voor Blue native-PAGE (BN-PAGE). Bereken ongeveer hoeveel digitonine nodig is in de monstervoorbereiding plus wat extra volume om de pipetteerfouten te compenseren (overschatting met 10 mg). Voor 15 mg: Verdun eerst 15 mg digitonine in 30 μL 100% DMSO. Vortex om het digitonine te helpen in de oplossing te komen. Voeg vervolgens de resterende 90% _ddH2O (270 μL) toe. Verwarm zachtjes om de oplossing te mengen (vortex) en koel deze vervolgens af op ijs.
10. Bereid de native PAGE-anodebuffer voor. Voeg 50 ml 20x native PAGE-lopende buffer toe aan 950 ml water om een eindvolume van 1 l te maken. Bereid verse anodebuffer voor onmiddellijk gebruik. Gebruik dit als 1x lopende buffer.
11. Bereid een donkerblauwe kathodebuffer voor. Los 0,0160 g Coomassie briljantblauwe G-250 op in 80 ml native PAGE-anodebuffer; meng goed.
    OPMERKING: Bereid een verse kathodebuffer voor onmiddellijk gebruik. Er kan slechts 60 ml nodig zijn, maar maak een extra 20 ml in het geval van lekken.
12. Bereid de lichtblauwe kathodebuffer voor. Voeg 20 ml donkerblauwe kathodebuffer toe aan 180 ml native PAGE-anodebuffer en meng goed.
    OPMERKING: Deze buffer kan slechts één keer worden gebruikt.
13. Bereid 5% Coomassie G-250 als een monsteradditief. Verdun 200 μL van 10% Coomassie-bouillon die al is gemaakt (stap 1.8) met 200 μL van 1 M ACA en bewaar bij de 4 °C.
14. Bereid 4x native PAGE-monsterbuffer voor door 40% glycerol, 0,04% Ponceau S, 25 mM Tris-HCl (pH 6,8), 192 mM glycine te combineren in 10 ml eindvolume. Vul ze toe en bewaar ze bij -20 °C in de vriezer.

2. Mitochondriale isolatie van bevroren hartweefsel

OPMERKING: Voer de mitochondriale isolatieprocedure uit in een koude ruimte van 4 °C. In geval van onbeschikbaarheid van de koelcel, gebruik dan een groot ijsbad om de procedure uit te voeren.

1. Neem eerder ingevroren hartweefselmonsters uit de -80 °C vriezer.
   OPMERKING: Maximaal vier weefselmonsters kunnen comfortabel worden verwerkt voor mitochondriale isolatie op een bepaalde dag.
2. Weeg de buis met het hartweefselmonster en noteer het gewicht. Bereid drie bekers (elk 50 ml) met 40 ml wasbuffer. Koel elk bekerglas in het ijszoutbad met gelijke hoeveelheden ijs en zout gemengd gedurende 3-5 minuten voordat u doorgaat naar de volgende stap. Plaats magnetische roerstaafjes in elk bekerglas en stel de roerder in op gemiddelde snelheid.
   OPMERKING: Vries de bekers niet te veel in en gebruik ze onmiddellijk net nadat wolken ijskristallen beginnen te verschijnen.
3. Doe het bevroren hartweefsel direct in de ijskoude oplossing in het eerste bekerglas. Wacht ongeveer 5 minuten terwijl u roert en lichte druk uitoefent op het weefsel met een pincet om zoveel mogelijk bloed eruit te krijgen.
4. Weeg de lege buis en trek af van het oorspronkelijke gewicht (stap 2.2) om een nettogewicht van het hartweefsel te verkrijgen.
5. Haal het zakdoekje eruit met een tang en knijp in het hart met een schone papieren handdoek van filtreerpapier om bloed te verwijderen. Plaats vervolgens het weefsel in het tweede bekerglas. Wacht ongeveer 5 minuten tijdens het roeren om overtollig bloed te verwijderen.
6. Droog het zakdoekje voorzichtig af op een papieren handdoek. Verwijder al het vet, gestold bloed, oorschelpen en fasciae (wit weefsel). Pool vervolgens het ventriculaire weefsel.
7. Versnipper de weefselmonsters met behulp van de shredder door de stappen 2.7.1-2.7.9 te volgen.
   1. Plaats het hartweefsel (~ 50-300 mg) vanaf de ramzijde in de weefselversnipperaarkamer.

Figuur 1: Weefselversnipperaarkamer (buis) voor gebruik met de shredder. Weefselhomogenisatie in de shredderbuis vereist ongeveer 10-12 s per weefselmonster. Weefselhomogenisatie is voltooid zodra het gehomogeniseerde weefsel door de geperforeerde schijf naar de bovenste kamer gaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Voeg ~ 0,2-0,8 ml wasbuffer toe aan de dopzijde van de buis.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat het totale volume van het monster en de wasbuffer gecombineerd tijdens het versnipperen niet groter is dan 0,7-0,8 ml.
3. Gebruik het buisgereedschap om de shredderkamer met de shredderdop goed af te sluiten.
   OPMERKING: Draai de shredderdop niet te strak aan.
4. Plaats de shredderkamer in de shredderhouder met de ramzijde naar beneden. De ram zal een fitting in de shredderhouder inschakelen.
5. Plaats het bit van de shredderdriver; laat het bit in contact komen met de shredderdop. Zorg ervoor dat het bit goed op zijn plaats zit.
   OPMERKING: Gebruik altijd de volledig opgeladen shredderdriver.
6. Oefen handmatig druk uit op de shredderdriver en de shredderkamer totdat de drukindicator op de shredderhouder een instelling van ongeveer 2 op de shredderhouder bereikt.
   OPMERKING: De instelling kan op een hoger niveau zijn als het versnipperen van weefsel vezeliger is.
7. Voer de shredderdriver ongeveer 10-12 s uit door op de trigger van de shredderdriver te drukken, terwijl de instelling op 2 blijft.
8. Kijk naar de buis om te controleren of alle of het grootste deel van de vaste massa van het weefsel door de lysisschijf wordt versnipperd en naar de bovenste kamer van de shredderkamer wordt gebracht door naar de buis te kijken.
   OPMERKING: Het kan nodig zijn om het weefselmonster voor een langere periode te versnipperen. Breng de buis gewoon terug naar de shredderhouder en ga verder met het proces. De meeste soorten weefselmonsters vereisen slechts 10-12 s versnippering. Hoewel alle versnippering wat warmte zal produceren als gevolg van wrijving, zal deze korte verwerkingstijd het monster niet significant verwarmen.
9. Na het versnipperen van het monster tilt u de shredderkamer uit de houdereenheid. Gebruik het buisgereedschap om de shredderdop te verwijderen en op een schoon oppervlak te plaatsen voor later gebruik.
   OPMERKING: De shredderdop moet worden beschouwd als verontreinigd met monsterextract en kan, afhankelijk van het monstertype, verontreinigd zijn met infectieus materiaal. Gebruik niet dezelfde shredderdop voor andere weefselmonsters om kruisbesmetting te voorkomen.

8. Breng het versnipperde hartweefsel over in het derde bekerglas met 40 ml wasbuffer en roerstaaf en roer het weefsel gedurende 5 minuten met een gemiddelde snelheid op de roerplaat.
9. Filtreer de suspensie door een nylon mesh monofilament (poriegrootte van 74 μm) en gooi het filtraat weg. Was het versnipperde weefsel 3x op het filter met 10 ml wasbuffer.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat het nylon gaas monofilament vooraf is bevochtigd met water.
10. Breng het gewassen en versnipperde weefsel over in een bekerglas van 50 ml met 20 ml wasbuffer en plaats het bekerglas in het ijsbad op de magneetroerder. Voeg 0,5 ml trypsine-oplossing toe terwijl u gedurende 15 minuten constant roert. Breng ongeveer halverwege de incubatie (na ongeveer 7,5 min) de weefselsuspensie over in een loszittende handheld glas-op-glas homogenisator die 0-15 ml volume vasthoudt.

Figuur 1: Weefselversnipperaarkamer (buis) voor gebruik met de shredder. Weefselhomogenisatie in de shredderbuis vereist ongeveer 10-12 s per weefselmonster. Weefselhomogenisatie is voltooid zodra het gehomogeniseerde weefsel door de geperforeerde schijf naar de bovenste kamer gaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

11. Homogeniseren voorzichtig met 4-5 slagen om de suspensie te verspreiden zonder schuim te produceren. Plaats het homogenaat in een bekerglas van 50 ml en meng voorzichtig op een roerplaat gedurende 15 minuten bij 4 °C.
12. Voeg na 15 minuten incubatie 10 ml van de isolatiebuffer die de trypsineremmer bevat toe aan het bekerglas dat het homogenaat bevat en incubeer gedurende 1 min bij 4 °C terwijl u voorzichtig roert.
13. Filtreer de suspensie opnieuw door een nylon filter en bewaar het filtraat in een conische buis van 50 ml.
14. Verzamel de deeltjesfractie die achterblijft op het nylonfilter en plaats deze in de glas-op-glas homogenisator. Voeg 15-20 ml van de wasbuffer toe en homogeniseer voorzichtig met de hand gedurende 25-30 s.
    OPMERKING: Het filtraat stroomt in deze stap heel langzaam. Om de filtraatstroom te vergroten, plaatst u de trechterpunt die de binnenkant van de conische buis raakt.
15. Combineer het homogenaat met het filtraat, balanceer de buizen en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 600 x g .
16. Filter het resulterende supernatant in een nieuwe conische buis met behulp van een nylon filter om verontreiniging door de pellet te voorkomen. Laat de centrifuge gedurende 15 minuten bij 4 °C opnieuw op 8.500 x g draaien.
    OPMERKING: Gebruik een plastic transferpipet om het supernatant te verwijderen en offer 0,2 ml supernatant op van de bovenkant van de donzige pellet.
17. Gooi het supernatant weg en spoel de pellet 2-3 keer af met 1 ml van de isolatiebuffer. Zorg ervoor dat u de donzige witte buitenste randlaag elke keer weggooit.
    OPMERKING: Was de pellet door de isolatiebuffer toe te voegen met een pipet met een punt van 1 ml of een nieuwe transferpipet. Voeg de buffer toe aan de zijkant van de buis, niet direct boven de pellet, om te voorkomen dat de pellet breekt en om verontreiniging van het supernatant te voorkomen. Zuig vervolgens de buffer op met een transferpipet en herhaal het proces nog twee keer.
18. Voeg 5 ml van de isolatiebuffer toe aan elke buis en breek de pellet met een pipet met een punt van 1 ml of een nieuwe transferpipet.
19. Verdun de suspensie met 20 ml extra isolatiebuffer en laat de centrifuge gedurende 15 minuten bij 4 °C opnieuw draaien bij 8.500 x g .
20. Gooi het supernatant weg en suspend de pellet in 5 ml van de resuspendatiebuffer. Voeg vervolgens 15 ml meer van de buffer toe voor een totaal van 20 ml en centrifugeer bij 8.500 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg. De resulterende bruine pellet bevat gewassen intacte mitochondriën.
21. Resuspend de mitochondria-verrijkte pellet in 250 μL van de resuspenderende buffer, inclusief proteaseremmers. Aliquot in 25 μL, snel invriezen in vloeibare stikstof en bewaren in een -80 °C diepvriezer gedurende meerdere jaren.
    OPMERKING: Bespaar 5 μL mitochondriënverrijkt preparaat voor de eiwitanalysetest. Voor een BN-PAGE (Blue native-PAGE) studie, aliquot de geresuspendeerde pellet in 50 μg mitochondriaal eiwit per buis. Centrifugeer bij 8.500 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Zuig het supernatant voorzichtig op en bewaar de mitochondriale pellet (50 μg eiwit/aliquot) gedurende enkele jaren in een diepvriezer van -80 °C.

3. Mitochondriale elektronenoverdracht complex (ETC) beoordeling

OPMERKING: Individuele mitochondriale ETC-eiwitten (d.w.z. Complex-I, II, III, IV, V) kunnen worden beoordeeld met behulp van een standaard immunoblotting-assay. Vanwege de verscheidenheid aan monsters (vier tijdstippen: 48 h, 3 maanden, 6 maanden, 9 maanden), twee experimentele aandoeningen (geoefend en sedentair) en een aantal immunoprobing antilichamen (vijf antilichamen), wordt een multiplexed immunoblotting aanbevolen. Voer multiplexed immunoblotting als volgt uit.

1. Los 50 μg mitochondriaal verrijkt eiwitmonster / put op in 4% -20% gradiënt polyacrylamide gel elektroforese (100 V, 90 min).
2. Breng de eiwitten over op een PVDF-membraan (75 V; 60 min)
3. Blokkeer het membraan in een blokkerende bufferoplossing gedurende ten minste 1 uur bij 4 °C.
   OPMERKING: De blokkeringstijd kan worden verlengd tot 's nachts bij 4 °C. De blokkerende buffer (Table of Materials) bevat niet-zoogdieringrediënten (d.w.z. viseiwitten) die minder snel specifieke bindingsinteracties hebben met antilichamen en andere zoogdiereiwitten die aanwezig zijn in typische methoden.
4. Onderzoek het membraan met de antilichaamcocktail inclusief anti-Complex-I, II, III, IV, V-antilichamen en incubeer 's nachts op een orbitale shaker bij 4 °C.
5. Was de volgende dag het membraan en de sonde met IR-gelabeld secundair antilichaam gedurende 2 uur op een orbitale shaker bij RT (kamertemperatuur).
6. Vijf keer wassen met 1x TBS-T (TBS met Tween 20) en één keer met 1x TBS (Tris gebufferde zoutoplossing).
   OPMERKING: Neem voor de laatste wasbeurt geen wasmiddel op in de TBS-buffer.
7. Stel de vlek in een afbeeldingsanalysator voor.

4. De mitochondriale supercomplex beoordeling door Blue Native Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE)

LET OP: Een supercomplex profiel van ETC kan ook worden beoordeeld door gebruik te maken van de BN-PAGE techniek.

1. Bereid de monsterbuffercocktail voor op 20 μL per 50 μg mitochondria-verrijkt pelleteiwit (7 μL water + 5 μL 4x native polyacrylamide gel elektroforese monster laadbuffer + 8 μL 5% Digitonin + 2 μL Coomassie G-250).
   OPMERKING: Maak een buffercocktail met voorraadmonster, afhankelijk van het aantal beschikbare monsters (50 μg eiwit /monster). Kies de juiste digitoninehoeveelheden op basis van de eiwitconcentratie van de met mitochondriën verrijkte pellet (tabel 1)⁸.
2. Verwarm de digitonin bouillon gedurende 3 minuten op 95 °C, meng en koel af op ijs voordat je de mastermix maakt.
3. Voeg het Coomassie G-250 monsteradditief toe net voordat u de monsters in de gel laadt.
4. Voeg 20 μL van de monsterbuffercocktail toe in een buis die 50 μg mitochondriale eiwitkorrel bevat. Verzacht/resuspend de pellet door de pellet voorzichtig te mengen met een pipet zonder schuim te genereren.
5. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten op ijs om maximale oplosbaarheid van de met mitochondriën verrijkte pellet te bereiken. Veeg van tijd tot tijd voorzichtig met de buizen om de oplosbaarheid te verbeteren.
6. Bereid in afwachting van incubatie de native PAGE-anodebuffer/1x lopende buffer en de donkerblauw gekleurde kathodebuffer voor.
7. Centrifugeer de opgeloste mitochondria-verrijkte pellet bij 20.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
8. Verzamel na centrifugeren 15 μL van het supernatant in nieuwe buizen die op ijs worden geplaatst.
9. Voeg de juiste hoeveelheid van 5% Coomassie G-250-reagens toe aan het supernatant dat is verkregen in stap 4.8 (zie tabel 1).
   OPMERKING: Het 5% Coomassie G-250-volume moet zodanig zijn dat de uiteindelijke concentratie van de kleurstof 1/4 van de wasmiddelconcentratie is. Voer deze stap uit vlak voordat u de monsters in de gel laadt.

Eiwit	Digitonine/eiwit	4x voorbeeldbuffer	5% Digitonine	Water	Laatste deel	5% Coomassie G-250
	verhouding (g/g)					monster additief
50 μg	8	5	8	7	20	2
50 μg	4	5	4	11	20	1

Tabel 1: Sample Buffer Cocktail Preparation met twee verschillende verhoudingen tussen wasmiddel en eiwit. Om maximale oplosbaarheid van membraaneiwitten uit de mitochondriale suspensie te bereiken, moet de concentratie van digitonine/mitochondriaal suspensie-eiwit worden aangepast tot tussen 4-8 g digitonine/g eiwit. In het hartweefsel werd 400 μg digitonine voor 50 μg mitochondriale suspensie-eiwitten (d.w.z. 8 g digitonine / g mitochondriaal eiwit) gebruikt om de oplosbaarheid van de supercomplexen uit de mitochondriale suspensie te maximaliseren.

10. Giet een 3%-8% gradiëntgel, verwijder de kam en was de putjes van de gel met 1x lopende buffer drie keer uit.
    OPMERKING: De gel polymeriseert het beste als deze een dag van tevoren wordt gegoten.
11. Stel het elektroforesesysteem in en plaats de gel in het apparaat.
12. Vul de monsterputten met de donkerblauw gekleurde kathodebuffer.
13. Laad 10 μL van de ongekleurde eiwitstandaard als een native moleculaire gewichtsmarker op de eerste en laatste put van de gel.
14. Laad de volledige hoeveelheid van het monster supernatant + Coomassie monsteradditief bereid in stap 4.9 hierboven in de putjes met behulp van een gel-ladende tip met platte kop.
15. Vul de minicelbufferdam voorzichtig met ongeveer 60 ml donkerblauw gekleurde kathodebuffer zonder de monsters in de putten te verstoren en vul vervolgens het buffervat met de native PAGE 1x lopende buffer.
16. Zet de voeding aan en elektroforeer de monsters op 150 V gedurende ongeveer 30 minuten.
17. Verwijder de donkerblauwe kleur kathodebuffer uit de bufferdam (binnenkamer) met een transferpipet of zuig de monsterputten op. Vul de binnenkamer met 150-200 ml lichtblauw gekleurde kathodebuffer en laat de elektroforese gedurende 60 minuten op 250 V draaien.
    OPMERKING: De elektroforesetijd kan worden bepaald door te controleren wanneer de voorkant van de kleurstof slechts 0,5 cm boven de bodem van de gelcassette migreert.
18. Verwijder de gel uit de cassette en plaats deze in een schoon plastic bakje. Was de gel met gedestilleerd water van goede kwaliteit gedurende 15 minuten op een rocker / orbitale shaker.
    OPMERKING: Om de verloopgel uit de cassette te verwijderen, hanteert u de cassette vanaf de onderkant, die sterker is, om de kans op breuk te minimaliseren.
19. Giet water af, dompel de gel onder in een voldoende hoeveelheid Coomassie GelCode Blue vlekreagens en incubeer gedurende 1 uur op een orbitaal / rocker bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Meng de blue stain reagent (Table of Materials) oplossing voor gebruik door de fles meerdere keren voorzichtig te draaien.
20. Decanteer de verfoplossing, voeg gedestilleerd water toe, spoel meerdere keren met water en doe vervolgens de orbitaal / rocker op om vast te houden.
    OPMERKING: Steek een stuk spons (~ 3 cm x 0,5 cm) in de gel-destaining container en laat de gel voor een nacht vasthouden. De spons adsorbeert de kleurstofdeeltjes zonder dat er meerdere waterverversingen nodig zijn.
21. Analyseer de gel in een beeldanalysator.

5. Mitochondria supercomplex beoordeling door immunoblot blot analyse

1. Voer een nieuwe set BN-PAGE uit zonder de gel aan het einde van de elektroforese te kleuren.
2. Volg dezelfde procedure als in rubriek 3 (mitochondriaal elektronenoverdrachtscomplex (ETC)-beoordeling) om de immunoblotting te voltooien.

Resultaten

Volgens het protocol werd een goede opbrengst van mitochondriën-verrijkt eiwitmengsel uit hartweefsel bereid. Ongeveer 15 mg /ml mitochondriaal verrijkt eiwitmengsel werd verkregen uit gemiddeld 1,2 g bevroren hartweefsel geoogst van de nakomelingen van de zeug. Observaties gaven aan dat minder dan 0,5 g bevroren hartweefsel niet voldoende mitochondriaal verrijkt eiwitmengsel opleverde om een BN-PAGE-test uit te voeren. De hoeveelheid mitochondriaal preparaat was voldoende om (i) een standaard immunoblotanalyse uit te vo...

Discussie

De kritieke stappen voor dit protocol worden hier aangegeven. Ten eerste moet weefselhomogenisatie zorgvuldig worden behandeld, zodat overmatige pure effecten niet worden toegepast tijdens het weefselhomogenisatieproces. Er moet een weefselversnipperaar worden gebruikt, die deel uitmaakt van de drukcyclustechnologie (PCT) voor initiële weefselhomogenisatie9. Deze stap zal de overmatige slagcyclus van glas-op-glas homogenisator verminderen (figuur 1B) die de toch al fr...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Aminokaproïnezuur	Sigma/Aldrich	A2504-100G
Anti-Hu Total OxPhos complex kit	Invitrogen	458199
anti-VDAC-antilichaam	abcam	ab15895	gebruik 1 µg/mL
Coomassie G-250	ThermoSientific	20279
Coomassie GelCode Blue	ThermoScientific	24592
Digitonine	Cabiochem	300410
Glas-glas mortelstamper homogenisator	VWR	KT885451-0020
Image Studio	LICOR
IR-Dye geconjugeerd anti-Konijn Ab	LICOR	LC0725
Multiwell plate reader	BioTek	Synergy HT
Native moleculair gewichtsmarker	ThermoFisher	BN2001
Nylon gaas monofilament	Small Part Inc	CMN-74
Orbitale shaker	ThermoScientfic
PCT Shredder	Pressure Bioscience Inc
SEA BLOCK Blokkeer buffer	ThermoScienctific	37527
Shredder PULSE Buis	Pressure Bioscience Inc	FT500-PS
Tischcentrifuge	Eppendorf	5418
Trypsine	Amresco	M150-1G
Trypsine inhibitor	Amresco	M191-1G	Vereist verse bereiding