Method Article

Gebruiksvriendelijke, high-throughput en volledig geautomatiseerde data-acquisitie software voor cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje

DOI:

10.3791/62832

⸱

July 29th, 2021

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, 2Gatan Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje vereist een geschikt softwarepakket en een gebruiksvriendelijke pijplijn voor automatische data-acquisitie met hoge doorvoer. Hier presenteren we de toepassing van een volledig geautomatiseerd softwarepakket voor beeldacquisitie, Latitude-S, en een praktische pijplijn voor het verzamelen van gegevens van verglaasde biomoleculen onder omstandigheden met een lage dosis.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren hebben technologische en methodologische ontwikkelingen in cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje (cryo-EM) een nieuwe weg vrijgemaakt voor de hoge-resolutie structuurbepaling van biologische macromoleculen. Ondanks de opmerkelijke vooruitgang in cryo-EM, is er nog steeds ruimte voor verbetering in verschillende aspecten van de single-particle analyse workflow. Single-particle analyse vereist een geschikt softwarepakket voor high-throughput automatische data-acquisitie. In de afgelopen acht jaar zijn verschillende softwarepakketten voor automatische data-acquisitie ontwikkeld voor automatische beeldvorming voor cryo-EM met één deeltje. Dit artikel presenteert een toepassing van een volledig geautomatiseerde beeldacquisitiepijplijn voor verglaasde biomoleculen onder omstandigheden met een lage dosis.

Het demonstreert een softwarepakket, dat cryo-EM-gegevens volledig, automatisch en nauwkeurig kan verzamelen. Bovendien worden verschillende microscopische parameters eenvoudig geregeld door dit softwarepakket. Dit protocol demonstreert het potentieel van dit softwarepakket in geautomatiseerde beeldvorming van het spike-eiwit severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2 (SARS-CoV-2) met een 200 keV cryo-elektronenmicroscoop uitgerust met een directe elektronendetector (DED). Ongeveer 3.000 cryo-EM-filmbeelden werden verkregen in een enkele sessie (48 uur) van gegevensverzameling, wat een atomaire resolutiestructuur van het spike-eiwit van SARS-CoV-2 opleverde. Bovendien geeft deze structurele studie aan dat het spike-eiwit twee belangrijke conformaties aanneemt, 1-RBD (receptor-bindend domein) open en alle RBD-down gesloten conformaties.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryo-EM met één deeltje is een mainstream structurele biologietechniek geworden voor structuurbepaling met hoge resolutie van biologische macromoleculen1. Reconstructie van één deeltje is afhankelijk van het verkrijgen van een groot aantal microfoto's van verglaasde monsters om tweedimensionale (2D) deeltjesbeelden te extraheren, die vervolgens worden gebruikt om een driedimensionale (3D) structuur van een biologisch macromolecuul te reconstrueren2,3. Vóór de ontwikkeling van DED's varieerde de resolutie die werd bereikt met een reconstructie van één deeltje tussen 4 en 30 Å4,5. Onlangs is de haalbare resolutie van cryo-EM met één deeltje verder gegaan dan 1,8 Å6. DED en geautomatiseerde software voor gegevensverzameling hebben een belangrijke bijdrage geleverd aan deze resolutierevolutie7, waarbij menselijke tussenkomst voor gegevensverzameling minimaal is. Over het algemeen wordt cryo-EM-beeldvorming uitgevoerd met lage elektronendosissnelheden (20-100 e / Å2) om door elektronenbundels geïnduceerde stralingsschade van biologische monsters te minimaliseren, wat bijdraagt aan de lage signaal-ruisverhouding (SNR) in het beeld. Deze lage SNR belemmert de karakterisering van de hoge resolutie structuren van biologische macromoleculen met behulp van single-particle analyse.

De nieuwe generatie elektronendetectoren zijn CMOS-gebaseerde detectoren (complementary metal-oxide-semiconductor), die deze lage SNR-gerelateerde obstakels kunnen overwinnen. Deze CMOS-camera's met directe detectie maken een snelle uitlezing van het signaal mogelijk, waardoor de camera bijdraagt aan een betere puntspreidingsfunctie, geschikte SNR en uitstekende detective quantum efficiency (DQE) voor biologische macromoleculen. Directe detectiecamera's bieden een hoge SNR8 en weinig ruis in de opgenomen beelden, wat resulteert in een kwantitatieve toename van de detective quantum efficiency (DQE) - een maat voor hoeveel ruis een detector aan een afbeelding toevoegt. Deze camera's nemen ook films op met een snelheid van honderden frames per seconde, wat snelle gegevensverzameling mogelijk maakt9,10. Al deze eigenschappen maken snelle directe detectiecamera's geschikt voor toepassingen met een lage dosis.

Bewegingsgecorrigeerde stapelafbeeldingen worden gebruikt voor gegevensverwerking om 2D-classificatie te berekenen en een 3D-dichtheidskaart van macromoleculen te reconstrueren met behulp van verschillende softwarepakketten zoals RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 en EMAN215. Voor analyse van één deeltje is echter een enorme dataset nodig om een structuur met hoge resolutie te bereiken. Daarom zijn automatische tolheffingen voor gegevensverzameling zeer essentieel voor het verzamelen van gegevens. Om grote cryo-EM datasets vast te leggen, zijn de afgelopen tien jaar verschillende softwarepakketten gebruikt. Speciale softwarepakketten, zoals AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS en EPU, zijn ontwikkeld voor geautomatiseerde gegevensverzameling.

Deze softwarepakketten gebruiken routinetaken om automatisch gatposities te vinden door de afbeeldingen met lage vergroting te correleren met afbeeldingen met een hoge vergroting, wat helpt bij het identificeren van gaten met glasachtig ijs van geschikte ijsdikte voor beeldacquisitie onder omstandigheden met een lage dosis. Deze softwarepakketten hebben het aantal repetitieve taken verminderd en de doorvoer van de cryo-EM-gegevensverzameling verhoogd door gedurende meerdere dagen continu een enorme hoeveelheid gegevens van goede kwaliteit te verzamelen, zonder enige onderbreking en de fysieke aanwezigheid van de operator. Latitude-S is een vergelijkbaar softwarepakket, dat wordt gebruikt voor automatische gegevensverzameling voor analyse van één deeltje. Dit softwarepakket is echter alleen geschikt voor K2/K3 DED's en wordt bij deze detectoren geleverd.

Dit protocol demonstreert het potentieel van Latitude-S in de geautomatiseerde beeldacquisitie van SARS-CoV-2 spike-eiwit met een directe elektronendetector uitgerust met een 200 keV cryo-EM (zie de tabel met materialen). Met behulp van deze tool voor gegevensverzameling worden automatisch 3.000 filmbestanden van SARS-CoV-2 spike-eiwit verkregen en wordt verdere gegevensverwerking uitgevoerd om een spike-eiwitstructuur met een resolutie van 3,9-4,4 Å te verkrijgen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Er zijn drie belangrijke stappen nodig voor cryo-EM-gegevensverzameling: 1. cryo-EM-rastervoorbereiding, 2. kalibratie en uitlijning van de microscoop, 3. automatische gegevensverzameling (figuur 1). Verder is geautomatiseerde gegevensverzameling onderverdeeld in a. geschikte gebiedsselectie, b. optimalisatie van Latitude-S, c. automatische gatselectie starten en d. automatische gegevensverzameling starten (figuur 1).

1. Cryo-EM-rastervoorbereiding en monsterbelasting voor automatische gegevensverzameling

  1. Reinig de roosters met een gloethesser en varieer de gloeie-ontladingsparameters op basis van experimentele vereisten (hier 60 s bij 20 mA).
  2. Voeg een vers bereid eiwitmonster (3 μL) toe aan het gloeiende rooster en incubeer gedurende 10 s.
  3. Dep de roosters voor 3-5 s bij 100% vochtigheid en dompel ze snel in vloeibaar ethaan met behulp van een cryo-plunjer.
  4. Klem de roosters handmatig in een clipring om de cartridge te vormen met behulp van een flexibele C-clip ring.
  5. Plaats de bevroren cartridge-gemonteerde roosters in de autoloader-cassette en breng de cassette via de nanodop over naar de voorgekoelde autoloader van de microscoop voor gegevensverzameling.

2. Microscoopafstemming en basisuitlijning vóór automatische gegevensverzameling

  1. Bundelverschuiving
    1. Klik op Beam shift op het tabblad Direct Alignment .
    2. Verklein de vergroting en centreer de bundel op de optische as met behulp van de multifunctionele X- en Y-knop .
  2. Uitlijning van draaipunt
    1. Klik op de optie Beam tilt in Direct Alignment pp X op het tabblad Direct Alignment .
    2. Condenseer de straal tot een plek en minimaliseer de beweging met behulp van de multifunctionele X- en Y-knop .
  3. C2 diafragma centreren
    1. Selecteer de condensoropening op het tabblad Uitlijning .
    2. Condenseer de bundel tot een plek, centreer de bundel naar de optische as en breid de bundel vervolgens uit om de cirkel gelijkmatig te bedekken.
    3. Herhaal deze stappen totdat het diafragma van Condenser 2 is aangepast.
  4. Coma-vrije uitlijning
    1. Klik op Coma-free Alignment X op het tabblad Direct Alignment om de bundel uit te lijnen met de optische as.
    2. Gebruik de multifunctionele knop om de vorm en de beweging van de FFT te minimaliseren (zorg ervoor dat deze stabiel is).
    3. Herhaal dezelfde procedure voor Coma - vrije uitlijning Y.
  5. Stel parallelle verlichting in vóór gegevensverzameling in de cryo-EM vanwege de C-dubbele lens.
    1. Plaats het objectiefopening (70 μm) in de diffractiemodus.
    2. Stel het objectiefopening scherp op het voorste brandpuntsvlak van de diffractielens door de defocus-intensiteitsknop (objectieflens en C2-lensstroom) te regelen.
    3. Zorg ervoor dat de scherpe rand van het objectiefopening zichtbaar is na de juiste onscherpte.
    4. Plaats de bundelstopper en verdeel de intensiteit totdat de goudpoederdiffractieringen tot een minimum zijn beperkt.
      OPMERKING: Als de bundel goed is verspreid, is een duidelijke diffractiering van het goudpoeder zichtbaar op het scherm, wat aangeeft dat de straal evenwijdig is.
    5. Trek de bundelstopper terug na het instellen van de parallelle verlichting en verander de microscoopmodus in Nano-sonde.
      OPMERKING: Controleer de microscoopafstemming voordat u begint met het verzamelen van gegevens om de optimale prestaties van de microscoop te garanderen. Al deze instellingen zouden worden uitgevoerd in de microscoop Direct Alignment GUI Tab. Alle microscoopafstemming wordt uitgevoerd met behulp van een testraster voordat gegevens worden verzameld.

3. Gegevensverzameling met Latitude-S

  1. Start de geautomatiseerde software voor gegevensverzameling van Latitude-S.
    OPMERKING: Voor de installatie van Latitude-S is ook microscoopkalibratie vereist, die wordt uitgevoerd voordat de gegevens worden verzameld, en de instellingen worden permanent opgeslagen. Vijf verschillende toestanden voor gegevensverzameling zijn gekalibreerd met vier verschillende vergrotingen (figuur 1 en figuur 2). Atlasstatus en rasterstatus bevinden zich in twee verschillende vergrotingen in LM-modus (lage vergrotingsbereiken). De gatstatus bevindt zich in de SA-modus (hoge vergrotingsbereiken), maar met een matige vergroting. Focus en gegevensstatus gebruiken de SA-modus met hoge vergroting.
    1. Klik op DigitalMicrograph in het menu Start of dubbelklik op het DigitalMicrograph-pictogram op het bureaublad.
    2. Selecteer het pictogram Techniekbeheer van DigitalMicrograph.
      OPMERKING: Dit systeem toont TEM - en Latitude-S-pictogrammen (figuur 2 en aanvullende figuur S1).
    3. Selecteer het Latitude-S-pictogram voor geautomatiseerde gegevensverzameling met één deeltje.
      OPMERKING: De K2-camera werkt in drie modi: lineair/geïntegreerd, geteld en superresolutie. De gebruiker kan elke modus selecteren in de interface van DigitalMicrograph. Gegevensafbeeldingen kunnen worden opgeslagen als dosisgefractioneerde afbeeldingsstapels of als opgetelde afbeeldingen in MRC-, TIF- of .dm4-bestanden met verschillende bitdiepten. Bovendien konden gegevens worden opgeslagen als bewegingsgecorrigeerde beelden voor de K3-camera. Op een K2-camera kan een onbewerkte afbeeldingsstapel worden opgeslagen als 4-bits MRC-, 8-bits TIF- of 8-bits DM4-bestanden.
  2. Maak een nieuwe sessie op basis van de instellingen van een vorige sessie.
    1. Schakel het selectievakje Op basis van eerdere sessie in het palet in.
    2. Selecteer de knop Nieuw .
    3. Kies de map met de sessie waarop de instellingen van de nieuwe sessie zijn gebaseerd. Ga naar de vorige sessiemap om de nieuwe sessie te maken. Kies de map waarin u de nieuwe sessie en de bijbehorende gegevens wilt opslaan.
    4. Selecteer en kies de map waarin de nieuwe sessie en de bijbehorende gegevens worden opgeslagen.
      OPMERKING: Elke status en de onderliggende instellingen (vergroting, verlichtingsomstandigheden, afbeelding of projector) en beam shift- en cameraparameters (totale belichting, belichting met één frame en binning) worden geëxporteerd van de bestaande sessie naar de nieuwe sessie. Het pad van de map wordt weergegeven als een tekenreeks onder aan het palet. Elk van de toestanden en configuratiepaletten heeft een sterretje (*) toegevoegd aan de titel om aan te geven dat het al is ingesteld en klaar is voor gebruik.
  3. Een bestaande sessie voortzetten.
    1. Druk op de knop Doorgaan in het palet om door te gaan met een bestaande sessie.
      OPMERKING: De atlasmontage kan niet worden gewijzigd.
    2. Kies en navigeer naar de map met de sessie die moet worden voortgezet.
  4. Start een geheel nieuwe sessie.
    1. Klik op Nieuw tabblad in het palet. Kies de map met de sessie die moet worden voortgezet. Selecteer een map om de gegevens op te slaan.
      OPMERKING: De standaardmapnaam wordt gemaakt met behulp van de datum en tijd.
    2. Klik op het pictogram Instelling . Voeg in het vak Status verkennen beheren dat wordt weergegeven de status toe, stel de TEM-voorwaarde, de cameravoorwaarde en de afbeelding/stapel in en geef de status een naam.
      OPMERKING: De geautomatiseerde workflow voor gegevensverzameling gebruikt 5 verschillende statussen voor geautomatiseerde gegevensverzameling. Deze toestanden worden geconfigureerd en opgeslagen in hun respectieve statuspaletten. De samenvatting van de toestand is weergegeven in tabel 1.
  5. Configureer de atlasstatus.
    1. Klik op Atlas-statuspalet.
    2. Configureer de atlasstatus met de volgende parameters: vergroting 115x LM-modus in nanosonde, verlichtingsomstandigheden-spotgrootte 8 en helderheid 934400, binning: 1 en camerabelichtingstijd: 1,0 s voor beeldvorming bij lage vergroting. Raadpleeg de samenvatting van de toestand in tabel 1.
    3. Klik op Volgende om naar de volgende status te gaan.
      OPMERKING: Atlastoestand is de laagste vergrotingstoestand, die het overzicht van het hele raster biedt (aanvullende figuur S2). Over het algemeen helpt deze toestand ons om de hele rasters bij lage vergroting te visualiseren en de ijsdikte, vlakheid en gebroken vierkant van de rasters te beoordelen. Het wordt aanbevolen om de atlas op verschillende gebieden van het raster te genereren om de optimale ijsdikte en suboptimale ijsdikte van de rasters te observeren (aanvullende figuur S3). De genoemde parameters kunnen worden gevarieerd volgens de behoeften van de gebruiker.
  6. Configureer de rasterstatus.
    1. Klik op het palet Rasterstatus.
    2. Configureer de rasterstatus met de volgende microscoopbeeldvormingsoptiek (vergroting 380x LM-modus in Nano-sonde), verlichtingsomstandigheden (spotgrootte: 8 en helderheid 626.200), binning: 1 en belichtingstijd van de camera: 1,0 s.
    3. Zie het overzicht van de Latitude-S-status in tabel 1.
    4. Klik op Volgende om naar de volgende status te gaan.
      OPMERKING: De rasterstatus is ingesteld op een vergroting die hoger is dan de atlastoestand, zodat het gezichtsveld één rastervierkant is (figuur 2). Bij deze specifieke vergroting wordt één rastervierkant waargenomen. Daarom worden gaten correct waargenomen in deze vergroting, wat helpt bij het controleren van de ijsdikte van de gaten (aanvullende figuur S4). Een eenvoudig bandpassfilter wordt gebruikt in de rasterstatus om de gaten in het patentraster te lokaliseren. De genoemde parameters kunnen worden gevarieerd volgens de behoeften van de gebruiker.
  7. Configureer de gatstatus.
    1. Klik op het gatenpalet.
    2. Configureer de hole-status met de volgende microscoopinstellingen: beeldoptica (vergroting 4500x SM-modus in Nano-sonde), verlichtingsomstandigheden (spotgrootte: 7 en beamdiameter 8,81 μm), binning: 1 en camerabelichtingstijd: 1,0 s.
    3. Wijzig de parameters indien nodig op basis van het rastertype. Zie de samenvatting van de staat in tabel 1.
    4. Klik op Volgende om naar de volgende status te gaan.
      OPMERKING: De SA-modus geeft een hoog vergrotingsbereik aan in de elektronenmicroscoop. De gattoestand bevindt zich in het SA-vergrotingsbereik met een gezichtsveld van enkele micrometers (10-20 μm) (figuur 2 en aanvullende figuur S4). Dit vergrotingsbereik is hoger dan de status Atlas of Grid, maar veel kleiner dan de status Focus/Data. In deze vergroting zullen individuele gaten zichtbaar zijn. De gatgrootte is geschikt om hoge mate van verontreinigingen, lege gaten en de juiste ijsdikte van de gaten te observeren. De gaten voor beeldvorming worden geselecteerd op basis van deze aannames. In de gattoestand worden twee filters gebruikt: een voor het kruiscorreleren van een gatreferentiebeeld met een nieuw gatbeeld en een andere voor het aanpassen van de podiumhoogte aan de eucentrische hoogte.
  8. Configureer de focusstatus.
    1. Klik op Focus palette.
    2. Configureer de focusstatus met de volgende microscoopinstellingen: beeldoptiek (vergroting 45.000x SA-modus in nanosonde), verlichtingsomstandigheden (spotgrootte: 8 en helderheid 934400), binning: 1 en belichtingstijd van de camera: 1,0 s.
    3. Focus op het amorfe koolstofgebied in de buurt van het gat. Raadpleeg het overzicht van de Latitude-S-status in tabel 1.
    4. Klik op Volgende om naar de volgende status te gaan.
      OPMERKING: De SA-modus geeft een hoog vergrotingsbereik aan in de elektronenmicroscoop. De focusstatus is de hogere SA-bereikvergroting. In de focusmodus wordt de bundel verplaatst naar een nabijgelegen koolstofgebied van het doelgat en wordt automatisch scherpgesteld om de gegevens in de gegevensstatus te verzamelen. Een bandpassfilter in combinatie met een schuin of zacht rechthoekig filter wordt in de focusstatus gebruikt om de offset tussen twee focusstatusafbeeldingen van hetzelfde gebied te meten (afbeelding 2). De genoemde parameters kunnen worden gevarieerd volgens de behoeften van de gebruiker.
  9. Configureer de gegevensstatus.
    1. Klik op Het palet Gegevens.
    2. Configureer de gegevensstatus met de volgende microscoopinstellingen: beeldoptiek (bijv. vergroting 28.000x, 45.000x, 54.000x in SA-modus in nanosonde), verlichtingsomstandigheden (spotgrootte: 8 en helderheid 934400), binning: 1 en belichtingstijd van de camera: 1.0 s.
    3. Raadpleeg de samenvatting van de Latitude-S-status in tabel 1.
    4. Klik op Volgende om naar de volgende status te gaan.
      OPMERKING: De gegevensstatus is de hoogste vergroting die is geselecteerd op basis van de vereisten voor pixelgrootte en doelresolutie (afbeelding 2). Over het algemeen wordt de bundel na het scherpstellen automatisch naar het doelgebied verplaatst om de gegevens te verzamelen. De bovengenoemde parameters kunnen worden gewijzigd op basis van de vereisten van de gebruiker.

4. Focus configuratie

  1. Klik op Focus configuratiepalet. Geef het bereik van onscherpwaarden en de stapgrootte op het gegeven tabblad op.
  2. Druk op de knop Volgende om naar de volgende stap te gaan.
    OPMERKING: Lagere onscherptewaarden kunnen worden gebruikt voor gegevensverzameling met hoge resolutie. Over het algemeen worden -0,5 tot -3,0 μm onscherptewaarden met 0,25 of 0,5 onscherpe stapgrootten gebruikt voor beeldacquisitie. Gebruikers kunnen de focusinstellingsstap overslaan als ze alleen het voorbeeld willen screenen. Druk gewoon op de knop Volgende op het palet om de focusconfiguratiestap over te slaan.

5. Fijne uitlijning

  1. Focus op enkele functies op het raster (bijv. ijsverontreiniging zeshoekig ijs); zie figuur 3.
    OPMERKING: Functies mogen niet te groot of te klein zijn. Ze moeten zichtbaar zijn bij zowel Atlas-toestandsvergroting 115x (LA-modus) als gegevensvergroting.
  2. Klik op de knop Vastleggen . Plaats het rode kruisteken op dezelfde functie op elke afbeelding van verschillende toestanden.
  3. Begin met focus-, data- en gattoestanden omdat hun gezichtsveld veel groter is dan de atlas- en rastertoestanden. Zoom in op atlas- en rasterstatussen om het rode kruisteken op hetzelfde kenmerk in de atlas- en rastertoestanden te plaatsen.
  4. Klik op de knop Berekenen om de posities van vijf verschillende toestanden te berekenen, die de verschuivingen tussen elk van de toestanden berekenen en deze weergeven in het uitvoervenster.
    OPMERKING: De offsetwaarden zijn geïntegreerd in de toestanden voor verder gebruik (figuur 3). Fijne uitlijning wordt uitgevoerd om een hoge nauwkeurigheid van de positie van elke toestand te bieden (figuur 3). Deze fijne uitlijning helpt bij het bepalen van de exacte positie in alle vijf de toestanden. Fijnuitlijning is van cruciaal belang voor de acquisitie van gegevens met één deeltje. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om Fine Alignment uit te voeren voordat u een afbeelding maakt.

6. Procedure voor gegevensverzameling met Latitude-S

  1. Klik op het palet Vastleggen.
    OPMERKING: Over het algemeen worden atlasgegevens verzameld bij lage vergroting (115x) om de meeste rastervierkanten te visualiseren.
  2. Kies de grootte van de atlas om het volledige raster of een deel van het raster te bedekken op basis van de vereiste (bijvoorbeeld 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 of 8 x 12).
    OPMERKING: 16 bij 16 atlasformaat beslaat het hele raster.
  3. Klik op de knop Vastleggen om de atlas vast te leggen.
    OPMERKING: Het hoofdnavigatievenster van Latitude-S wordt geopend en vult de beschikbare ruimte in DigitalMicrograph (aanvullende figuur S5). Drie afbeeldingsvensters in het hoofdnavigatievenster tonen afbeeldingen van de systeemstatussen met drie verschillende vergrotingen. De algemene atlas wordt momenteel in zijn huidige staat van verwerving weergegeven in het meest linkse deelvenster. Tegels in de atlas zullen vol raken als elke opname plaatsvindt.
  4. Selecteer het rastervierkant op basis van de ijsdikte door op de atlas te navigeren (aanvullende figuur S5). Zodra de gewenste rastervierkanten zijn geselecteerd, klikt u op de knop Plannen en ziet u hoe de tegels in het rasterplein vollopen terwijl elk rastervierkant wordt vastgelegd.
  5. Klik op de knop Plannen zodra de rastervakken zijn geselecteerd.
  6. Selecteer een representatief gat in het rastervierkant door de positie toe te voegen. Zodra een gatafbeelding is verkregen, definieert u de gegevens en focusposities en slaat u de lay-out op als een sjabloon (aanvullende figuur S6).
  7. Klik op Automatisch zoeken, geef de gatgrootte op (bijv. R1.2 / 1.3) en klik op de knop Zoeken in het programma, waardoor het programma Zoeken automatisch de gaten vindt op basis van de gatdiameter. Klik vervolgens op de knop Markeren om de sjabloon toe te voegen (figuur 4) en voeg rode cirkelmarkeringen toe in alle gaten in één raster of gedeeltelijk rastervierkant.
  8. Stel de intensiteit in om de gaten uit het rastervierkant en de ijsverontreiniging te verwijderen (figuur 4).
    OPMERKING: Ten slotte worden de geselecteerde gaten geel gemarkeerd voor het plannen van de gegevensverzameling.
  9. Klik op de knop Plannen in Latitude-taken nadat u de gaten hebt toegevoegd via Automatisch zoeken.
    OPMERKING: Voordat u de geautomatiseerde gegevensverzameling plant, moet u ervoor zorgen dat het tankniveau van de vloeibare stikstof voldoende is, dat de autoloader turbopomp is uitgeschakeld en dat de RAID-schijfruimte vrij is. Latitude-S taakbeheer toont het aantal atlas-, rastervierkant-, gat- en gegevensstatussen dat is gepland voor gegevensverzameling (afbeelding 5). In de Gui Latitude-S zijn verschillende kleurenschema's zichtbaar en wordt de betekenis van de verschillende kleurenschema's weergegeven: 1. Geel geeft ongepland aan; 2. Groen geeft gepland aan; 3. Blauw geeft verworven aan; 4. Rood geeft aan dat het niet is gelukt.

7. Cryo-EM gegevensverwerking

OPMERKING: Cryo-EM beeldverwerking van spike-eiwit wordt in detail beschreven in recente literatuur25.

  1. Voer beeldverwerking uit van spike-eiwit van SARS-CoV2 met RELION 3.011.
  2. Scherm de filmbeelden die met Latitude-S zijn verzameld handmatig af en voer door de bundel geïnduceerde bewegingscorrectie van de afzonderlijke films uit met de MotionCor2-software9. Voer de eerste screening van de bewegingsgecorrigeerde micrografieën handmatig uit met behulp van cisTEM-softwarepakket14.
    OPMERKING: Bijna 85% van de automatisch verkregen microfoto's waren van goede kwaliteit en de gegevens hadden een signaal binnen 3,7-5,2 Å, dat wordt berekend met behulp van cisTEM-software14 (aanvullende figuur S7A, B).
  3. Verwerk de gegevens met behulp van het RELION 3.0 softwarepakket11.
    1. Kies spikedeeltjes handmatig en onderwerp ze aan 2D-klasseclassificatie (aanvullende figuur S7C). Gebruik de beste 2D-klasse als referentie voor het automatisch selecteren van 3.99.842 deeltjes met één spike uit de micrografieken met behulp van de RELION autopick tool11.
      OPMERKING: Er werden drie rondes van 2D-classificatie uitgevoerd voordat de deeltjes aan 3D-classificatie werden onderworpen (aanvullende figuur S8). Ongeveer 2.55.982 afzonderlijke deeltjes werden geselecteerd voor 3D-classificatie en de dataset werd ingedeeld in zes klassen. De uiteindelijke 3D auto-verfijning werd uitgevoerd met de beste klasse; 85.227 spikedeeltjes werden verkregen uit de 3D-classificatie.
    2. Voer na automatische verfijning per deeltje onscherp verfijning uit met de juiste straalkantelingsparameters voor resolutieverbetering. Onderwerp de deeltjes vervolgens aan Bayesiaanse polijsten met behulp van het RELION 3.0-softwarepakket11. Gebruik ten slotte de gepolijste deeltjesset voor nog een ronde van 3D-automatische verfijning met RELION 3.011.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de huidige pandemische situatie speelt cryo-EM een sleutelrol bij het karakteriseren van de structuren van verschillende eiwitten uit SARS-CoV-226,27,28,29, die kunnen helpen bij de ontwikkeling van vaccins en medicijnen tegen het virus. Er is dringend behoefte aan snelle onderzoeksinspanningen met beperkte personele middelen om de coronavirusziekte van 2019 te bestrijden. Data-acquisitie in...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Latitude-S is een intuïtieve gebruikersinterface die een omgeving biedt om in twee dagen tijd automatisch duizenden microfoto's of filmbestanden met hoge resolutie in te stellen en te verzamelen. Het biedt eenvoudige navigatie over de rasters en handhaaft de positie van de microscooptrap terwijl deze van lage vergroting naar hoge vergroting gaat. Elke stap van gegevensverzameling met Latitude-S is tijdbesparend, met functies zoals een eenvoudige gebruikersinterface, snelle streaming van gegevens met een snelheid tot 4,5 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende of financiële belangenconflicten te verklaren.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen het Department of Biotechnology, het Department of Science and Technology (DST) and Science en het Ministry of Human Resource Development (MHRD), India, voor financiering en de cryo-EM-faciliteit in IISc-Bangalore. We erkennen het DBT-BUILDER-programma (BT / INF / 22 / SP22844 / 2017) en DST-FIST (SR / FST / LSII-039 / 2015) voor de nationale Cryo-EM-faciliteit in IISc, Bangalore. We erkennen financiële steun van de Science and Engineering Research Board (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 en SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). We bedanken mevrouw Ishika Pramanick voor het voorbereiden van cryo-EM-rasters, cryo-EM-gegevensverzameling en het voorbereiden van de tabel met materialen. We bedanken ook de heer Suman Mishra voor cryo-EM beeldverwerking en voor het helpen bij het voorbereiden van de cijfers. We bedanken Prof. Raghavan Varadarajan voor het helpen verkrijgen van het gezuiverde spike-eiwitmonster voor deze studie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Blotting paperTed Pella, INC.47000-100EM specimen preparatie item
CapsuleThermo Fisher Scientific9432 909 97591EM specimen preparatie unit
CassetteThermo Fisher Scientific1020863EM specimen preparatie unit
C-ClipThermo Fisher Scientific1036171EM specimen preparatie item
C-Clip Insertion ToolThermo Fisher Scientific9432 909 97571EM specimen preparatie tool
C-Clip RingThermo Fisher Scientific1036173EM specimen preparatie item
EM grid (Quantifoil)Electron Microscopy SciencesQ3100AR1.3R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold
Glow discharge MachineQuorumN/AQuorum GlowQube glow discharge machine
K2 DEDGatan Inc.N/ACryo-EM data verzamel apparaat (Camera)
Latitude S SoftwareGatan Inc.Beeldverwerkingssoftware
Loading stationThermo Fisher Scientific1130698EM specimen preparatie unit
Talos 200 kV ArcticaThermo Scientific™N/ACryo-Elektronenmicroscoop
Vitrobot Mark IVThermo Fisher ScientificN/AEM specimen preparatie unit

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
  2. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  3. Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
  4. Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
  5. Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  8. McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
  9. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  10. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980(2015).
  11. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  12. Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383(2018).
  15. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  16. Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
  17. Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
  18. Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  20. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  21. Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
  22. Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
  23. Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
  24. Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
  25. Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
  26. Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
  27. Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
  28. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  29. Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
  30. Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Particle Cryo EMAutomated Data AcquisitionCryo EM SoftwareHigh Throughput ImagingSpike Protein StructureElectron MicroscopyData Collection AutomationDirect Electron DetectorStructural Characterization3D Classification

Related Articles