Groot diermodel voor het evalueren van de werkzaamheid van de gentherapie in ischemisch hart

Samenvatting

Myocardiale gentherapie voor ischemische hartziekten is veelbelovend voor toekomstige therapieën. Hier introduceren we een groot diermodel voor het evalueren van de werkzaamheid van gentherapie in het ischemische hart.

Samenvatting

Coronaire hartziekte is wereldwijd een van de belangrijkste oorzaken van mortaliteit en morbiditeit. Ondanks de progressie van de huidige therapieën blijft een aanzienlijk deel van de patiënten met coronaire hartziekte symptomatisch. Gentherapie-gemedieerde therapeutische angiogenese biedt een nieuwe therapeutische methode voor het verbeteren van myocardiale perfusie en het verlichten van symptomen. Gentherapie met verschillende angiogene factoren is in enkele klinische onderzoeken bestudeerd. Vanwege de nieuwheid van de methode is de voortgang van myocardiale gentherapie een continu pad van bank naar bed. Daarom zijn grote diermodellen nodig om de veiligheid en werkzaamheid te evalueren. Hoe meer het grote diermodel de oorspronkelijke ziekte en de eindpunten identificeert die in klinieken worden gebruikt, hoe voorspelbaarder de uitkomsten zijn van klinische onderzoeken. Hier introduceren we een groot diermodel voor het evalueren van de werkzaamheid van de gentherapie in het ischemische varkenshart. We gebruiken klinisch relevante beeldvormingsmethoden zoals echografie en ¹⁵H₂O-PET. Voor het richten van de genoverdrachten naar het gewenste gebied wordt elektroanatomische mapping gebruikt. Het doel van deze methode is: (1) het nabootsen van chronische coronaire hartziekte, (2) het induceren van therapeutische angiogenese op hypoxische gebieden van het hart, en (3) het evalueren van de veiligheid en werkzaamheid van de gentherapie met behulp van relevante eindpunten.

Inleiding

Coronaire hartziekte is verantwoordelijk voor het overgrote deel van de sterfte en ziektelast wereldwijd¹. Huidige behandelingsstrategieën zijn percutane interventies, farmacologische behandeling en bypass-chirurgie². Ondanks de progressie van deze huidige therapieën lijden veel patiënten echter aan zogenaamde refractaire angina pectoris, wat de onvervulde behoefte aan nieuwe behandelingsbenaderingen onderstreept³. Gentherapie-gemedieerde therapeutische angiogenese zou zich op deze patiëntengroep kunnen richten.

Myocardiale gentherapie wordt meestal geleverd door gebruik te maken van verschillende virale vectoren, meestal replicatie-deficiënt adenovirus⁴. Als therapeutische genen worden verschillende angiogene groeifactoren gebruikt. De meest substantieel bestudeerde angiogene groeifactoren zijn de vasculaire endotheliale groeifactoren (VEGF's) die hun angiogene signalering bemiddelen via vasculaire endotheliale groeifactorreceptoren (VEGFRs) en hun co-receptoren⁵. Verschillende klinische studies hebben het voordeel en de veiligheid van cardiale gentherapie bewezen en deze nieuwe behandelingsmethode tot een realistische optie gemaakt voor de behandeling van ischemische hartziekten ^6,7. Dit concept moet echter nog steeds worden verbeterd door de therapeutische genen en virale vectoren die in grote diermodellen op de proef worden gesteld voordat ze de klinieken betreden. Het varken is vaak gebruikt als proefdier, omdat het hart erg lijkt op het menselijk hart. De grootte van het cardiovasculaire systeem van een varken maakt het gebruik van vergelijkbare katheteruitvindingen mogelijk als bij mensen. Alle beeldvormingsmodaliteiten die beschikbaar zijn voor mensen kunnen worden gebruikt bij varkens⁸.

Er zijn verschillende grote diermodellen voor chronische ischemie. De meest gebruikte is de ameroïde constrictor model 9,10,11. Het nadeel van deze methode is de invasiviteit, omdat thoracotomie nodig is om toegang te krijgen tot de coronaire vasculatuur. Eerder is in onze groep een mini-invasief bottleneck stentmodel voor chronische myocardiale ischemie ontwikkeld¹². Deze methode wordt ook in dit manuscript gebruikt om myocardiale ischemie te induceren.

De bruikbaarheid van echografie is aanzienlijk geëvolueerd, ondanks de leeftijd van de beeldvormingsmodaliteit. Myocardiale stam wordt bijvoorbeeld nog steeds voornamelijk in onderzoeksgebruik gebruikt vanwege zijn nieuwheid. Myocardiale spanning weerspiegelt veranderingen in de contractiele functie van het hart beter dan de traditionele M-modus ejectiefractiemeting¹³. Hier in het grote diermodel wordt dus myocardiale stammeting gebruikt. Om de functie van het hart te evalueren, wordt de cardiale output ook gemeten door middel van cine-imaging van de linker ventrikel tijdens angiografie. Cardiale output wordt zowel in rust als onder dobutamine-geïnduceerde stress gemeten om de myocardiale functie onder stress te evalueren.

Naast de metingen van de hartfunctie is informatie over myocardiale perfusie essentieel in gentherapiestudies gericht op therapeutische angiogenese. In dit diermodel worden dieren afgebeeld met 15 O-gelabelde radiowater positron emissietomografie (¹⁵H₂O-PET) omdat dit de gouden standaard is voor het meten van myocardiale perfusie. ¹⁵H₂O-PET is eerder gevalideerd voor het meten van perfusie van ischemisch varkenshart¹⁴.

De hierboven genoemde methoden en modaliteiten vormen dus een uitstekend perspectief voor het evalueren van de werkzaamheid van gentherapie in het ischemische hart.

Protocol

De hier gepresenteerde experimenten worden uitgevoerd met ongeveer 10 weken oude vrouwelijke tamme varkens en zijn goedgekeurd door de Animal Experiment Board in Finland. Dieren wegen 30-40 kg aan het begin van het protocol, waardoor dezelfde procedurele apparatuur en beeldvormingsmodaliteiten mogelijk zijn voor mensen. Chronische ischemie wordt 14 dagen voor de genoverdracht geïnduceerd en de follow-uptijd na de genoverdracht is afhankelijk van de gebruikte virale vector. Het onderzoeksprotocol is weergegeven in figuur 1. Dit protocol kan worden gebruikt om adenovirale of AAV-gemedieerde gentherapie-injecties uit te voeren. Het tijdstip van monsterverzameling moet worden aangepast aan de transgenexpressiepiek, die afhankelijk is van de gebruikte virale vector. Bij het uitvoeren van adenovirale genoverdrachten wordt bijvoorbeeld de tijd van de monsterverzameling ingesteld op 6 dagen na de genoverdracht.

1. Medicatie

1. Dien een dagelijkse dosis van 200 mg amiodaron en 2,5 mg bisoprolol toe om fatale ventriculaire aritmieën te voorkomen. De medicatie begint 1 week voor de ischemie-operatie en wordt dagelijks voortgezet tot de follow-up.
2. Dien daarnaast perorale doses clopidogrel (300 mg) en acetylsalicylzuur (300 mg) toe aan de dieren 1 dag voor de ischemie-operatie om acute in-stent trombose na de stentplaatsing te voorkomen.
3. Dien 100 mg lidocaïne en 2,5 ml (246 mg/ml) MgSO₄ intraveneus toe aan de dieren aan het begin van de ischemieoperatie om ventriculaire aritmieën te voorkomen.
4. Dien intramusculaire injectie van cefuroxim (500 mg) toe aan het begin van elke operatie voor infectieprofylaxe.
5. Dien 30 mg enoxaparine intraveneus toe aan het begin van de ischemie-operaties en subcutaan na de operatieprocedure voor trombosepreventie.
6. Voor anesthesie en analgesie, dien 1,5 ml atropine, 6 ml azaperon (40 mg / ml), propofol 20 mg / ml, met een snelheid van 15 mg / kg / uur, en fentanyl 50 μg / ml toe met een snelheid van 10 μg / kg / uur. Medicijndoseringen waren hetzelfde voor elk varken. Raadpleeg de richtlijnen voor lokaal gebruik van dieren voor het toedienen van dosissen.
7. Verdoof de dieren tijdens alle operaties. Alle bewerkingen moeten worden uitgevoerd in een steriele omgeving met behulp van een steriele techniek.

2. Transthoracale echocardiografie

1. Voer transthoracale echocardiografie uit vóór ischemie-operatie, genoverdracht en euthanasie om detecteerbare pericardvloeistof te evalueren en de myocardiale stam te bepalen.
2. Plaats de transducer in de derde of vierde intercostale ruimte onder de oksel van het varken om toegang te krijgen tot parasternale korte-asweergaven op mitralisklepniveau, papillaire spier en apicale niveaus (Video 1). De marker van de transducer moet naar het borstbeen van het varken wijzen. Als u een clip wilt opslaan, drukt u op Verwerven.

3. Endovasculaire operaties onder fluoroscopische begeleiding

1. Voer beeldvorming van de linkerventrikel cine uit na coronaire angiogrammen vóór ischemie-operatie, genoverdracht en weefselverzameling.
2. Voorbereiding van de operatie
   1. Bereid u voor op de operaties door de varkens te verdoven met een intramusculaire injectie van 1,5 ml atropine en 6 ml azaperon.
   2. Induceer na de sedatie algemene propofol- en fentanylanesthesie voor de angiografische procedures bij de varkens met doses van respectievelijk 15 mg / kg / h en 10 μg / kg / h.
      OPMERKING: De varkens worden gedurende de hele procedure verdoofd.
   3. Ondersteun de ventilatie door intubatie en ventilator en bewaak de vitale fysiologische parameters, zoals ECG en ademhalingsparameters.
3. Introducer schede plaatsing
   1. Plaats een inbrengmantel in de rechter dijbeenslagader voor alle operaties als standaardpraktijk in de cardiologie. Gebruik echografie om de dijbeenslagader te volgen en doorboor deze met een ingangsnaald (18 G).
      OPMERKING: Gebruik een 8F-introducermantel voor intramyocardiale genoverdrachten en een 6F-schede voor alle andere operaties. Breng de geleidingsdraad van de schede door de naald om de slagader te rijgen en houd de geleidedraad stil terwijl u de naald verwijdert.
   2. Plaats de inbrengmantel langs de geleidedraad en verwijder de geleidedraad en dien 1,25 mg sublinguaal dinitraat toe aan het varken om coronaire vasodilatatie te induceren.
4. Coronaire angiografie
   1. Voer coronaire angiografie uit direct vóór ischemie-operatie, genoverdracht en weefselverzameling. De machines die nodig zijn voor de angiogrammen zijn weergegeven in figuur 2.
   2. Gebruik een 6F-katheter onder fluoroscopische begeleiding met een jodiumcontrastmiddel om de rechter kransslagader en de linker oplopende kransslagader in beeld te brengen (Video 2).
5. Linker ventrikel cine beeldvorming onder rust en dobutamine stress
   1. Dien een bolus van 21 ml jodiumcontrastmiddel toe in de linker ventrikel via een 5F pigtail-katheter met behulp van een auto-injector. Stel eerst de bolusduur in op 3 s en het totale volume op 21 ml. Druk vervolgens op Single en Yes.
   2. Bereken de ejectiefractie met de meetsoftware van het angiografische werkstation. Om de berekening uit te voeren, selecteert u Ventriculaire analyse van de betreffende afbeelding. Blader door de afbeelding om een tijdsbestek te selecteren, één in diastole en één in systole. Selecteer een gereedschap om ventriculaire contouren van elk tijdsbestek te tekenen.
      OPMERKING: De software berekent nu de uitwerpfractie en het slagvolume volgens de methode van Simpson. De ejectiefractiemeting wordt uitgevoerd tijdens rust en onder dobutamine-geïnduceerde stress.
6. Beeldvorming van stress
   1. Dosis dobutamine intraveneus in escalerende doses van 10 μg/kg/min tot 20 μg/kg/min voor de dobutamine-geïnduceerde stressbeeldvorming totdat de streefhartslag van 160 bpm is bereikt. Voer vervolgens de cine-beeldvorming uit.
7. Ischemie operatie
   1. Plaats 14 dagen voor de genoverdracht een bottleneck stent in de linker coronaire slagader (LAD) om chronische myocardiale ischemie te induceren. Controleer na het plaatsen van de bottleneck stent of de bottleneck stent correct is geplaatst, waardoor de coronaire bloedstroom wordt beperkt.
      OPMERKING: De bottleneck stent wordt op een dilatatiekatheter geplaatst en bestaat uit een bare-metal stent bedekt met een polytetrafluorethyleenbuis gevormd in een knelpuntvorm om de coronaire bloedstroom te verminderen⁹.
8. De stentgrootte definiëren
   1. Kies de grootte van de stent, ofwel 3,0/3,5/4,0 x 8 mm, afhankelijk van de grootte van de linker oplopende kransslagader in het angiogram met behulp van de automatische meetsoftware in het angiografische werkstation (Video 3)¹².
9. Stent plaatsing
   1. Plaats een spiraal naar de linker kransslagader en glijd de bottleneck stent naar de LAD, waarbij deze distaal naar de eerste diagonaal wordt geplaatst.
   2. Blaas de stent op tot nominale druk in de slagader met behulp van een in-deflator met een stent-lumenverhouding van 1,3, waardoor de bottleneck op zijn plaats wordt verankerd. Na nog eens 15 s, laat de stent leeglopen en trek de apparatuur uit de slagader.
      OPMERKING: Bevestig de juiste plaatsing van de bottleneck stent door middel van een angiogram.

4. PET-beeldvorming

OPMERKING: Een dag voor de genoverdracht, voer rust en stress ^{uit 15}O-gelabelde radiowater PET / CT-scans (vereist ziekenhuisomgeving en radiologische technici).

1. Referentiebeeldvorming
   1. Voer computertomografie (CT) -scans uit voor rust en stressbeeldvorming. Gebruik de CT-informatie voor dempingscorrectie.
2. ¹⁵O-gelabelde radiowaterbeeldvorming
   1. Voer rust- en stressbeeldvorming uit met behulp van een 800 MBq ¹⁵H₂O-bolus.
3. Beeldvorming van stress
   1. Voer stressbeeldvorming uit met nog eens 800 MBq ¹⁵O-water bolus na een geschikt radioactief verval van 12 minuten.
      OPMERKING: Hyperemie wordt geïnduceerd door adenosine (200 μg/kg/min intraveneus), zoals eerder beschreven¹².

5. Genoverdracht

1. Elektroanatomische mapping
   1. Ga verder met elektroanatomische mapping na een coronair angiogram en functionele metingen (echocardiografie, LV cine imaging).
   2. Introduceer een kaartkatheter naar de linker ventrikel via de femorale schede in fluoroscopische geleiding.
      OPMERKING: Registreer ongeveer 100-150 punten rond de linker ventrikel met de kaartkatheter om de elektroanatomische kaart te maken.
2. Afwerking van de elektroanatomische kaart
   1. Verwijder de uitschieters om een betrouwbaardere elektroanatomische kaart van de linker ventrikel te garanderen.
   2. Doe dit door Vlakken knippen van de kaart te selecteren en de punten te verwijderen die verschillen van de punten die de ventriculaire vorm vormen. Selecteer vervolgens Trajecten voor de kaartweergave en verwijder de punten die horizontaal zijn afgelegd tijdens de puntenregistratie.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de resterende punten de linkerkamer bedekken en registreer indien nodig meer punten.
3. Genoverdracht injecties
   1. Breng een intramyocardiale injectiekatheter in op de linker ventrikel via de dijbeenschede onder fluoroscopische begeleiding. Stel de lengte van de injectienaald in op 3 mm.
4. Criteria voor intramyocardiale injecties
   1. Begeleid de genoverdrachten door het elektroanatomische mappingsysteem en richt de injecties op levensvatbare maar hypokinetische gebieden van de linker ventrikel.
      OPMERKING: Gebruik voor de levensvatbaarheid een unipolaire spanning van meer dan 5 mV als criterium. Voor hypokinesie, selecteer een lokale lineaire verkorting (LLS) zo laag als beschikbaar, ten minste onder 12% maar bij voorkeur onder 6%¹³.
5. Intramyocardiale injecties
   1. Injecteer gedurende 30 s het vectormateriaal in het selectiepunt (stap 5.4) en houd de injectienaald nog eens 5 s in het myocardium voordat u zich terugtrekt om terugstroming naar de linkerkamer te voorkomen.

6. Euthanasie en monstername

OPMERKING: Na de coronaire angiogram- en ejectiefractiemetingen beschreven in respectievelijk stap 3.4.1 en 3.5.2, dient u 50 ml verzadigd kaliumchloride intraveneus toe aan het verdoofde varken.

1. Perfusiefixatie van het hart
   1. Oogst het hart uit de thoracale holte. Afspoelen met water. Plaats een naald van 18 G boven de aortaklep en bevestig de naald aan een perfusiepomp. Perfuseer het hart met 750 ml 1% paraformaldehyde (PFA).
2. Monsterverzameling
   1. Snijd het hart in plakken van 1 cm dik met een scherp keukenmes. Verzamel de monsters uit het genoverdrachtsgebied in 4% PFA en vloeibare stikstof.
      OPMERKING: Om negatieve controles te oogsten, verzamelt u een controlemonster van de achterwand van de linker ventrikel.
3. Verzameling van veiligheidsweefsels
   1. Oogst monsters van afgelegen weefsels, zoals de longen, lever, nieren, milt en eierstokken. Neem monsters in 4% PFA en vloeibare stikstof.

7. Opslag van monsters

1. Bewaar de monsters voor kleuring in 4% PFA gedurende 48 uur bij 4 °C.
   OPMERKING: Vervang de PFA dagelijks door een verse vloeistof.
   1. Vervang na 48 uur de PFA door 15% sucrose in gedeïoniseerd water. Ten minste 24 uur bewaren voordat u de monsters in paraffineblokken insluit. Snap ingevroren monsters worden bewaard bij -70 °C.

Resultaten

Het succes van de ischemie-operatie kan met dit protocol worden bevestigd door coronair angiogram en door het hypokinetische gebied te bepalen door transthoracale echografie (figuur 1) voordat wordt overgegaan tot de genafgifte. De toestand van de coronaire occlusie kan worden geëvalueerd door coronair angiogram en de elektroanatomische mapping zorgt voor de ischemische en overwinterende gebieden.

De werkzaamheid van de gentherapie kan worden geanalyseerd door de ...

Discussie

De tijdstippen van dit protocol kunnen worden aangepast aan de gebruikte virale vector. Ook kunnen de immunohistologische analyses worden geselecteerd op basis van het therapeutische gen. Het is ook mogelijk om indien nodig meer tijdpunten en eindpunten aan het protocol toe te voegen.

Dit protocol bestaat uit fasen, die essentieel zijn om te slagen en achteraf onmogelijk te corrigeren. Ten eerste, als men er niet in slaagt om de juiste ischemie te induceren, moet het dier worden uitgesloten va...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1% PFA	VWR	VWRC28794.295	Bereid uit paraformaldehyde poeder
15 % sucrose	VWR	VWRC27480.294	Bereid uit vaste sucrose
4% PFA	VWR	VWRC28794.295	Bereid uit paraformaldehyde poeder
5 F pigtail catheter	Cordis	534-550S
6 F catheter AR2	Cordis	670-112-00
6 F introducer sheath	Cordis	504-606X
8 F introducer sheath	Cordis	504-608X
Acetylsalicylzuur			Variërende producent
Amiodaron			Variërende producent
Angiografisch station	GE Healthcare
Angiolaboratoriumset	Mölnlycke		Ontworpen voor de behoeften van ons angiolaboratorium, bevat steriele doeken, bekers en wattenstaafjes
Bisoprolol			Variërende producent
Cefuroxim			Variërende producent
Clopidogrel			Variërende producent
Coroflex Blue stent	B.Braun Medical	5029012	Catalogusnummer is afhankelijk van de stentmaat
Crile forceps
Cyclotron	GE Healthcare
Dobutamine			Variërende producent
Elektroanatomisch mappingsysteem	Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company
Enoxaparine			Variërende producent
Fentanyl			Variërende producent
Intra-myocardial injectiekatheter	Johnson & Johnson
Jodium contrastmiddel	Iomeron
Keukenmes			Variërende producent
Lidocaine			Variërende producent
Vloeibare stikstof			Variërende producent
MgSO4			Variërende producent
Naald 18 G	Cordis	12-004943
Perfusiepomp
PET-CT scanner	Siemens Healthcare
Polytetrafluorethyleenbuis
Propofol			Variërende producent
Scalpel nr 11	VWR	SWAN0503
Sublinguaal dinitrate	Takeda
Ultrasoundmachine	Philips