Method Article

Het meten van de samenstelling van cd95-doodsopwekkend signaleringscomplex en verwerking van procaspase-8 in dit complex

DOI:

10.3791/62842

⸱

August 2nd, 2021

 , 
1Translational Inflammation Research, Center of Dynamic Systems, Otto von Guericke University Magdeburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een experimentele workflow gepresenteerd die de detectie van caspase-8-verwerking direct bij het death-inducerende signaleringscomplex (DISC) mogelijk maakt en de samenstelling van dit complex bepaalt. Deze methodologie heeft brede toepassingen, van het ontrafelen van de moleculaire mechanismen van celdoodroutes tot de dynamische modellering van apoptosenetwerken.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extrinsieke apoptose wordt gemedieerd door de activering van doodsreceptoren (DRs) zoals CD95 / Fas / APO-1 of tumornecrosefactor-gerelateerde apoptose-inducerende ligand (TRAIL) - receptor 1 / receptor 2 (TRAIL-R1 / R2). Stimulatie van deze receptoren met hun verwante liganden leidt tot de assemblage van het dood-inducerende signaleringscomplex (DISC). DISC bestaat uit DR, het adaptoreiwit Fas-geassocieerd eiwit met death domain (FADD), procaspases-8/-10 en cellulaire FADD-achtige interleukine (IL)-1β-converterende enzym-remmende eiwitten (c-FLIPs). De DISC dient als platform voor procaspase-8 verwerking en activering. Dit laatste gebeurt via zijn dimerisatie/oligomerisatie in de death effector domain (DED) filamenten geassembleerd op de DISC.

Activering van procaspase-8 wordt gevolgd door de verwerking ervan, die in verschillende stappen plaatsvindt. In dit werk wordt een gevestigde experimentele workflow beschreven die de meting van DISC-vorming en de verwerking van procaspase-8 in dit complex mogelijk maakt. De workflow is gebaseerd op immunoprecipitatietechnieken die worden ondersteund door western blot-analyse. Deze workflow maakt zorgvuldige monitoring van verschillende stappen van procaspase-8-rekrutering voor de DISC en de verwerking ervan mogelijk en is zeer relevant voor het onderzoeken van moleculaire mechanismen van extrinsieke apoptose.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een van de best bestudeerde doodsreceptoren (DRs) is CD95 (Fas, APO-1). De extrinsieke apoptotische route begint met de interactie van de DR met zijn verwante ligand, d.w.z. CD95L interageert met CD95 of TRAIL bindt aan TRAIL-R's. Dit resulteert in de vorming van de DISC bij de overeenkomstige DR. DISC bestaat uit CD95, FADD, procaspase-8/-10 en c-FLIP eiwitten1,2. Bovendien wordt de DISC geassembleerd door interacties tussen death domain (DD)-bevattende eiwitten, zoals CD95 en FADD, en DED-bevattende eiwitten zoals FADD, procaspase-8/-10 en c-FLIP(Figuur 1). Procaspase-8 ondergaat oligomerisatie via associatie van zijn DED's, wat resulteert in de vorming van DED-filamenten, gevolgd door procaspase-8 activering en verwerking. Dit veroorzaakt een caspase cascade, wat leidt tot celdood (Figuur 1)3,4. Procaspase-8 is dus een centrale initiator caspase van de extrinsieke apoptoseroute gemedieerd door CD95 of de TRAIL-R's, geactiveerd op het overeenkomstige macromoleculaire platform, DISC.

Van twee isovormen van procaspase-8, namelijk procaspase-8a (p55) en -8b (p53), is bekend dat ze worden gerekruteerd voor de DISC5. Beide isovormen bestaan uit twee DED's. DED1 en DED2 bevinden zich op het N-terminale deel van procaspase-8a/b gevolgd door de katalytische p18- en p10-domeinen. Gedetailleerde cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) analyse van procaspase-8 DEDs onthulde de assemblage van procaspase-8-eiwitten in filamenteuze structuren genaamd DED-filamenten4,6. Opmerkelijk genoeg werd aanvankelijk gesuggereerd dat de lineaire procaspase-8-ketens betrokken waren bij de dimerisatie gevolgd door procaspase-8-activering op de DISC. Nu is bekend dat die ketens slechts een onderbouw zijn van het procaspase-8 DED-filament, waarbij de laatste bestaat uit drie ketens geassembleerd tot een drievoudige helix3,4,6,7.

Bij dimerisatie bij het DED-filament leiden conformationele veranderingen in procaspase-8a/b tot de vorming van het actieve centrum van procaspase-8 en de activering ervan3,8. Dit wordt gevolgd door procaspase-8-verwerking, die via twee paden wordt gemedieerd: de eerste gaat via de generatie van een p43 / p41-splitsingsproduct en de tweede via de eerste generatie van een p30-splitsingsproduct. De p43/p41-route wordt geïnitieerd door de splitsing van procaspase-8a/b bij Asp374, wat resulteert in p43/p41- en p12-splitsingsproducten(figuur 2). Verder worden deze fragmenten autokatalytisch gesplitst bij Asp384 en Asp210/216, wat aanleiding geeft tot de vorming van het actieve caspase-8 heterotetrameer, p102/ p1829,10,11. Bovendien werd aangetoond dat parallel aan de p43/p41-verwerkingsroute procaspase-8a/b ook wordt gesplitst bij Asp216, wat leidt tot de vorming van het C-terminale splitsingsproduct p30, gevolgd door de proteolyse tot p10 en p1810 (figuur 2).

Procaspase-8a/b activering bij het DED filament wordt strikt gereguleerd door eiwitten genaamd c-FLIPs12. De c-FLIP-eiwitten komen voor in drie isovormen: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)en c-FLIPRaji (c-FLIPR). Alle drie de isovormen bevatten twee DED's in hun N-terminale regio. c-FLIPL heeft ook een C-terminal katalytisch inactief caspase-achtig domein12,13. Beide korte isovormen van c-FLIP-c-FLIPS en c-FLIPRwerken op een anti-apoptotische manier door de vorming van DED-filamenten op de DISC6,14,15te verstoren. Bovendien kan c-FLIPL de activering van caspase-8 op een concentratieafhankelijke manier regelen. Dit kan resulteren in zowel pro- als anti-apoptotische effecten16,17,18. Door het katalytisch actieve procaspase-8/c-FLIPL heterodimeer te vormen, leidt c-FLIPL tot de stabilisatie van het actieve centrum van procaspase-8 en de activering ervan. De pro- of anti-apoptotische functie van c-FLIPL is direct afhankelijk van de hoeveelheid bij de DED-filamenten en de daaropvolgende hoeveelheid geassembleerde procaspase-8/c-FLIPL heterodimeren19. Lage of intermediaire concentraties c-FLIPL bij de DISC resulteren in voldoende hoeveelheden procaspase-8/c-FLIPL heterodimeren bij het DED-filament, wat de activering van caspase-8 ondersteunt. Daarentegen leiden verhoogde hoeveelheden c-FLIPL direct tot de anti-apoptotische effecten op de DISC20.

Alles bij elkaar genomen is de activering en verwerking van procaspase-8a/b bij de DISC een sterk gereguleerd proces dat verschillende stappen omvat. Dit artikel bespreekt de meting van procaspase-8-verwerking direct op de DISC en de analyse van de samenstelling van dit complex. Dit zal worden gepresenteerd met behulp van CD95 DISC als het voorbeeldige DR-complex.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T-cel experimenten werden uitgevoerd volgens de ethische overeenkomst 42502-2-1273 Uni MD.

1. Cellen voorbereiden voor het experiment

OPMERKING: Het gemiddelde aantal cellen voor deze immunoprecipitatie is 1 × 107. Adherente cellen moeten een dag voor het experiment worden gezaaid, zodat er op de dag van het experiment 1 ×10 7 cellen zijn.

  1. Hechte cellen voorbereiden voor het experiment
    1. Zaad 5-8 × 106 aanhangende cellen in 20 ml medium (zie de tabel met materialen voor de samenstelling) voor elke voorwaarde in schalen van 14,5 cm een dag voordat het experiment begint.
    2. Zorg er op de dag van het experiment voor dat de cellen voor 80-90% confluent zijn en zich hechten aan het gerecht. Gooi het medium weg en voeg vers medium toe aan de aanhangende cellen.
  2. Suspensiecellen voorbereiden voor het experiment
    1. Plaats zorgvuldig 1 × 107 suspensiecellen in 10 ml kweekmedium (zie de tabel met materialen voor de samenstelling) per conditie in schalen van 14,5 cm vlak voordat het experiment begint.
    2. Als u primaire cellen gebruikt, isoleer dan primaire T-cellen volgens de eerder beschreven procedure21. Behandel primaire T-cellen met 1 μg / ml fytohemagglutinine gedurende 24 uur, gevolgd door 25 U / ml IL2-behandeling gedurende 6 dagen.
    3. Plaats zorgvuldig 1 × 108 primaire T-cellen in 10 ml kweekmedium (zie de tabel met materialen voor de samenstelling) per voorwaarde in schalen van 14,5 cm vlak voordat het experiment begint.
      OPMERKING: Dit hogere aantal primaire T-cellen wordt aanbevolen, omdat deze cellen kleiner zijn.

2. CD95L stimulatie

  1. Stimuleer de cellen met CD95L (geproduceerd zoals eerder beschreven20 of in de handel verkrijgbaar (zie de tabel met materialen)).
    OPMERKING: De concentratie van de CD95L en de tijd van stimulatie zijn celtype afhankelijkvan 13,15,22,23,24,25. Bereid twee keer één stimulatieconditie voor om parallel een 'bead control'-monster te genereren.
    1. Stimuleer aanhangende cellen met de geselecteerde concentratie CD95L. Houd de plaat onder een hoek en pipetteer het ligand in het medium zonder de aanhangende cellen aan te raken.
    2. Stimuleer suspensiecellen met CD95L door de ligandoplossing in de celsuspensie te pipetteren.

3. Celoogst en lysis

  1. Zet de celschalen op ijs.
    OPMERKING: Gooi het medium niet weg. Stervende cellen drijven in het medium en zijn belangrijk voor de analyse.
  2. Voeg 10 ml koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de celsuspensie en schraap de aangesloten cellen van de plaat. Verzamel de celsuspensie in een buis van 50 ml.
  3. Was de celschaal tweemaal met 10 ml koude PBS en plaats de wasoplossing in dezelfde buis van 50 ml. Centrifugeer de celsuspensie bij 500 × g gedurende 5 min, 4 °C.
  4. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel met 1 ml koude PBS. Breng de celsuspensie over in een buis van 1,5 ml.
  5. Centrifugeer de celsuspensie bij 500 × g gedurende 5 min, 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel met 1 ml koude PBS.
  6. Centrifugeer de celsuspensie bij 500 × g gedurende 5 min, 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel met 1 ml lysisbuffer (met 4% proteaseremmercocktail). Incubeer het gedurende 30 minuten op ijs.
  7. Centrifugeer het lysaat met maximale snelheid (~17.000 × g) gedurende 15 min, 4 °C.
  8. Breng het supernatant (lysaat) over in een schone buis. Gooi de pellet weg. Neem 50 μL van het lysaat in een andere buis. Analyseer de eiwitconcentratie door Bradford-test en neem de hoeveelheid lysaat die overeenkomt met 25 μg eiwit in een injectieflacon. Voeg de laadbuffer (zie de tabel met materialen voor de samenstelling) toe aan de injectieflacon. Bewaren bij -20 °C als lysaatcontrole.

4. Immunoprecipitatie (IP)

  1. Voeg 2 μL anti-APO-1-antilichamen en 10 μL eiwit A sepharose-kralen (bereid zoals aanbevolen door de fabrikant) toe aan het lysaat. Voeg slechts 10 μL van de kralen toe aan een aparte buis met lysaat (gestimuleerd monster) om een 'kraalcontrole' te genereren.
    OPMERKING: Gebruik pipetpunten met brede openingen door de uiteinden te snijden of speciale tips voor IP te kopen tijdens het hanteren van het eiwit A sepharose kralen.
  2. Incubeer het mengsel van lysaat met antilichamen/eiwit A sepharose kralen met zachte menging gedurende de nacht bij 4 °C. Centrifugeer de lysaten met antilichamen/eiwit A sepharose kralen bij 500 × g gedurende 4 min, 4 °C. Gooi het supernatant weg, voeg 1 ml koude PBS toe aan de kralen en herhaal deze stap minstens drie keer.
  3. Gooi het supernatant weg. Zuig de kralen bij voorkeur op met een Hamilton spuit van 50 μL.

5. Western blot

  1. Voeg 20 μL van 4x belastingsbuffer (zie de tabel met materialen voor de samenstelling) toe aan de kralen en verwarm gedurende 10 minuten bij 95 °C. Verwarm de lysaatregelaars gedurende 5 minuten op 95 °C.
  2. Laad de lysaten, IP's en een eiwitstandaard op een 12,5% natriumdodecylsulfaat (SDS) gel (zie de tabel met materialen voor het gelpreparaat) en voer uit met een constante spanning van 80 V.
  3. Breng de eiwitten van de SDS-gel over naar een nitrocellulosemembraan.
    OPMERKING: Hier werd de halfdroge techniek, geoptimaliseerd voor de eiwitten van belang, gebruikt voor de overdracht gedurende 12 minuten (25 V; 2,5 A = constant). Week het nitrocellulosemembraan en twee mini-formaat transfer stacks in elektroforesebuffer (zie de tabel met materialen voor de samenstelling, bereid volgens de instructies van de fabrikant) gedurende een paar minuten voor western blotting.
  4. Plaats het afgeveegde membraan in een doos en blokkeer het gedurende 1 uur in de blokkerende oplossing (0,1% Tween-20 in PBS (PBST) + 5% melk). Incubeer het membraan met de blokkerende oplossing onder zachte agitatie.
  5. Was het membraan drie keer met PBST gedurende 5 minuten per wasbeurt.

6. Western blot detectie

  1. Voeg het eerste primaire antilichaam bij de aangegeven verdunning (zie de tabel met materialen) toe aan het membraan en incubeer het gedurende een nacht bij 4 °C met zachte agitatie.
  2. Was het membraan drie keer met PBST gedurende 5 minuten per wasbeurt.
  3. Incubeer het membraan met 20 ml secundair antilichaam (verdund 1:10.000 in PBST + 5% melk) met zacht schudden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. Was het membraan drie keer met PBST gedurende 5 minuten per wasbeurt.
  5. Gooi PBST weg en voeg ongeveer 1 ml mierikswortelperoxidasesubstraat toe aan het membraan.
  6. Detecteer het chemoluminescente signaal (zie de tabel met materialen).
    OPMERKING: De belichtingstijd en het aantal vastgelegde beelden zijn afhankelijk van de hoeveelheid eiwit in de cel en de specificiteit van de gebruikte antilichamen. Het moet empirisch worden vastgesteld voor elk antilichaam dat voor de detectie wordt gebruikt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om caspase-8-rekrutering voor de DISC en de verwerking ervan op de CD95 DISC te analyseren, beschrijft dit artikel een klassieke workflow, die IP van de CD95 DISC combineert met western blot-analyse. Dit maakt de detectie van verschillende belangrijke kenmerken van caspase-8 activering op de DISC mogelijk: de assemblage van het caspase-8-activerende macromoleculaire platform, rekrutering van procaspase-8 voor de DISC en de verwerking van deze initiator caspase (Figuur 1 en

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze benadering werd voor het eerst beschreven door Kischkel et al.27 en is sindsdien met succes ontwikkeld door verschillende groepen. Verschillende belangrijke kwesties moeten worden overwogen voor efficiënte DISC-immunoprecipitatie en monitoring caspase-8-verwerking in dit complex.

Ten eerste is het essentieel om alle wasstappen tijdens immunoprecipitatie te volgen. Vooral belangrijk zijn de laatste wasstappen van de sepharose kralen en het drogen van de sepharose kr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen de Wilhelm Sander-Foundation (2017.008.02), het Center of Dynamic Systems (CDS), gefinancierd door het EU-programma EFRO (European Regional Development Fund) en de DFG (LA 2386) voor het ondersteunen van ons werk. We bedanken Karina Guttek voor het ondersteunen van onze experimenten. We erkennen Prof. Dirk Reinhold (OvGU, Magdeburg) voor het leveren van primaire T-cellen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12.5% SDS gelzelf gemaaktvoor twee scheidingsgels:
3,28 mL gedistilleerd H2O
2,5 mL Tris; pH 8,8; 1,5 M
4,06 mL acrylamid
100 µL 10% SDS
100 µL 10% APS
7,5 µL TEMED

voor twee opvanggels:
3,1 mL gedistilleerd H2O
1,25 mL Tris; pH 6,8; 1,5 M
0,5 mL acrylamid
50 µL 10% SDS
25 µL 10% APS
7,5 µL TEMED
14.5 cm celschaaltjesGreiner639160
acrylamidCarl RothA124.1
Aerosol filter pipet tips met hoog herstelfilter en brede openingVWR46620-664 (Noord-Amerika) of 732-0559 (Europa)Gebruikt voor het pipetten van kralen naar het lysate
anti-actin AbSigma AldrichA2103verdunning: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-APO-1 Abverstrekt in deze experimenten door Prof. P. Krammer of kan worden gekocht bij EnzoALX-805-038-C100alleen gebruikt voor immunoprecipitatie
anti-caspase-10 AbBiozolMBL-M059-3verdunning: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Abcell signaling9662 Sverdunning: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15verstrekt in deze experimenten door Prof. P. Krammer of kan worden gekocht bij ENZOALX-804-242-C100verdunning: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3
anti-CD95 AbSanta Cruzsc-715verdunning: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Abverstrekt in deze experimenten door Prof. P. Krammer of kan worden gekocht bij ENZOALX-804-961-0100verdunning: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Abverstrekt in deze experimenten door Prof. P. Krammer of kan worden gekocht bij ENZOADI-AAM-212-Everdunning: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3
anti-PARP Abcell signaling9542verdunning: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3
APSCarl Roth9592.3
β-mercaptoethanolCarl Roth4227.2
Bradford oplossing
Eiwit Assay Dye Reagens Concentraat 450ml		Bio Rad500-0006gebruikt volgens de instructies van de fabrikant
CD95Lverstrekt in deze experimenten door Prof. P. Krammer of kan worden gekocht bij ENZOALX-522-020-C005
chemoluminiscentie detector
Chem Doc XRS+		Bio Rad
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail (PIC)Sigma Aldrich11 836 145 001bereid volgens de instructies van de fabrikant
DPBS (10x) zonder Ca, MgPAN BiotechP04-53500verdunning 1:10 met H2O, opslag in de koelkast
elektroforese bufferzelf gemaakt10x elektroforese buffer:
60,6 g Tris
288 g glycine
20 g SDS
ad 2 L H2O
1:10 verdunning voor gebruik
glycineCarl Roth3908.3
Goat Anti-Mouse IgG1 HRPSouthernBiotech1070-05verdunning 1:10.000 in PBST + 5% melk
Goat Anti-Mouse IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05verdunning 1:10.000 in PBST + 5% melk
Goat Anti-Rabbit IgG-HRPSouthernBiotech4030-05verdunning 1:10.000 in PBST + 5% melk
Interleukin-2 Human(hIL-2)Merckgroup/ Roche11011456001voor activering van T-cellen
KClCarl Roth6781.2
KH2PO4Carl Roth3904.1
loading buffer
4x Laemmli Sample Buffer, 10 mL		Bio Rad161-0747bereid volgens de instructies van de fabrikant
Luminata Forte Western HRP substraatMilliporeWBLUFO500
lyseringsbufferzelf gemaakt13,3 mL Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M
27,5 mL NaCl; 5 M
10 mL EDTA; 2 mM
100 mL Triton X-100
voeg 960 mL H2O toe
medium voor adherante cellen DMEM F12 (1:1) met stabiel Glutamine,  2,438 g/LPAN BiotechP04-41154voeg 10% FCS, 1% Penicilline-Streptomycine en 0,0001% Puromycine toe aan het medium
medium voor primaire T-cellengibco by Life Technologie21875034voeg 10% FCS en 1% Penicilline-Streptomycine toe aan het medium
melkpoederCarl

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
  2. Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
  3. Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
  4. Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
  5. Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
  6. Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
  7. Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
  8. Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
  9. Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
  10. Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
  11. Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
  12. Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
  13. Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
  14. Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
  15. Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
  16. Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
  17. Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
  18. Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
  19. Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
  20. Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
  21. Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
  22. Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
  23. Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
  24. Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
  25. Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
  26. Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352(2010).
  27. Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
  28. Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
  29. Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Death Inducing Signaling ComplexProcaspase 8 ProcessingCD95 DISC FormationExtrinsic ApoptosisImmunoprecipitation TechniqueWestern BlotCaspase 8 ActivationFADD Recruitmentc FLIP ProteinsCaspase 8 Activity Assay

Related Articles