Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62853

⸱

19 juli 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo

In dit artikel

Samenvatting

Ondanks recente vooruitgang blijven veel mitochondriale gisteiwitten nog steeds met hun functies volledig onbekend. Dit protocol biedt een eenvoudige en betrouwbare methode om de submitchondriale lokalisatie van eiwitten te bepalen, wat fundamenteel is geweest voor de opheldering van hun moleculaire functies.

Samenvatting

Ondanks recente vooruitgang in de karakterisering van gist mitochondriaal proteoom, blijft de submitochondrial lokalisatie van een aanzienlijk aantal eiwitten ongrijpbaar. Hier beschrijven we een robuuste en effectieve methode voor het bepalen van de suborganellaire lokalisatie van gist mitochondriale eiwitten, die wordt beschouwd als een fundamentele stap tijdens mitochondriale eiwitfunctie-opheldering. Deze methode omvat een eerste stap die bestaat uit het verkrijgen van zeer zuivere intacte mitochondriën. Deze mitochondriale preparaten worden vervolgens onderworpen aan een subfractionatieprotocol bestaande uit hypotone shock (zwelling) en incubatie met proteïnase K (protease). Tijdens zwelling wordt het buitenste mitochondriale membraan selectief verstoord, waardoor het proteïnase K eiwitten van het intermembraanruimtecompartiment kan verteren. Tegelijkertijd, om informatie te verkrijgen over de topologie van membraaneiwitten, worden de mitochondriale preparaten in eerste instantie gesoniseerd en vervolgens onderworpen aan alkalische extractie met natriumcarbonaat. Ten slotte worden na centrifugeren de pellet- en supernatantfracties van deze verschillende behandelingen geanalyseerd door SDS-PAGE en western blot. De submitchondriale lokalisatie en de membraantopologie van het eiwit van belang wordt verkregen door het western blot-profiel te vergelijken met bekende standaarden.

Inleiding

Mitochondriën zijn essentiële organellen van eukaryote cellen die een cruciale rol spelen in bio-energetica, cellulair metabolisme en signaalroutes1. Om deze taken goed uit te voeren, vertrouwen mitochondriën op een unieke set eiwitten en lipiden die verantwoordelijk zijn voor hun structuur en functie. De ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae is veel gebruikt als modelsysteem voor onderzoek naar mitochondriale processen, evenals voor andere organellen2. Het mitochondriale genoom codeert voor slechts acht eiwitten in gist; de overgrote meerderheid van mitochondriale eiwitten (~99%) wordt gecodeerd door nucleaire genen, die worden vertaald op cytosolische ribosomen, en vervolgens geïmporteerd in hun juiste submitochondriale compartimenten door geavanceerde eiwitimportmachines3,4,5. Mitochondriale biogenese hangt dus af van de gecoördineerde expressie van zowel het nucleaire als het mitochondriale genoom6,7. Genetische mutaties die defecten in mitochondriale biogenese veroorzaken, zijn geassocieerd met ziekten bij de mens8,9,10.

In de afgelopen twee decennia resulteerden proteomische studies met hoge doorvoer gericht op sterk gezuiverde mitochondriën in een uitgebreide karakterisering van gist mitochondriaal proteoom, dat naar schatting bestaat uit ten minste 900 eiwitten11,12,13,14. Hoewel deze studies waardevolle informatie opleverden, is de suborganellaire lokalisatie van elk eiwit in de vier mitochondriale subsecties, namelijk het buitenmembraan (OM), de intermembraanruimte (IMS), het binnenmembraan (IM) en de matrix, nog steeds vereist. Deze vraag werd gedeeltelijk beantwoord met proteomische studies van de twee kleinere mitochondriale subcompartementen (OM en IMS)15,16. Meer recent hebben Vögtle en medewerkers een grote stap voorwaarts gezet door een hoogwaardige wereldwijde kaart van de distributie van submitochondriale eiwitten in gist te genereren. Met behulp van een geïntegreerde aanpak die SILAC-gebaseerde kwantitatieve massaspectrometrie, verschillende submitchondriële fractioneringsprotocollen en de dataset van de OM- en IMS-proteomen combineert, hebben de auteurs 818 eiwitten toegewezen aan de vier mitochondriale subcompartmenten13.

Ondanks de vooruitgang die deze high-throughput proteomische studies hebben geboekt, is onze kennis over de samenstelling van het submitochondriale proteoom verre van compleet. Inderdaad, van de 986 eiwitten die door Vögtle en medewerkers werden gerapporteerd als gelokaliseerd in gist mitochondriën, konden er 168 niet worden toegewezen in een van de vier submitchondriële compartimenten13. Bovendien gaven de auteurs geen informatie over de membraantopologie van eiwitten waarvan werd voorspeld dat ze perifeer aan de periferie van mitochondriale membranen waren bevestigd. Het is bijvoorbeeld niet mogelijk om te weten of een eiwit dat is toegewezen als perifeer bevestigd aan het binnenmembraan zich naar de matrix of de intermembraanruimte bevindt. Afgezien van deze ontbrekende gegevens uit de proteoombrede studies, is er tegenstrijdige informatie over de suborganellaire lokalisatie van een aanzienlijk aantal mitochondriale eiwitten. Een voorbeeld is het protease Prd1, dat is toegewezen als een intermembraan ruimte-eiwit in de gemeenschappelijke databases zoals Saccharomyces Genome Database (SGD) en Uniprot. Verrassend genoeg toonden Vögtle en medewerkers met behulp van een subfractionatieprotocol vergelijkbaar met het hier beschreven protocol duidelijk aan dat Prd1 een echt matrixeiwit13 is. Zoals hierboven vermeld, moet de submitchondrial lokalisatie van veel mitochondriale eiwitten worden opgehelderd of opnieuw geëvalueerd. Hier bieden we een eenvoudig en betrouwbaar protocol om de suborganellaire lokalisatie van gist mitochondriale eiwitten te bepalen. Dit protocol is ontwikkeld en geoptimaliseerd door verschillende onderzoeksgroepen en is routinematig gebruikt om de submitchondrial lokalisatie te bepalen, evenals de membraantopologie van veel mitochondriale eiwitten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Groei van gistcellen

  1. Isoleer enkele kolonies van de stam van belang door een klein deel van de cellen van een -80 °C glycerolvoorraad op een YPD (1% gistextract, 2% pepton, 2% glucose) agarplaat te strepen. Incubeer de plaat bij 30 °C gedurende 2-3 dagen.
    OPMERKING: De S. cerevisiae-stam die in dit protocol wordt gebruikt, is afgeleid van BY4741 (MATα; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). Met uitzondering van de auxotrofe markergenen bevat deze stam geen verwijderd gen en draagt geen plasmide. Het kan dus met succes worden gekweekt in een rijk medium, waardoor krachtige celgroei wordt gestimuleerd. Gebruik bij het werken met stammen die zijn getransformeerd met plasmiden het juiste minimale medium voor plasmideselectie.
  2. Bereid een startcultuur door 2-3 individuele kolonies van YPD-agarplaat in te enten in 10-20 ml YPGal-medium (1% gistextract, 2% pepton, 2% galactose) in een Erlenmeyer van 100 ml. Incubeer bij 30 °C gedurende 24 uur met krachtig schudden.
    OPMERKING: De keuze van het groeimedium hangt af van de giststam die in het protocol wordt gebruikt. Zowel YPD als YPGal bevatten fermenteerbare koolstofbronnen, die de groei van stammen mogelijk maken die geen mitochondriale ademhaling uitvoeren. Omdat glucose echter de expressie van veel mitochondriale genen onderdrukt, wordt het niet aanbevolen om deze koolstofbron te gebruiken, omdat deze lagere hoeveelheden mitochondriën zal produceren. Bij het werken met respiratoire competente stammen die kunnen ademen, is het ook mogelijk om koolstofbronnen zoals glycerol en ethanol te gebruiken in een poging om een hogere opbrengst van mitochondriën te verkrijgen.
  3. Verdun de startercultuur tot 1 L vers YPGal-medium tot een OD600 van minder dan 0,1. Kweek de cellen bij 30 °C met krachtig schudden tot od600 1-1,5 bereikt.
    OPMERKING: Bepaal de groeisnelheid (verdubbelingstijd) voor elke giststam voordat u het experiment uitvoert. Dit geeft een nauwkeurige schatting van de incubatietijd die nodig is om de cultuur een OD600 van 1-1,5 te laten bereiken.

2. Isolatie van sterk gezuiverde mitochondriën

OPMERKING: Dit protocol is aangepast van17, met kleine wijzigingen.

  1. Oogst de cellen door centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Was de cellen met gedestilleerd water en verzamel ze door centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Bepaal het natte gewicht van de cellen.
    OPMERKING: De eenvoudigste manier om het gewicht van de celkorrel uit stap 2.2 te meten, is door het gewicht van de lege centrifugebuis vlak voor het verzamelen van de cellen te bepalen. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en meet het gewicht van dezelfde buis met de cellen. Het gewicht van de cellen is het verschil tussen de twee metingen.
  4. Resuspend de cellen in DTT-buffer (2 ml per 1 g cellen) met behulp van een Pasteur pipet of P5000-tip. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de DDT-buffer.
  5. Incubeer de cellen bij 30 °C gedurende 20 minuten met zacht schudden (~ 70 rpm).
  6. Centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
  7. Was de cellen met Zymolyase buffer zonder het enzym (ongeveer 7 ml per 1 g cellen).
    Zie tabel 1 voor de samenstelling van de Zymolyasebuffer.
  8. Centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
  9. Resuspend de cellen in de buffer zonder Zymolyase (7 ml per 1 g cellen).
  10. Breng de celsuspensie over in een Erlenmeyer van 250 ml en voeg Zymolyase-20T (3 mg per g nat gewicht) toe.
  11. Incubeer de cellen bij 30 °C gedurende 30-40 minuten met zacht schudden (~ 70 rpm). Controleer de efficiëntie van dit proces door de troebelheid van de celsuspensie voor en na de behandeling met Zymolyase te vergelijken.
    OPMERKING: In deze stap worden de cellen omgezet in sferoplasten als gevolg van celwandvertering door Zymolyase.
    1. Voeg hiervoor 50 μL van elke celsuspensie toe aan afzonderlijke glazen buizen met 2 ml water. Na krachtig mengen zou de troebelheid van de met Zymolyase behandelde celsuspensie snel moeten afnemen als gevolg van de osmotische verstoring van sferoplasten. Aan de andere kant moet de troebelheid van de niet-behandelde celsuspensie ongewijzigd blijven.
      OPMERKING: De effecten van troebelheid kunnen ook worden gecontroleerd door eenvoudige visuele inspectie of door het meten van de OD600 van beide monsters. In het tweede geval moet de OD600 van het met Zymolyase behandelde monster 10%-20% van het niet-behandelde monster zijn. Een alternatieve methode omvat het tellen van de cellen in beide monsters met behulp van lichtmicroscopie.
    2. Als de opbrengst van de vorming van sferoplasten laag is, voeg dan meer Zymolyase toe en incubeer gedurende nog een interval van 15 minuten.
  12. Oogst de sferoplasten door centrifugeren bij 2500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Alle verdere stappen moeten snel en op ijs of bij 4 °C worden uitgevoerd om eiwitafbraak door hydrolytische enzymen te voorkomen.
  13. Was de sferoplasten tweemaal met ijskoude homogenisatiebuffer (ongeveer 6,5 ml per 1 g cellen) en pellet door 5 minuten bij 4 °C bij 2.500 x g te centrifugeren. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de homogenisatiebuffer.
  14. Resuspend de sferoplasten in ijskoude homogenisatiebuffer (6,5 ml per 1 g cellen) en breng deze over in een voorgekoelde glazen Dounce-homogenisator. Gebruik een grote glazen homogenisator van ongeveer 30 ml.
  15. Homogeniseer de sferoplasten met 15 slagen met behulp van een stamper.
    OPMERKING: Het aantal slagen moet worden aangepast afhankelijk van de stamperfitting. Voor strakke stamper zijn 15 slagen voldoende. Aan de andere kant, als u een losse stamper gebruikt, wordt het aanbevolen om maximaal 25 slagen uit te voeren.
  16. Breng het homogenaat over in een centrifugebuis van 50 ml en voeg 1 volume ijskoude homogenisatiebuffer toe.
  17. Centrifugeer het homogenaat bij lage snelheid, 1.500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om kernen, celresten en ongebroken cellen te pelleteren.
  18. Breng het supernatant over naar een nieuwe centrifugebuis van 50 ml met behulp van een Pasteur-pipet of P5000-tip om ervoor te zorgen dat de pellet niet wordt verstoord.
  19. Centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
  20. Breng het supernatant over in een snelle centrifugebuis en centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om de ruwe mitochondriale fractie te pelleteren.
  21. Gooi het supernatant weg en was de ruwe mitochondriale pellet voorzichtig in 20-30 ml ijskoude homogenisatiebuffer door zachtjes te pipetteren met een P5000-tip.
  22. Breng de suspensie over in een centrifugebuis van 50 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 4.000 x g om het resterende celafval te pelleteren.
  23. Breng het supernatant over in een snelle centrifugebuis en centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C om de ruwe mitochondriale fractie te pelleteren.
  24. Gooi het supernatant weg en resuspend de ruwe mitochondriale pellet voorzichtig in een klein volume (meestal 1000 μL) ijskoude SEM-buffer door zachtjes te pipetteren met een P1000-tip. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de SEM-buffer.
    OPMERKING: Hoewel deze ruwe mitochondriale fractie direct kan worden gebruikt in sommige toepassingen, zoals in organello-eiwitimporttests , bevat het aanzienlijke hoeveelheden andere cellulaire componenten. Deze verontreinigingen kunnen leiden tot verkeerde interpretaties van de resultaten bij het bepalen van de submitchondriële lokalisatie van een eiwit. Daarom zijn verdere zuiveringsstappen vereist om een sterk gezuiverd mitochondriaal preparaat te krijgen, zoals hieronder beschreven.
  25. Bereid sucrose-oplossingen in de EM-buffer bij concentraties van 60%, 32%, 23% en 15% (w/v). Deze oplossingen zijn tot 1 maand stabiel bij 4 °C. Zie tabel 1 voor de samenstelling van de EM-buffer.
  26. Bereid als volgt een 4-staps sucrosegradiënt in een ultracentrifugebuis: Plaats 1,5 ml 60% (w/v) sucrose op de bodem van de centrifugebuis. Pipetteer vervolgens voorzichtig stapsgewijs: 4 ml van 32%, 1,5 ml van 23% en 1,5 ml van 15% sucrose (w / v). Zorg ervoor dat de fasen niet worden verstoord.
  27. Laad de ruwe mitochondriale fractie voorzichtig bovenop de sucrosegradiënt.
  28. Centrifugeer gedurende 1 uur bij 134.000 x g bij 4 °C in een zwenkbakrotor.
  29. Blijf voorzichtig de sucrose-oplossing verwijderen totdat de sterk gezuiverde mitochondriale fractie is bereikt, die wordt vertegenwoordigd door een bruine band op het 60% / 32% sucrose-grensvlak.
  30. Herstel de gezuiverde mitochondriën met behulp van een P1000-gesneden punt en plaats deze in een voorgekoelde snelle centrifugebuis.
  31. Verdun de teruggewonnen mitochondriën met 5-10 volumes ijskoude SEM-buffer.
  32. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C.
  33. Resuspend de zuivere mitochondriën in 500 μL ijskoude SEM-buffer door zachtjes te pipetteren met behulp van een P1000-snijpunt.
  34. Bepaal de eiwitconcentratie van het sterk gezuiverde mitochondriale preparaat met behulp van de Bradford-procedure volgens de instructies van de fabrikant. Stel de eiwitconcentratie in op 10 mg eiwit/ml met ijskoude SEM-buffer.
    OPMERKING: Voor het hieronder beschreven submitchondriële fractioneringsprotocol wordt aanbevolen om vers bereide mitochondriën te gebruiken. Vögtle en medewerkers voerden echter een gedetailleerde kwaliteitscontroleanalyse uit van de mitochondriale intactheid en toonden aan dat bevroren organellen ook in dit protocol kunnen worden gebruikt13. Maak hiervoor aliquots van 40 μL en vries ze in vloeibare stikstof. Bewaren bij -80 °C.

3. Submitochondrial fractioneringsprotocol

OPMERKING: Dit protocol is aangepast van referentie18 en bestaat uit twee stappen: (1) hypotone zwelling in de aan- of afwezigheid van proteïnase K, en (2) ultrasoonapparaat gevolgd door carbonaatextractie. Voer alle stappen van beide protocollen uit op ijs of bij 4 °C om eiwitafbraak te voorkomen.

  1. Hypotone zwelling in aanwezigheid van proteïnase K
    1. Breng 40 μL sterk gezuiverde mitochondriën over bij 10 mg/ml (400 μg) in vier voorgekoelde gelabelde microcentrifugebuizen van 1,5 ml.
    2. Voeg 360 μL SEM-buffer toe in buis 1 en 2.
    3. Voeg 360 μL EM-buffer toe in buis 3 en 4.
    4. Voeg 4 μL proteïnase K (10 mg/ml) toe in de buis 2 en 4. Gebruik het pipetteerschema in tabel 2 om fouten te voorkomen.
      OPMERKING: Bereid vlak voor gebruik een 10 mg/ml oplossing van proteïnase K in water. De uiteindelijke concentratie van proteïnase K in het experiment moet ongeveer 50-100 μg/ml zijn. Zie het gedeelte Discussie voor meer informatie.
    5. Meng alle tubes voorzichtig en incubeer op ijs gedurende 30 minuten met af en toe mengen.
    6. Voeg 4 μL van 200 mM PMSF toe aan alle vier de buizen om de proteïnase K-activiteit te stoppen.
      LET OP: PMSF is zeer giftig. Draag handschoenen bij het werken met oplossingen die PMSF bevatten.
    7. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
    8. Verzamel het supernatant en breng het over naar een nieuwe 1,5 ml voorgekoelde gelabelde microcentrifugebuis. Zorg ervoor dat de pellet niet wordt verstoord.
      OPMERKING: De pellet kan direct worden geresuspendeerd in de monsterbuffer voor verdere SDS-PAGE en western blot analyse. Sporen van proteïnase K kunnen echter ook na PMSF-behandeling actief blijven en kunnen uiteindelijk sommige eiwitten verteren nadat de pellet is opgelost in de SDS-bevattende monsterbuffer. Om dit probleem te voorkomen, kan proteïnase K volledig worden geïnactiveerd door behandeling van de monsters met trichloorazijnzuur (TCA) zoals hieronder beschreven.
      LET OP: TCA is zeer giftig. Draag handschoenen bij het werken met oplossingen die TCA bevatten.
    9. Resuspend de pellet uit stap 3.1.8 in 400 μL ijskoude SEM-buffer.
    10. Precipiteer het supernatant (vanaf stap 3.1.8) en de geresuspendeerde pellet (vanaf stap 3.1.9) met TCA tot een eindconcentratie van 10% (w/v).
    11. Incubeer alle buizen op ijs gedurende 10 minuten.
    12. Centrifugeer de met TCA behandelde monsters gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C.
    13. Verwijder het supernatant en suspend de pellet in 200 μL monsterbuffer.
      OPMERKING: Het is mogelijk dat de broomfenolblauwe pH-indicator geel wordt vanwege de zuurbehandeling. Als dit gebeurt, voeg dan kleine aliquots (1-5 μL) van 1 M Tris base toe totdat het blauw wordt.
    14. Voeg 4 μL van 200 mM PMSF toe aan alle buizen.
    15. Bewaar alle monsters bij -80 °C tot verdere analyse door SDS-PAGE en western blot.
  2. Sonicatie en carbonaatextractie
    OPMERKING: In dit protocol is het niet nodig om vers bereide mitochondriën te gebruiken zodra de ultrasoonapparaat de breuk van de mitochondriale membranen veroorzaakt.
    1. Breng 200 μL sterk gezuiverde mitochondriën over bij 10 mg /ml (2 mg eiwit) in een voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    2. Verdun mitochondriën eenvoudig met ijskoude SEM-buffer.
    3. Sonicate mitochondriën voor 3 x 30 s op ijs. Gebruik een sonicator die compatibel is met kleine volumes.
    4. Centrifugeer het monster gedurende 30 minuten bij 100.000 x g bij 4 °C.
    5. Verzamel het supernatant en breng het over naar een nieuwe voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml. Houd het op ijs. Dit monster krijgt de naam oplosbare eiwitfractie (S).
    6. Resuspend de pellet uit stap 3.2.4 in 400 μL ijskoude SEM-buffer.
    7. Neem 100 μL van de geresuspendeerde pellet uit stap 3.2.6 en breng deze over in een nieuwe voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml. Houd het op ijs. Dit monster krijgt de naam submitochondrial particles fraction (SMP).
    8. Verdun de resterende 300 μL uit stap 3.2.6 eenvoudig met vers bereid 200 mM natriumcarbonaat.
    9. Incubeer het monster uit stap 3.2.8 gedurende 30 minuten op ijs.
    10. Centrifugeer het monster gedurende 30 minuten bij 100.000 x g bij 4 °C.
    11. Verzamel het supernatant en breng het over naar een nieuwe voorgekoelde microcentrifugebuis van 1,5 ml. Houd het op ijs. Dit monster krijgt de naam carbonate supernatant fraction (CS).
    12. Resuspend de pellet uit stap 3.2.10 in 400 μL ijskoude SEM-buffer. Dit monster krijgt de naam carbonate precipitated fraction (CP).
    13. Precipiteer alle monsters (S, SMP, CS en CP) met TCA tot een eindconcentratie van 10% (w/v).
    14. Incubeer alle buizen op ijs gedurende 10 minuten.
    15. Centrifugeer de met TCA behandelde monsters gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij 4 °C.
    16. Verwijder het supernatant en resuspend elke pellet in de monsterbuffer. Als de monsterbuffer geel wordt, voegt u kleine aliquots (1-5 μL) van 1 M Tris-basis toe totdat deze blauw wordt.
    17. Voeg 1 μL van 200 mM PMSF toe aan alle buizen.
    18. Bewaar alle monsters bij -80 °C tot verdere analyse door SDS-PAGE en western blot.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het succes van het submitchondrial fractioneringsprotocol hangt af van het verkrijgen van sterk gezuiverde intacte mitochondriën. Hiervoor is het essentieel dat tijdens de gistcellysis de intactheid van de organellen bijna volledig bewaard blijft. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een cellysisprotocol dat de enzymatische vertering van de celwand combineert, gevolgd door fysieke verstoring van het plasmamembraan door een Dounce-homogenisator te gebruiken. De mitochondriale inhoud wordt vervolgens verzameld door ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol is met succes gebruikt en continu geoptimaliseerd voor een lange tijd om de eiwitlokalisatie in de submitochondrial compartimenten13,14,18,21,22,23 te bepalen. De betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van dit protocol zijn sterk afhankelijk van de zuiverheid en integriteit van mitochondriale ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.

Dankbetuigingen

We danken Dr. A. Tzagoloff (Columbia University) voor het leveren van antilichamen tegen submitochondrial marker eiwitten Cyt. b2, αKGD en Sco1. We bedanken ook Dr. Mario Henrique de Barros (Universidade de São Paulo) voor de nuttige discussie en opmerkingen tijdens de oprichting van dit protocol.

Dit werk werd ondersteund door onderzoekssubsidies van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (subsidie 2013/07937-8).

Fernando Gomes en Helena Turano worden ook ondersteund door FAPESP, subsidies 2017/09443-3 en 2017/23839-7, respectievelijk. Angélica Ramos wordt ook ondersteund door Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bacto PeptoneBD211677
Bacto Yeast extractBD212750
Beckman Ultra-Clear Centrifuge Tubes, 14 x 89 mmBeckman Coulter344059
Bovine serum albumin (BSA vetzuren vrij)Sigma-AldrichA7030Component van homogenisatiebuffer
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43815Component van DDT-buffer
D-SorbitolSigma-AldrichS1876
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE9884
GalactoseSigma-AldrichG0625
GlucoseSigma-AldrichG7021
MOPSSigma-AldrichM1254
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626Wordt gebruikt om proteinase K te inactiveren
Potassium phosphate dibasicSigma-AldrichP3786
Potassium phosphate monobasicSigma-AldrichP0662
Proteinase KSigma-Aldrich
SucroseSigma-AldrichS8501
Trichloroacetic acid (TCA)Sigma-AldrichT6399
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Zymolyase-20T van Arthrobacter luteusMP Biomedicals, Irvine, CA320921Wordt gebruikt om levende gistcelwanden te lyseren om sfeeroplast te produceren

Referenties

  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
  3. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
  4. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
  5. Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
  6. Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
  7. Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
  8. Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
  9. Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
  10. Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
  11. Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
  12. Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
  13. Vögtle, F. N., et al. Landscape of submitochondrial protein distribution. Nature Communications. 8 (1), 00359(2017).
  14. Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
  15. Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
  16. Vögtle, F. -N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
  17. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417(2009).
  18. Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
  19. Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
  20. Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
  21. Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
  22. Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
  23. Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
  24. Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
  25. Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. Isolation of yeast mitochondria. Methods in molecular biology. 313 (1), Clifton, N.J. 33-39 (2006).
  26. Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463(2016).
  27. Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484(2016).
  28. Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
  29. Neupert, W., Herrmann, J. M. Translocation of proteins into mitochondria. Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).
  30. Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Submitochondriale lokalisatiemitochondriale eiwittenbehandeling met proteinase Khypotone zwellingalkalische extractieSDS-PAGEWestern blotmitochondriale subfractionering
Beoordeling van submitchondrial protein localization in ontluikende gist Saccharomyces cerevisiae
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.