Methodenartikel

Live fluorescentie, inverse beeldvorming van celruches en macropinocytose

DOI:

10.3791/62870

⸱

5 augustus 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol demonstreert dextran-beeldvorming in levende cellen met behulp van continue opname en inverse beelden om de visualisatie van ruches, macropinosoomrijping en analyse van dextran en andere cellabels te optimaliseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macropinocytose is een sterk geconserveerd maar nog steeds onvolledig begrepen proces dat essentieel is voor de opname en opname van vloeistof, voedingsstoffen in de vloeistoffase en ander materiaal in cellen. De dramatische uitbreiding van ruches op het celoppervlak, hun sluiting om macropinosomen te vormen en de rijping van geïnternaliseerde macropinosomen zijn belangrijke gebeurtenissen in deze route die moeilijk vast te leggen zijn met conventionele confocale beeldvorming op basis van het volgen van een bolus fluorescerende lading. Fluorescerende dextrans worden vaak experimenteel gebruikt als vloeistoffasemarkers voor macropinosomen en voor andere endocytische routes. Een methode die het lab heeft aangenomen om de beeldvorming van de opname van dextran te optimaliseren, omvat het gebruik van live beeldvorming van cellen die baden in hoge concentraties fluorescerend dextran in het medium, waarbij de niet-gelabelde cellen in reliëf verschijnen (als zwart). De celruches worden gemarkeerd om de sluiting van de ruches te visualiseren, en geïnternaliseerde macropinosomen verschijnen als fluorescerende vacuolen in het celinterieur. Deze methode is optimaal voor het visualiseren van macropinosoomkenmerken en maakt eenvoudige segmentatie en kwantificering mogelijk. Dit artikel beschrijft dual-labeling van routes met dextrans van verschillende grootte en de co-expressie van lipidensondes en fluorescerende membraaneiwitten om macropinosomen en andere endosomen te markeren. De detectie van geïnternaliseerd dextran op ultrastructureel niveau met behulp van correlatief licht en elektronenmicroscopie (CLEM) wordt ook gedemonstreerd. Deze celprocessen kunnen worden afgebeeld met behulp van meerdere live beeldvormingsmodaliteiten, ook in 3D. Samen optimaliseren deze benaderingen de beeldvorming van macropinosoomen voor veel verschillende instellingen en experimentele systemen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meeste celtypen van gewervelde dieren delen het aangeboren vermogen voor de niet-selectieve opname van vloeistof met voorgangers gedurende de hele evolutie, die teruggaat tot eencellige amoebe1. Dit sterk geconserveerde proces van opname in de vloeistoffase door macropinocytose (big drinking) wordt door amoeben voornamelijk gebruikt voor het verwerven van voedingsstoffen1, terwijl het in gewervelde cellen op dezelfde manier een toevoerroute kan zijn voor het verkrijgen van voedingsstoffen onder stress, en het wordt gebruikt door immuuncellen voor de bemonstering en bewaking van weefselomgevingen2. Macropinocytose heeft kenmerken die het onderscheiden van andere vormen van endocytose, waaronder de kenmerkende, grote (>0,2 mm diameter) vacuolaire-achtige macropinosomen, de niet-selectieve aard van de opname van vocht en opgeloste stoffen en de bijbehorende uitgestrektheid van het plasmamembraan die opportunistisch worden geïnternaliseerd in macropinosomen3. Het niet-selectieve karakter van deze opname betekent dat sorteren en recyclen snel moet plaatsvinden om essentiële oplosbare en plasmamembraaneiwitten te redden door ze terug te recyclen naar het celoppervlak. Veel van het materiaal dat in macropinosomen wordt opgenomen, is bestemd voor afbraak in lysosomen en wordt via macropinosomrijping en fusie met andere endosomen naar endososomale routes geleid. Plasmamembraaneiwitten kunnen ook uit macropinosomen worden teruggevoerd naar het celoppervlak. Er is grote belangstelling op het gebied van kanker voor het begrijpen van het proces van macropinocytose, dat wordt geactiveerd in kankercellen en helpt om hun voeding en proliferatie in stand te houden 2,4,5,6. Macropinocytose vindt zowel constitutief plaats als kan verder worden geïnduceerd bij receptorgemedieerde stimulatie in immuuncellen, waar macropinosomen gastheerreceptorsignalering ontvangen, bijdragen aan endo/lysosomale verwerking voor antigeenpresentatie en een toegangsportaal bieden voor een verscheidenheid aan virussen, bacteriën en andere pathogenen 3,7.

Macropinosomen hebben weinig onderscheidende of unieke markeringen. Ze zijn het gemakkelijkst te identificeren tijdens hun vorming aan de basis van dramatische, actinerijke celoppervlakruches, die dicht bij de verzwelgenvloeistof8 liggen. Onmiddellijk na sluiting wordt de F-actine rond macropinosomen gedepolymeriseerd en ondergaan de macropinosomen zelf dynamische veranderingen die verband houden met homo- en heterotypische fusie, tubulatie en krimp9. Macropinosomen zijn ook moeilijk te identificeren op ultrastructureel niveau, omdat ze geen karakteristieke lagen of andere kenmerken hebben en gewoon verschijnen als vacuolen van verschillende groottes. Zonder definitieve membraanmarkers worden macropinosomen het gemakkelijkst en traditioneel gedefinieerd door hun vloeibare lading, die experimenteel is door het gebruik van fluorescerende dextraan. Dextran is een van glucose afgeleid complex polysacharide dat kan worden gekoppeld aan een groot aantal fluorescerende of elektronendichte markers en aan het medium kan worden toegevoegd voor opname door cellen of geperfundeerd voor opname in weefsels. Bovendien wordt dextran met een groot moleculair gewicht (MW) (70 kDa) nu beschouwd als een grootteselectieve lading voor macropinosomen, omdat het geen andere, kleinere endocytische blaasjes binnendringt, en het is het meest voorkomende label voor macropinocytosegeworden 10,11. Het bekijken van macropinocytose omvat meestal het incuberen van cellen met een puls van fluorescerend dextran en het gebruik van vaste of levende cellen voor fluorescentiebeeldvorming om de bolus van dexdex-labeling in cellen in macropinosomen te bekijken. Vanwege hun grote omvang kunnen niet-gelabelde macropinosomen in sommige celtypen ook worden bekeken met behulp van fasecontrast of helderveldmicroscopie, waarbij macropinosomen verschijnen als grote witte lege vacuolen. Enige contextuele informatie wordt verkregen uit de fasecontrastbeelden van de cellen, en deze beelden kunnen vervolgens worden bedekt met fluorescentiebeelden om de opname van fluorescerend dextran weer te geven12,13. Dextrans van verschillende groottes en met verschillende labels kan worden gebruikt om de opname van vocht in meerdere cellulaire en endocytische routes te controleren 10,14,15 en dextrans kan worden toegepast op celculturen of geperfundeerd in muizen voor intra-vitale beeldvorming16 of zelfs geïnjecteerd in vliegenembryo's17 voor levende beeldvorming.

Enkele van de moeilijkheden die zich voordoen bij het gebruik van dextran om macropinosomen te volgen, zijn onder meer het lekken uit macropinosomen na fixatie of permeabilisatie van cellen, het zijn verdunde of moeilijk te detecteren niveaus in cellen die geen agressieve macropinocytose uitvoeren, en de dynamische inzet en dispersie in cellen tijdens de rijping van macropinosoomen3. Deze problemen worden verergerd in de meeste experimenten die zijn ontworpen om de opname te volgen van een enkele puls dextran die aan cellen wordt toegevoegd en vervolgens wordt afgewassen.

In plaats daarvan beschrijft dit artikel de voordelen van het toepassen van fluorescerend dextran op de cellen en het tijdens live beeldvorming in het medium laten om continue opname in cellen vast te leggen. Dit versterkt het dextran-signaal in macropinosomen en daaropvolgende endosomen die het hele rijpingspad laten zien. Door gelabelde macropinosomen te bekijken tegen het niet-gelabelde (zwarte) inwendige van de cellen, als een inverse instelling met hoog contrast, worden alle kenmerken van de macropinosomen onthuld en, omgekeerd, buiten de cellen, benadrukt het sterk fluorescerende medium de dynamische ruches van het celoppervlak. Deze methode beschrijft de live beeldvorming van dextran voor lichtmicroscopische, confocale beeldvorming en voor de detectie ervan na celfixatie door correlatief licht en elektronenmicroscopie (CLEM). De beeldvorming die hier is opgenomen, werd uitgevoerd op verschillende celtypen om de brede toepasbaarheid van deze benaderingen aan te tonen, waaronder geactiveerde macrofagen en microgliale cellen, waar macropinocytose zeer actief en snel is, en in kankercellen waar macropinocytose relatief minder overvloedig is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van cellen op schaaltjes met glazen bodem van 35 mm (dag 0)

  1. Onderhoud en passage van de cellijnen in volledig medium aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd (voor RAW264.7) of regulier foetaal kalfsserum en 1% L-glutamine, bij 37 °C in bevochtigde 5% CO2 -incubator.
  2. Plaats het juiste aantal cellen om 60% confluentie te bereiken in 24 uur, op schalen met glazen bodem van 35 mm.
    OPMERKING: De aanbevolen celdichtheid ligt tussen 2 ml van 0,15 x 106 cellen/ml tot 0,25 x 106 cellen/ml voor de RAW264.7, BV2 microgliale cellen en MDA-MB 231 borstkankercellen die hier worden beschreven.

2. Transfectie van fluorescentie-DNA-plasmide (dag 1) - optioneel

OPMERKING: Verschillende fluorescerend gelabelde eiwitten en sondes kunnen tijdelijk of stabiel tot expressie worden gebracht in gekloonde cellijnen om actine-ruches en compartimenten in de endocytische route specifiek te labelen, zoals vroege endosomen, late endosomen of lysosomen.

  1. Transfecteer de cellen met behulp van een op lipiden gebaseerde transfectiekit volgens de instructies van de fabrikant, 1 dag na het plateren in een weefselkweekkap.
  2. Verdun 2 μg endotoxinevrij gezuiverd DNA-plasmide in 125 μl minimaal essentiële media (gereduceerd serum). Meng voorzichtig en laat het 5 minuten staan op kamertemperatuur.
  3. Verdun 5 μL transfectiemiddel in 125 μL minimale essentiële media (gereduceerd serum). Meng voorzichtig en laat het 5 minuten staan op kamertemperatuur.
  4. Combineer het verdunde DNA-plasmide en het verdunde transfectiereagens en incubeer nog eens 10 minuten alvorens druppelsgewijs aan cellen toe te voegen.
  5. Incubeer de cellen met transfectiecomplex bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-incubator gedurende 3-4 uur, alvorens ze te vervangen door vers volledig kweekmedium.
  6. Gebruik de getransfecteerde cellen de volgende dag voor experimenten of onder voorbehoud van beperkte verdunningsklonen om stabiel tot expressie brengende cellijnen te verkrijgen.

3. Visualisatie van endocytische blaasjes en macropinosomen (dag 2)

OPMERKING: Fluorescerende dextrans (Dextran Alexa Fluor 488/647 bij 10 kDa MW en Dextran Oregon Green 488/Tetramethylrhodamine bij 70 kDa MW, anionisch, lysine fixeerbaar) van verschillende molecuulgewichten worden gebruikt om de opname van de vloeistoffase in een reeks endocytische routes te controleren14. 70 kDa dextran voor macropinosomen en 10 kDa voor alle routes.

  1. Bereid dextran(en) als een 2x geconcentreerde suspensie bij 200-500 ng/ml in voorverwarmd kweekmedium om aan de cellen toe te voegen.
  2. OPTIONEEL: Experimenten kunnen voorafgaande of gelijktijdige toevoeging van supplementen of medicijnen vereisen om de endocytische activiteit te beïnvloeden. Behandel bijvoorbeeld macrofagen en microgliacellen voor met groeifactoren (bijv. 200 ng/ml CSF-1) of activerende liganden (bijv. LPS 100 ng/ml of 300 ng/ml CpG) om ruches en macropinocytose te verbeteren. Kweek de kankercellen gedurende 12-16 uur in een geschikt serumvrij medium voordat dextran in het volledige medium worden opgenomen. Raadpleeg stap 1.2 voor de aanbevolen celdichtheid.
  3. Om de live beeldvorming voor te bereiden, plaatst u de cellen die in schalen met glazen bodem zijn gekweekt op het podium van een omgekeerde confocale microscoop die is uitgerust met een verwarmingskussen van 37 °C en een bevochtigde incubator met 5% CO2 .
  4. Zuig het overtollige medium op en laat 500 μL van het volledige medium in de glazen bodemschaal.
  5. Zoek een geschikt gebied met cellen en stel de focus in. Selecteer voor time-lapse-beeldvorming vooraf de juiste fluorescentielasers, filters en instellingen voordat u deze aanschaft. Gebruik de volgende instellingen om afzonderlijke cellen en macropinosomen op te lossen.
    1. Beeld het interessegebied af op een omgekeerde confocale microscoop met een 63x 1,4 NA olie-immersie Plan Apochromat-objectief.
    2. Selecteer 512 x 512 voor beeldformaat, bidirectioneel scannen voor snelle beeldvorming.
    3. Focus op een individueel brandvlak van de cellen. Stel in om vast te leggen als een enkele plak of stel een optische plakdikte (Nyquist) in van ongeveer 0,3 μm om te combineren als Z-stacks.
    4. Selecteer time-lapse met een interval van 5 s, voor een duur tussen 20-45 minuten, afhankelijk van specifieke celtypen.
    5. Selecteer hardwarematige autofocus/focus-tracking om te helpen bij beeldstabilisatie tijdens het vastleggen gedurende een geschikte duur, afhankelijk van de specifieke celtypen.
    6. Voeg een gelijk volume van 2x dextran spiked medium toe en begin onmiddellijk met het vastleggen van live beelden voor macrofagen. Wacht 20 minuten voordat u de langzamere opname in MDA-MB 231-cellen in beeld brengt.
      OPMERKING: Met deze methode werden de BV2-cellen met twee fluorofoorkanalen met succes in beeld gebracht op een enkel vlak met maximale snelheidsmeting, continu gedurende 45 minuten na toevoeging van het dextianenmengsel. Om vroege macropinosomen te detecteren in RAW 264.7-cellen, waar macropinocytose zeer snel optreedt, verkrijgt u een enkele plak (voor snelle beeldvorming) of Z-stapel van 4-6 plakjes (voor 3D-opname) en time-lapse met een interval van 5 s gedurende 20 minuten na toevoeging van dextran. Verkrijg voor MDA-MB 231-cellen optimale Z-stacks tussen 10-15 plakjes, met intervallen van 5 s gedurende 40 minuten.

4. Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) (dag 3) - optioneel

  1. Bereid cellen voor volgens stap 1, 2 en 3 van het protocol met aanpassingen. Kortom, kweek 0,2 x 106 cellen/ml RAW264,7 cellen op gerasterde schalen met glazen bodem (35 mm schaal, nr. 1,5 gerasterd dekglaasje, 14 mm glasdiameter, ongecoat), transfecteer met een fluorescerend plasmide (bijv. mCherry-2xFYVE) en laat een nacht staan voordat u dextran-488 (70 kDa) gedurende 20 minuten bij 37 °C, 5% CO2 bevochtigde incubator toevoegt.
  2. Was de cellen snel met 1 ml ijskoude PBS en fixeer met 0,1% glutaaraldehyde.
  3. Verkrijg de vaste celbeelden van de dextran-488 en mCherry-2xFYVE op een confocale microscoop.
  4. Maak helderveldbeelden om de rasterposities te identificeren voordat de schotels worden verwerkt voor transmissie-elektronenmicroscopie (EM) zoals eerder beschreven18. Kortom, fixeer cellen verder in 2,5% glutaaraldehyde, postfixeer in 1% gereduceerd osmiumtetroxide, kleuring en-bloc met 2% uranylacetaat en dehydrateer vervolgens door een reeks ethanol voordat ze worden ingebed in LX112-hars. Snijd de gerasterde locaties uit het blok en verzamel ultradunne secties met behulp van een ultra-microtoom. Leg beelden vast op een elektronenmicroscoop bij 80 kV met behulp van de juiste beeldvormingssysteemsoftware.

5. Gegevensverwerking en visualisatie (dag 4)

OPMERKING: FIJI - een open-source beeldanalysepakket - wordt gebruikt voor visualisatie en analyse33.

  1. Dupliceer de onbewerkte gegevens voor verwerking om te voldoen aan de F.A.I.R.-gegevensprincipes, d.w.z. dat onderzoeksgegevens vindbaar, toegankelijk, interoperabel en herbruikbaar zijn.
  2. Pas de helderheid en het contrast voor afbeeldingssets gelijkmatig aan met behulp van de histogramgegevens.
  3. Geef de beelden weer als projecties met maximale intensiteit van verkregen Z-stack-beelden.
  4. Voeg een schaalbalk in voor afbeeldingensets.
  5. FOV-gegevens bijsnijden/roteren (optioneel). Maak representatieve deelvensters voor de tijdreeksgegevens.
  6. Voor verdere analyse en kwantificering kwantificeert u de fluorescentie-intensiteit van dextran dat in cellen wordt opgenomen als maat voor de macropinocytose-activiteit. Om de analyse te beperken tot individuele cellen, gebruikt u de hier beschreven beeldvormingsmethode.
    1. Keer de LUT om om de kleur om te draaien voor celgebieden zonder fluorescentie om drempels uit te voeren.
    2. Segmenteer het voorgrondobject en maak een celmasker om afzonderlijke cellen te identificeren.
    3. Gebruik het celmasker in combinatie met een eerder gepubliceerde methode19 die individuele macropinosomen identificeert en meet. Gebruik deze statistieken om macropinocytose te kwantificeren, inclusief grootte, aantal en totale opname per cel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De benadering van het afbeelden van niet-gelabelde levende cellen ondergedompeld in een hoge concentratie fluorescerend dextran heeft verschillende voordelen ten opzichte van conventionele beeldvormingstechnieken voor het volgen van macropinocytose. Door de beelden in reliëf weer te geven, zien de cellichamen er zwart uit en maken ze een betere visualisatie mogelijk van het dramatische celoppervlak dat zich nestelt tegen een heldere, fluorescerende achtergrond, gevolgd door internalisati...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft variaties op meer traditionele manieren om dextran-labeling te gebruiken om macropinocytose te volgen, gebaseerd op live beeldvorming van cellen die continu baden in fluorescerende dextran(en) en het visualiseren van de opname op de zwarte achtergrond van niet-gelabelde cellen. Het geoptimaliseerde protocol biedt de middelen om onderscheid te maken tussen verschillende intracellulaire blaasjes en maakt een ruimtelijk-temporele tracking van meerdere macropinocytotis...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Tatiana Khromykh voor haar deskundige technische assistentie. Fluorescentiebeeldvorming werd uitgevoerd in IMB-microscopie met behulp van de Cancer Ultrastructure and Function Facility, gefinancierd door de Australian Cancer Research Foundation; elektronenmicroscopie werd uitgevoerd in het Centrum voor Microscopie en Microanalyse van UQ. Financiering werd ontvangen van de National Health and Medical Research Council of Australia (JLS APP1176209) en de Australian Research Council (DP180101910). NDC wordt ondersteund als CZI Imaging Scientist door subsidienummer 2020-225648 van het Chan Zuckerberg Initiative DAF, een geadviseerd fonds van Silicon Valley Community Foundation. YH werd ondersteund door een Ph.D. beurs van de Australische overheid en financiering van het Yulgilbar Alzheimer Research Program. Z-JX werd ondersteund door een beurs van de Chinese Academie van Wetenschappen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2% Osmium TetroxideProSciTechEMS19192
647-TransferrinMolecular Probes, Invitrogen  T23366
BV2 cellsGift kindly given to us by Dr Liviu Bodea (Queensland Brain Institute)-
CpG (Class B) BIntegrated DNA TechnologiesCustom Order
Dextran Alexa Fluor 488  at 10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22910
Dextran Alexa Fluor 647  at 10 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD22914
Dextran Oregon Green 488 at 70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD1818
Dextran Tetramethylrhodamine at 70 kDa MWLife Technology Australia Pty LtdD7173
DMEM medium with sodium pyruvate and L-glutamineGibco Invitrogen#11995
Fetal Calf serumInterpath Services Pty LtdSFBS-F
Glutaraldehyde aqueous solution, EM Grade 25%ProSciTechC002
Jeol 1011 electron microscopeJEOL-
L-GlutamineGibco Invitrogen25030081
Lipofectamine 2000Gibco Invitrogen11668019
MatTek  Glass Bottom Dish 35 mm, uncoated gridMatTek CorporationP35G-2-14-CGRD
MatTek glass bottom dishes 35 mm uncoatedMatTek CorporationP35G-1.5-14C
MDA-MB 231 cellsATCCHTB-26
Opti-MEM reduced serum mediumThermo Fisher Scientific31985088
Plasmid mCherry-2XFYVEGift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)-
Plasmid mCherry-PLCδ-PHGift kindly given to us by Dr Frederic Meunier (University of Queensland)-
Raw264.7 cellsATCCTIB-71
RPMI medium 1640,without L-glutamineGibco Invitrogen#21870
Ultrapure LPSJomar Life Research Pte LtdTLR-3PELPS
Uranyl AcetateProSciTechC079
Zeiss inverted LSM880 confocal microscopeZeiss-

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. King, J. S., Kay, R. R. The origins and evolution of macropinocytosis. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1765), 20180158(2019).
  2. Stow, J. L., Hung, Y., Wall, A. A. Macropinocytosis: Insights from immunology and cancer. Current Opinion in Cell Biology. 65, 131-140 (2020).
  3. Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Defining macropinocytosis. Traffic. 10 (4), 364-371 (2009).
  4. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  5. Kim, S. M., et al. PTEN deficiency and AMPK activation promote nutrient scavenging and anabolism in prostate cancer cells. Cancer Discovery. 8 (7), 866-883 (2018).
  6. Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: A metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 8, 261(2017).
  7. Stow, J. L., Condon, N. D. The cell surface environment for pathogen recognition and entry. Clinical & Translational Immunology. 5 (4), 71(2016).
  8. Swanson, J. A., Watts, C. Macropinocytosis. Trends in Cell Biology. 5 (11), 424-428 (1995).
  9. Buckley, C. M., King, J. S. Drinking problems: mechanisms of macropinosome formation and maturation. FEBS Journal. 284 (22), 3778-3790 (2017).
  10. Berthiaume, E. P., Medina, C., Swanson, J. A. Molecular size-fractionation during endocytosis in macrophages. Journal of Cell Biology. 129 (4), 989-998 (1995).
  11. Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: Similarities and differences. Membranes (Basel). 10 (8), 177(2020).
  12. Pacitto, R., Gaeta, I., Swanson, J. A., Yoshida, S. CXCL12-induced macropinocytosis modulates two distinct pathways to activate mTORC1 in macrophages. Journal of Leukocyte Biology. 101 (3), 683-692 (2017).
  13. Yoshida, S., Pacitto, R., Yao, Y., Inoki, K., Swanson, J. A. Growth factor signaling to mTORC1 by amino acid-laden macropinosomes. Journal of Cell Biology. 211 (1), 159-172 (2015).
  14. Chvanov, M., et al. Intracellular rupture, exocytosis and actin interaction of endocytic vacuoles in pancreatic acinar cells: initiating events in acute pancreatitis. Journal of Physiology. 596 (13), 2547-2564 (2018).
  15. Ballesteros, A., Swartz, K. J. Dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60769(2020).
  16. Weigert, R. Imaging the dynamics of endocytosis in live mammalian tissues. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (4), 017012(2014).
  17. Chen, L., et al. A novel method to image macropinocytosis in vivo. Frontiers in Neuroscience. 12, 324(2018).
  18. King, N. P., et al. Soluble NSF attachment protein receptor molecular mimicry by a Legionella pneumophila Dot/Icm effector. Cellular Microbiology. 17 (6), 767-784 (2015).
  19. Condon, N. D., et al. Macropinosome formation by tent pole ruffling in macrophages. Journal of Cell Biology. 217 (11), 3873-3885 (2018).
  20. Lemmon, M. A. Pleckstrin homology (PH) domains and phosphoinositides. Biochemical Society Symposium. 74, 81-93 (2007).
  21. Gillooly, D. J., et al. Localization of phosphatidylinositol 3-phosphate in yeast and mammalian cells. EMBO Journal. 19 (17), 4577-4588 (2000).
  22. Mayle, K. M., Le, A. M., Kamei, D. T. The intracellular trafficking pathway of transferrin. Biochimica et Biophysica Acta. 1820 (3), 264-281 (2012).
  23. Hacker, U., Albrecht, R., Maniak, M. Fluid-phase uptake by macropinocytosis in Dictyostelium. Journal of Cell Science. 110, Pt 2 105-112 (1997).
  24. Wall, A. A., et al. Small GTPase Rab8a-recruited Phosphatidylinositol 3-Kinase gamma regulates signaling and cytokine outputs from endosomal toll-like receptors. Journal of Biological Chemistry. 292 (11), 4411-4422 (2017).
  25. Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
  26. Swanson, J. A., Yoshida, S. Macropinosomes as units of signal transduction. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1765), 20180157(2019).
  27. Schnatwinkel, C., et al. The Rab5 effector Rabankyrin-5 regulates and coordinates different endocytic mechanisms. PLoS Biology. 2 (9), 261(2004).
  28. Yeo, J. C., Wall, A. A., Luo, L., Stow, J. L. Sequential recruitment of Rab GTPases during early stages of phagocytosis. Cellular Logistics. 6 (1), 1140615(2016).
  29. Racoosin, E. L., Swanson, J. A. Macropinosome maturation and fusion with tubular lysosomes in macrophages. Journal of Cell Biology. 121 (5), 1011-1020 (1993).
  30. Dolat, L., Spiliotis, E. T. Septins promote macropinosome maturation and traffic to the lysosome by facilitating membrane fusion. Journal of Cell Biology. 214 (5), 517-527 (2016).
  31. Kuhn, S., Lopez-Montero, N., Chang, Y. Y., Sartori-Rupp, A., Enninga, J. Imaging macropinosomes during Shigella infections. Methods. , 12-22 (2017).
  32. Kommnick, C., Lepper, A., Hensel, M. Correlative light and scanning electron microscopy (CLSEM) for analysis of bacterial infection of polarized epithelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 17079(2019).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Live fluorescence imagingmacropinosoomvormingfluorescent dextranopname uit de vloeistoffasecorrelatieve licht elektronenmicroscopiemembraaneiwitlabelingendocytische routes
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen