Het meten van de tijdsevolutie van materialen op nanoschaal met stop-flow en small-angle neutronenverstrooiing

Summary

Dit protocol presenteert het gebruik van een gestopte stroommonsteromgeving om snel meerdere vloeibare oplossingen in situ te mengen tijdens een neutronenverstrooiingsmeting met een kleine hoek en om kinetische processen te bestuderen op nanometerlengteschalen en tweede tijdschalen.

Abstract

Dit artikel presenteert het gebruik van een sans-monsteromgeving (Stopped-Flow Small-Angle Neutron-Scattering) om snel vloeistofmonsters te mengen en kinetische processen op nanoschaal te bestuderen op tijdschalen van seconden tot minuten. De stop-flow monsteromgeving maakt gebruik van in de handel verkrijgbare spuitpompen om de gewenste volumes vloeistofmonsters te mengen die vervolgens door een dynamische mixer in een kwartsglascel in ongeveer 1 s worden geïnjecteerd. Tijd-opgeloste SANS-gegevensverzameling wordt gesynchroniseerd met het mengen van monsters om de evolutie van de nanostructuur in oplossing na het mengen te volgen.

Om de neutronenbundeltijd zo efficiënt mogelijk te benutten, gebruiken we een reeks stroomkeuzekleppen om de cel tussen de metingen automatisch te laden, te spoelen en te drogen, waardoor herhaalde gegevensverzameling mogelijk is gedurende meerdere monsterinjecties. Monsterinjecties worden herhaald totdat voldoende neutronenverstrooiingsstatistieken zijn verzameld. De mengopstelling kan worden geprogrammeerd om de omstandigheden systematisch te variëren om de kinetiek te meten bij verschillende mengverhoudingen, monsterconcentraties, additiefconcentraties en temperaturen. Het minimaal benodigde monstervolume per injectie is ongeveer 150 μl, afhankelijk van de padlengte van de kwartscel.

Representatieve resultaten met behulp van deze gestopte stroommonsteromgeving worden gepresenteerd voor snelle lipide-uitwisselingskinetiek in aanwezigheid van een additief, cyclodextrine. De blaasjes wisselen buitenste deelblad (buitenste) lipiden uit in de orde van seconden en wisselen zowel binnen- als buitenlipiden binnen enkele uren volledig uit. Het meten van lipide-uitwisselingskinetiek vereist in situ mengen om de snellere (seconden) en langzamere (minuten) processen vast te leggen en de kinetische snelheidsconstanten te extraheren. Dezelfde monsteromgeving kan ook worden gebruikt om moleculaire uitwisseling in andere soorten vloeibare monsters te onderzoeken, zoals lipide nanodeeltjes, eiwitten, oppervlakteactieve stoffen, polymeren, emulsies of anorganische nanodeeltjes. Het meten van de structurele transformaties op nanoschaal en de kinetiek van uitwisselende of reagerende systemen zal nieuwe inzichten opleveren in processen die op nanoschaal evolueren.

Introduction

Small-angle neutron scattering (SANS) biedt een unieke manier om de groottes, vormen, interacties en organisatie van verschillende materialen te meten op lengteschalen van ≈1 nm tot ≈100 nm ^1,2,3. Recente instrumenten, waaronder VSANS (very small-angle neutron scattering) instrumenten met focusspiegels, verleggen de grenzen naar het meten van nog grotere lengteschalen tot ≈1000 nm ^4,5. Over het algemeen biedt het unieke verstrooiingscontrast dat inherent is aan neutronenverstrooiingsmethoden verschillende voordelen bij het meten van de tijdsevolutie van nanoschaalstructuren, zoals de aggregatie van componenten in farmaceutische formuleringen⁶, crosslinking en gelatiereacties in polymeersystemen^7,8, bij mesokristallisatie van membraaneiwitten ^9,10, afbraak en ontvouwing van eiwitten^11,12 , en groei van op silica gebaseerde materialen^13,14,15. Het unieke verstrooiingscontrast maakt tijd-opgeloste SANS (TR-SANS) een nuttige aanvulling op andere op stop-flow gebaseerde metingen.

Stop-flow mengmethoden worden vaak geïmplementeerd in small-angle X-ray scattering (SAXS)16,17,18,19,20,21, fluorescentiespectroscopie 22,23,24,25,26 en lichtverstrooiing^{27,28,29,30, 31,32} experimenten om kinetische processen op de milliseconde tijdschalen te bestuderen. Een belangrijk verschil tussen SANS en SAXS is dat neutronenverstrooiing een niet-destructieve karakteriseringstechniek is, en als zodanig kan SANS worden gebruikt om hetzelfde monster uren of zelfs dagen te meten zonder ioniserende stralingsschade aan het monster, wat kan gebeuren tijdens röntgenverstrooiingsexperimenten met een hogere flux³³. Omdat herhaalde SANS-metingen de chemische structuur van het sondemolecuul of monster niet zullen veranderen, kan de tijdsevolutie worden bestudeerd zonder effecten van bijvoorbeeld fotobleaching, wat kinetische metingen kan bemoeilijken die afhankelijk zijn van fluorescentie^23,24. Bovendien kan SANS worden gebruikt om sterk geconcentreerde en optisch ondoorzichtige monsters te meten die vaak moeilijk te karakteriseren zijn met op licht gebaseerde technieken zoals dynamische lichtverstrooiing.

Naast het verstrekken van structurele informatie op nanoschaal, kan SANS worden gebruikt om de lokale samenstelling van deze structuren te onderzoeken door de variatie in neutronenverstrooiingslengtedichtheidscontrast. De verstrooiingslengtedichtheid (SLD) van verschillende elementen varieert willekeurig over het periodiek systeem en varieert met verschillende isotopen van hetzelfde element. Een vaak gebruikt voorbeeld is waterstof (¹H of H) en deuterium (²H of D), die enorm verschillende neutronenverstrooiingslengtes hebben. Daarom kunnen waterstofrijke materialen, zoals oppervlakteactieve stoffen, lipiden, eiwitten, RNA, DNA en andere polymeren, worden onderscheiden van gedeutereerde oplosmiddelen met behulp van SANS zonder de fysische eigenschappen van het systeem aanzienlijk te veranderen. Het is echter belangrijk op te merken dat H/D-uitwisseling de dichtheid, waterstofbinding en faseovergangstemperaturen in het monster kan beïnvloeden. Niettemin is de unieke gevoeligheid van SANS voor waterstofrijke materialen vooral nuttig in onderzoek naar zachte materie, waar de monsters van belang een lager verstrooiingscontrast en signaal hebben in op röntgenstraling gebaseerde technieken zoals SAXS. Isotopische substitutie maakt SANS ook een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van moleculaire uitwisselingskinetiek in waterstofrijke materialen door eenvoudigweg H-gelabelde en D-gelabelde moleculen te mengen. Isotopische substitutie is vooral nuttig in systemen waar omvangrijke fluorescerende kleurstoffen groter zijn dan de oppervlakteactieve of lipidemoleculen van belang en kan de uitwisselingskinetiek beïnvloeden^34,35.

Tijd-opgeloste SANS-metingen zijn voordelig omdat de gemeten intensiteit een functie is van tijd, lengteschaal en SLD-contrast. Als zodanig kunnen TR-SANS-experimenten worden ontworpen om de tijdsafhankelijke veranderingen in de ruimtelijke verdelingen en de samenstelling van de monsters te onderzoeken. Deze unieke voordelen van SANS hebben geleid tot belangrijke inzichten in kinetische processen in veel zachte materiaalsystemen zoals oppervlakteactieve stoffen 36,37,38, emulsies 39,40,41, lipiden 34,42,43,44,45,46,47,48,49 ^,50, en polymeren 51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62. De meeste TR-SANS-studies hebben zich gericht op tijdschalen van minuten tot uren. Veel kinetische processen van belang vinden echter plaats op de tweede tijdschaal en zijn essentieel voor het begrijpen van de onderliggende mechanismen. Het vastleggen van deze vroege tijdstippen vereist dat de oplossingen snel worden gemengd en in situ worden gemeten, waarbij het mengen wordt gesynchroniseerd met gegevensverzameling tijdens gestopte lichtverstrooiing van 27,28,29,30,31,32, fluorescentie ^{22,23,24,25,26} en röntgenstraling 16,17,18,19,20,21 experimenten. Dit werk beschrijft het gebruik van een monsteromgeving die is ontworpen om snel meerdere vloeistofmonsters te mengen en het mengsel in een kwartsglascel te injecteren voor TR-SANS-metingen. Het mengapparaat is een aanpassing van het recent ontwikkelde capillaire rheoSANS-apparaat⁶³ en maakt gebruik van meerdere spuitpompen en kleppen om het mengen van monsters te regelen en de celreiniging te automatiseren. Door spuitpompen aan te sluiten op een reeks stroomkeuzekleppen, kunnen meerdere inlaatstromen herhaaldelijk worden gemengd, gemeten, gespoeld en gedroogd om TR-SANS-metingen op de secondentijdschaal te vergemakkelijken.

De huidige procedure gaat ervan uit dat de monsters van belang zijn geïdentificeerd en voorbereid. We richten ons op de in situ mengopstelling en methoden om TR-SANS-gegevens te verzamelen. Neutronenverstrooiingsgegevens werden verzameld op het VSANS-instrument in het NIST Center for Neutron Research (NCNR); de procedure moet echter van toepassing zijn op andere SANS-instrumenten. Lezers die geïnteresseerd zijn in het implementeren van vergelijkbare protocollen op andere SANS-instrumenten, moeten de lokale instrumentwetenschappers raadplegen om de optimale instrumentconfiguratie te bepalen om de neutronenflux te maximaliseren op de gewenste lengteschaal en tijdschaal die het meest relevant zijn voor de kinetische processen van belang. De hier gepresenteerde gegevens werden verzameld met behulp van de high flux 'white beam'-configuratie op VSANS om het aantal neutronen te maximaliseren bij het verlies van ruimtelijke resolutie⁵. De detectorwagens werden gepositioneerd om een reeks verstrooiingsvectoren (q), 0,005 Å-1 < q < 0,5 ^Å-1 te bestrijken, overeenkomend met lengteschalen van ≈130 nm tot ≈13 nm. De verstrooiingsvector wordt gedefinieerd als q = 4π/λ sin (θ/2) waarbij λ de neutronengolflengte is en θ de verstrooiingshoek.

Het stop-flow mengapparaat dat wordt gebruikt voor de TR-SANS-metingen bestaat uit meerdere pompen, spoelspuiten, monsterspuiten, stroomkeuzeschakelaars, evenals een dynamische mixer, monstercel en gemengde monstercontainer, zoals weergegeven in figuur 1. Alle afgedichte vloeistofpaden bevinden zich in een behuizing met airconditioning, die de spuiten, kleppen, verbindingsbuizen, dynamische mixer en monstercellen omvat. Een programmeerbare thermo-elektrische airconditioner wordt gebruikt om de temperatuur van de behuizing te regelen in het bereik van 10 °C tot 50 °C binnen ±1 °C. Merk op dat een deel van de isolatie van de behuizing is verwijderd om de werkende delen van het apparaat te laten zien. De behuizing van het hoofdmengapparaat bevindt zich op een translatiefase op de NG3 VSANS-bundellijn bij de NCNR. De positie van de behuizing wordt aangepast met behulp van de translatiefase om de monstercel in het pad van de neutronenbundel te plaatsen (gele stippellijn).

Figuur 1: Een voorbeeldopstelling voor het combineren van stop-flow menging en kleinhoek neutronenverstrooiingsmetingen aan de VSANS-bundellijn in het NIST Center for Neutron Research. De opstelling bevat vier spuitpompen, twee spuiten voor het spoelen van oplosmiddelen en twee spuiten voor monsterinjectie, vier pompkeuzekleppen, twee mixerkeuzekleppen, een dynamische mixer, een doorstroomkwartscel en een gemengde monstercontainer. Invallende neutronen verstrooien het gemengde monster dat zich in de monstercel bevindt. Een geïsoleerde behuizing met kwartsvensters en een thermo-elektrische airconditioning wordt gebruikt om het monster en alle apparatuur op een constante temperatuur te regelen. De gele stippellijn toont het neutronenbundelpad. Schaalbalk = 10 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het apparaat in figuur 1 is geconfigureerd met twee monsterspuiten, twee spoelspuiten en één monstercel. Overeenkomstige stroomdiagrammen voor de verschillende stappen van het protocol worden geïllustreerd in figuur 2. De gewenste volumes van de twee verschillende monsters worden in de menger en de monstercel geïnjecteerd (figuur 2A). Zodra de monstercel is gevuld, worden de inlaatschakelaarklep (ISV) en de uitlaatschakelaarklep (OSV) gesloten om de monstercel te isoleren van de dynamische mixer en om te voorkomen dat het monster tijdens het verzamelen van TR-SANS-gegevens in de cel wordt teruggevoerd (figuur 2B). Vóór de dynamische mixer varieert de aansluitbuis in lengte van 10 cm tot 1 m en heeft deze geen invloed op de mengvertragingstijd. Buisverbindingen tussen de dynamische menger en de monstercel hebben echter invloed op de mengvertragingstijd en het vereiste monsterinjectievolume. Voorgesneden roestvrijstalen buizen met een binnendiameter van 0,04 inch (1 mm) en een lengte van 100 mm worden gebruikt om de dynamische mixer, de mixerkeuzekleppen (MSV1 en MSV2) en de ISV en OSV aan te sluiten. Gefluoreerde buizen met een binnendiameter van 1 mm en een lengte van 115 mm worden gebruikt om de ISV en OSV (of de dynamische mixeruitlaat) op de monstercel aan te sluiten. Het totale leegtevolume dat de mengvertragingstijd beïnvloedt, omvat het vacuülevolume van de menger (0,15 ml), de slang tussen de mixeruitlaat en de inlaat van de monstercel (0,09 ml) en het volume van de monstercel (0,16 ml). In dit voorbeeld is het totale leegtevolume 0,4 ml. De interne leegtevolumes van kleppen zijn verwaarloosbaar in vergelijking met de volumes van slangen, mixer en monstercellen. De gebruikte lagedrukkeuzekleppen (boringsdiameter van 0,75 mm) bevatten bijvoorbeeld geschatte leegtevolumes van 4 μl, terwijl de hogedrukkeuzekleppen en schakelkleppen (boringsdiameter van 0,25 mm) ongeveer lege volumes van 0,5 μl bevatten.

Nadat de TR-SANS-meting is voltooid, wordt het monster met oplosmiddel uit de cel geduwd en wordt het spoeloplosmiddel herhaaldelijk door de cel gepompt om het resterende monster te verwijderen en de monstercel te reinigen (figuur 2C). Merk op dat de spoelspuiten zijn aangesloten op grotere oplosmiddelreservoirs (bijv. Water en ethanol) via pompkeuzewaarden om ervoor te zorgen dat er voldoende oplosmiddelvolumes beschikbaar zijn om de monstercel tussen meetruns te reinigen. Oplosmiddelbronnen, monsterbronnen en gemengde monstercontainers die ontvlambare vloeistoffen bevatten, worden in een aparte behuizing zonder elektrische apparatuur geplaatst om alle mogelijke ontstekingsbronnen te elimineren. Bovendien worden dampsluitende flessendoppen gebruikt om brandbare dampen en oplosmiddelverdamping te minimaliseren. Ten slotte wordt de monstercel gedroogd met een stikstofgasstroom om het resterende spoeloplosmiddel te verwijderen (figuur 2D). De inlaatstikstofgasdruk naar de mixerkeuzeklep wordt geregeld tot ongeveer 2 bar (0,2 MPa, manometerdruk) met behulp van een handmatige drukregelaar op de stikstofgasfles. Zodra de monstercel voldoende is gereinigd en gedroogd, wordt een nieuw gemengd monster in de monstercel geïnjecteerd voor de volgende meetcyclus (waarbij het mengen en injecteren wordt herhaald zoals geïllustreerd in het stroomdiagram in figuur 2A).

Figuur 2: Voorbeeldstroomdiagram met één monstercel, twee mengmonsters en twee spoelmiddelen voor reiniging . (A) Mengen van monster A (blauw) en monster B (rood) en vervolgens het gemengde monster (paars) in de monstercel laten stromen. B) Tijdens het verzamelen van gegevens geeft de stop-flow-inrichting aan waar de ISV- en OSV-schakelkleppen gesloten zijn om de monstercel te isoleren en terugdiffusie van het monster tijdens het verzamelen van gegevens te voorkomen. (C) De reinigingsstappen waarbij de monstercel na gegevensverzameling wordt gespoeld met spoelmiddel uit SS1 (groen). D) Droogstap waarbij de monstercel wordt gedroogd met stikstofgas (oranje). Afkortingen: PSV = pompkeuzeklep; MSV = mixerkeuzeklep; OSV = uitlaatschakelaarklep; ISV = inlaatschakelaarklep; SS1 = oplosmiddelbron 1; SSA = monsterbron A; N2 = stikstofgasbron. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3 toont stroomschema's voor een iets andere versie waarin de mengopstelling is geconfigureerd met twee afzonderlijke monstercellen die op dezelfde schakelkleppen zijn aangesloten (figuur 3A). Terwijl TR-SANS-gegevens worden verzameld in monstercel 1, wordt monstercel 2 gespoeld (figuur 3B) en gedroogd (figuur 3C). Wanneer de gegevensverzameling voor monstercel 1 is voltooid, leidt de inlaatschakelaarklep een nieuw gemengd monster naar monstercel 2 voor gegevensverzameling (figuur 3D). Terwijl TR-SANS-gegevens worden verzameld in monstercel 2, wordt monstercel 1 gespoeld en gedroogd (figuur 3E). Dit alternatieve, parallelle proces tussen twee monstercellen minimaliseert de tijd tussen volgende monsterinjecties en maximaliseert het gebruik van neutronenbundeltijd.

Figuur 3: Voorbeeld stroomdiagram met behulp van cellen met twee monsters, twee mengmonsters en twee spoelmiddelen voor reiniging. A) Meng monster A (blauw) en monster B (rood) en laat het gemengde monster (paars) vervolgens in monstercel 1 stromen. B) De toestand van de stop-flow inrichting tijdens het verzamelen van gegevens op monstercel 1, terwijl monstercel 2 wordt gespoeld met oplosmiddel uit SS1 (groen). (C) De toestand van de gestopte stroominrichting tijdens het verzamelen van gegevens op monstercel 1 terwijl monstercel 2 wordt gedroogd met stikstofgas (oranje). D) Zodra de gegevensverzameling van monstercel 1 is voltooid, wordt onmiddellijk een nieuw monster (paars) gemengd en in monstercel 2 gestroomd. (E) De toestand van de stop-flow inrichting tijdens het verzamelen van gegevens op monstercel 2 terwijl monstercel 1 wordt gespoeld met oplosmiddel uit SS1 (groen). Terwijl de ene monstercel wordt gemeten, wordt de andere monstercel gereinigd en gedroogd. Het stop-flow meetproces wisselt af tussen twee monstercellen om de tijd tussen volgende monstermenginjecties te minimaliseren. Afkortingen: PSV = pompkeuzeklep; MSV = mixerkeuzeklep; OSV = uitlaatschakelaarklep; ISV = inlaatschakelaarklep; SS1 = oplosmiddelbron 1; SSA = monsterbron A; N2 = stikstofgasbron. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hieronder wordt een stapsgewijs protocol beschreven voor het aansluiten van de pompen en leidingen, het primen van het systeem, het spoelen en drogen van de monstercel en het injecteren van het gemengde monster. Hoewel de eencellige configuratie voor eenvoud wordt gedemonstreerd (figuur 2), kunnen de flexibele modulaire opstelling, het protocol en de scripts eenvoudig worden gewijzigd om meer spuitpompen, kleppen, mixers of monstercelconfiguraties te implementeren, zoals de configuratie met twee monstercellen in figuur 3. Representatieve gegevens over de snelheid van het aantal ruwe neutronen die tijdens meng- en reinigingsinjectiecycli zijn verzameld, worden weergegeven in figuur 4, terwijl de lipidenuitwisselingskinetiek gemeten bij 3 verschillende temperaturen en de geëxtraheerde genormaliseerde verspreide intensiteit die overeenkomt met de fractie van uitgewisselde lipiden worden weergegeven in respectievelijk figuur 5 en figuur 6.

Protocol

1. Stel het stop-flow systeem in en start het.

1. Schakel alle voedingen van de pomp en dynamische mixers in met behulp van de aan / uit-schakelaar.
2. Start alle pompen en kleppen in de grafische gebruikersinterface (GUI) van het stopped-flow system control door het configuratiepad van het apparaat in te voeren en de opdrachten bus=qmixbus te gebruiken. Bus(), bus.open(), bus.start(), pump=qmixpump. Pump(), pump.enable(), en valve=ViciMultiposSelector() (zie voorbeeld initiatiecode beschikbaar in een online open-source repository⁶⁴).
3. Kalibreer de pompen voordat u spuiten bevestigt met het commando pump.calibrate().
4. Controleer of de kleppen zijn gestart en ga op commando naar de juiste keuzepoort met de opdracht valve.setPort() en valve.getPort().
5. Wijs het type spuit toe dat voor elke pomp moet worden gebruikt met behulp van het commando pump.set_syringe_param(A, B), waarbij A de binnendiameter van de spuitkop (mm) is en B de maximale zuigerslagafstand van de spuit (mm).
6. Sluit de monsterspuiten aan op de spuitpompen.
   1. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de pompen zijn gekalibreerd, schroeft u schone spuitvaten in op de aansluiting aan de bovenkant van de pomp (spuitbevestigingskop).
   2. Wanneer u glazen spuiten gebruikt, moet u ervoor zorgen dat de kop van de spuitbevestiging wordt losgemaakt voordat u het vulvolume doseert, zodat de glazen spuit niet breekt als gevolg van overmatige kracht van de zuiger van de spuit.
   3. Schroef de zuiger van de spuit vast aan de aansluiting aan de onderkant van de pomp (spuitbevestigingstaart).
   4. Nadat de cilinder van de spuit en de zuiger van de spuit op de pomp zijn aangesloten, doseert u het vulvolume van het type spuit met behulp van de opdracht pump.empty(), die de zuiger van de spuit naar de bovenkant van de spuitloop verplaatst.
   5. Wanneer u glazen spuiten gebruikt, draait u de kop van de spuitbevestiging vast nadat de zuigerbeweging is gestopt.
7. Sluit de slang aan op de monster- en oplosmiddelbronnen, spuiten, kleppen, mixers, monstercellen en gemengde monstercontainer.
   1. Sluit de spuitpompslang aan op de pompkeuzekleppen.
   2. Sluit de pompkeuzeklepslang aan op de monsterbronnen.
   3. Sluit de pompkeuzeklepslang aan op de spoelmiddelbronnen.
   4. Sluit de pompkeuzeklepslang aan op de mixerkeuzeklepslang.
   5. Sluit de mengerkeuzeklepslang aan op de stikstofgasbron.
   6. Sluit de mixerkeuzeklepslang aan op de mixerinlaten.
   7. Sluit de mengkraan aan op de inlaatschakelaar.
   8. Sluit de inlaatschakelaarklep aan op de inlaat van de monstercel.
   9. Sluit de monsterceluitlaat aan op de uitlaatschakelaarklep.
   10. Sluit de uitlaatschakelaarklep aan op de gemengde monstercontainer.
8. Definieer alle buis- en klepverbindingen (stap 1.7) in de besturings-GUI van het stop-flow systeem door het overeenkomstige poortnummer in te voeren dat op elke klep is gemaakt (zie voorbeeldbesturingscode in de online open-source repository⁶⁴).
9. Bereken het lege volume van de slang tussen de inlaat van de menger en de uitlaat van de monstercel, die de minimale hoeveelheid monster definieert die nodig is om de monstercel voor elke meting te vullen.

2. Laad het monster.

1. Stel het gewenste monstervulvolume en oplosmiddelvulvolume in de GUI voor de besturing van het stopped-flow systeem in door de gewenste getallen te typen (zie voorbeeldbesturingscode in de online open-source repository⁶⁴).
2. Gebruik de opdracht pump.aspirate() om de gewenste monster- en oplosmiddelvolumes van hun bronnen via de pompkeuzekleppen in de monsterspuiten te trekken (aspirateren).
   OPMERKING: Wanneer u een lege spuit voor het eerst laadt, is er lucht aanwezig aan de bovenkant van de spuit die moet worden gespoeld om het systeem in stap 3 voor te bereiden met monster en oplosmiddel.

3. Bereid het systeem voor.

1. Gebruik de opdracht pump.dispense() om alle lucht uit spuiten, slangenleidingen en kleppen naar buiten te duwen (af te geven). Zorg ervoor dat er voldoende vloeistofvolume uit elke spuit wordt afgegeven om alle lucht volledig uit de spuiten, slangen en kleppen te verwijderen. Als er luchtbellen zichtbaar zijn in een buis, ga dan door met het doseren van oplosmiddel of monster totdat de bellen zijn verwijderd.
2. Zodra de lucht uit het systeem is gespoeld, voert u ten minste één monsterinjectie- en spoelprocedure uit (zonder dat neutronenverstrooiingsgegevens worden verzameld).
   1. Klik om de cel met het label Mengexperiment starten in de besturings-GUI te selecteren.
   2. Terwijl deze cel actief is geselecteerd, klikt u op de knop Uitvoeren (rechterdriehoek) boven aan de besturings-GUI of drukt u op de shift - en entertoetsen samen op het toetsenbord.
   3. Inspecteer de monstercel visueel om te bevestigen dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
      1. Als er luchtbellen aanwezig zijn, herhaalt u protocolstappen 3.1 en 3.2 om eventuele lucht verder uit de leidingen te verwijderen.
      2. Als er geen luchtbellen aanwezig zijn in de monstercel, gaat u verder met stap 4 om de resterende stappen van het experimentprotocol te definiëren.

4. Definieer het stopped-flow mixprotocol in het programmascript (zie codevoorbeeld in de online open-source repository⁶⁴).

1. Voer het temperatuurinstelpunt in van de programmeerbare airconditioner (AC) die de temperatuur van de geïsoleerde behuizing rond het stop-flow apparaat regelt.
   1. Terwijl u de sterknop op de AC-besturingseenheid ingedrukt houdt, drukt u op de pijlen omhoog en omlaag om de instelpunttemperatuur te wijzigen. U kunt ook het gewenste temperatuurinstelpunt in de besturings-GUI typen en op Uitvoeren klikken.
   2. Wacht 15-30 minuten om de binnenkant van de behuizing op de gewenste temperatuur te laten balanceren voordat u met de kinetische experimenten begint.
      OPMERKING: Het toegankelijke temperatuurbereik ligt momenteel tussen 10 °C en 50 °C en de temperatuurstabiliteit is ± 1 °C.
2. Voer alle spoelvolgordestappen in door de juiste volumes, stroomsnelheden, tijden en het aantal herhalingen in de besturings-GUI in te voeren.
   1. Definieer het volume van elk te injecteren monster, dat het totale debiet (Q) definieert.
   2. Bepaal het volume van elk oplosmiddel dat tijdens de spoelprocedure moet worden geïnjecteerd.
   3. Bepaal de droogtijd tussen elke spoelsubstap (t_droog).
   4. Definieer het aantal spoelsubstappen.
   5. Definieer de verschillende oplosmiddelen voor de volgende spoelstappen.
   6. Definieer het aantal spoelherhalingen dat na elke meting moet worden uitgevoerd (n_spoeling).
   7. Bepaal de tijd die nodig is om de monstercel en de mixer volledig te drogen, zodat u een schone monstercel krijgt voor de daaropvolgende monsterinjectie (t_{dry_final}).
3. Definieer alle stappen voor de monsterinjectievolgorde door de juiste volumes, stroomsnelheden en tijden in de besturings-GUI van het stopped-flow systeem te typen.
   1. Definieer het volume van elk te injecteren monster en het debiet.
   2. Bereken de vertragingstijd (t vertraging) van het leegtevolume (V-leegte) en het totale debiet (_t-vertraging =_V-leegte/Q).
      OPMERKING: De vertragingstijd is de tijd die nodig is om de monstercel met het gemengde monster te vullen.
   3. Definieer de gewenste acquisitietijd voor de TR-SANS-gegevens, zodat het volledige kinetische proces van belang heeft plaatsgevonden (t_scatt).
   4. Stel de wachttijd in tussen het einde van het verstrooiingsexperiment en het begin van de spoelcycli (t_wait).
      OPMERKING: Deze wachttijd moet ten minste 100 s bedragen als de neutronentransmissie van het monster moet worden gemeten voordat deze uit de cel wordt gespoeld. De monsteroverdracht is nodig tijdens de gegevensverwerking om de gegevens tot absolute intensiteit te reduceren.
   5. Definieer het aantal injectiecycli dat moet worden uitgevoerd met spoelsequenties tussen elke injectie die zijn gedefinieerd in stap 4.2 (_n-cyclus).
4. Bereken de totale tijd van een enkele gestopte gegevensverzamelingscyclus (_t-cyclus) met behulp van vergelijking (1).
   t_cyclus = n_spoel × (t vertraging + t_droog) + t_{dry_final} + t_vertraging + t_scatt (1)
   waarbij n_spoeling = aantal spoelherhalingen (stap 4.2.6); _{t vertraging} = vertragingstijd van de gestopte stroomvoorziening (stap 4.3.2); t_droog = droogtijd tussen elke spoelsubstap (stap 4.2.3); _{t dry_final} = tijd om de monstercel en de menger volledig te drogen (stap 4.2.7); t_scatt = gewenste TR-SANS data-acquisitietijd (stap 4.3.3)

5. Definieer de neutronenverstrooiingsparameters met een kleine hoek in de GUI van de SANS-instrumentbesturing.

1. Bepaal de lengteschalen en het q-bereik van belang voor elk monster.
2. Definieer de instrumentconfiguratie om het gewenste q-bereik van belang te dekken, terwijl de neutronenflux bij het monster wordt gemaximaliseerd.
3. Stel de totale VSANS-gegevensacquisitietijd in de GUI van het SANS-instrumentbesturingselement in op de berekende cyclustijd in stap 4.4 (neutronenverstrooiingsgegevensacquisitietijd =_t-cyclus).
4. Stel de meettijd voor monsteroverdracht in op 100 s in de GUI voor SANS-instrumentbesturing.
5. Schakel met de GUI van het SANS-instrumentbesturingselement het verzamelen van gegevens in de gebeurtenismodus in door GenerateEventModeData true op de opdrachtregel te typen.

6. Verzamel standaard verstrooiingsmetingen voor gegevensreductie voordat u begint met het experiment met gestopte stroom om de TR-SANS-gegevens te verwerken.

1. Meet de achtergrondverstrooiing.
   1. Zorg ervoor dat de sluiter van het lokale instrument gesloten is.
   2. Bevestig het monster met geblokkeerde bundel aan de achterkant van de monsteropening, bevestig de lokale instrumentomgeving en open de sluiter van het lokale instrument.
   3. Definieer de data-acquisitietijd van geblokkeerde bundelverstrooiing in de software en verzamel geblokkeerde bundelverstrooiingsgegevens, die voor dezelfde duur tellen als de langste verstrooiingsgegevensacquisitietijd (_t-scatt).
   4. Zodra de gegevensverzameling is voltooid, sluit u de sluiter van het instrument en verwijdert u het geblokkeerde bundelmonster uit de monsteropening.
2. Meet de verstrooiing van de lege cellen.
   1. Zorg ervoor dat de monstercel grondig is gespoeld en gedroogd.
   2. Open de sluiter van het lokale instrument.
   3. Verzamel de meting van de lege celtransmissie gedurende 100 s.
   4. Verzamel de lege celverstrooiingsmeting en tel mee voor ten minste de langste acquisitietijd (_t-scatt).

7. Begin met het experiment met gestopte stroom.

1. Start het verzamelen van VSANS-verstrooiingsgegevens in de gebeurtenismodus .
   1. Zorg ervoor dat het lokale instrumentgebied veilig is en open vervolgens de sluiter van de lokale instrumentenbundel.
   2. Begin met het verzamelen van SANS-gegevens met behulp van de SANS-instrumentbesturingssoftware op de instrumentcomputer door de gewenste runs naar de instrumentwachtrij te slepen en neer te zetten.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat de vroegste tijdspunten worden gemeten, begint u met het verzamelen van gegevens voordat u het experiment met het mengen van gestopte stromen start. De gegevens worden in een later stadium nabewerkt om rekening te houden met de vertragingstijd (_t-vertraging).
2. Start het experiment met het mengen van gestopte stromen in de besturings-GUI.
   1. Selecteer de notebookcel met het label Mengexperiment starten in de besturings-GUI van het stopped-flow systeem.
   2. Terwijl deze cel actief is geselecteerd, klikt u op de knop Uitvoeren (rechterdriehoek) boven aan het besturingsprogramma voor apparaten met gestopte stroom of drukt u op de toetsen Shift en Enter samen op het toetsenbord.
   3. Controleer of het in punt 4 gedefinieerde protocol voor het mengen van gestopte stromen in werking is getreden.
   4. Voeg de 100 s-transmissiemeting toe aan de VSANS-instrumentwachtrij na de verstrooiingsrun met behulp van de SANS-instrumentbesturings-GUI.
   5. Voeg één verstrooiingsmeetrun en één transmissiemeetrun toe aan de instrumentwachtrij voor elke resterende stop-flow mengcyclus (n_cyclus - 1, stap 4.3.5) in de SANS-instrumentbesturings-GUI.

8. Verwerk en verminder gegevens om alle achtergronden te verwijderen, corrigeer voor detectorgevoeligheid en corrigeer voor monsteroverdracht.

1. Download de verspreidingsgegevensbestanden en bijbehorende gebeurtenisbestanden van de server.
   OPMERKING: Na elke VSANS-meting worden afzonderlijke detectorgebeurtenisbestanden gegenereerd, één gebeurtenisbestand voor elke actieve detectorwagen (bijv. Voor-, Midden- en/of Achterdetector).
2. Zet de verstrooiingsgegevens in de gewenste tijdbins met de opdracht events=Rebin(bestandsnaam ) gevolgd door de opdracht events.do_rebinning(timebins), waarbij de invoerbestandsnaam overeenkomt met de naam van het gewenste SANS-gegevensbestand en timebins een lijst is met de gewenste tijdbingrenzen in seconden.
   OPMERKING: Als de invoertijdbins worden ingevoerd als een enkel nummer in plaats van een lijst, worden de gegevens in de binaire bestanden opgeslagen in het N-aantal bins met gelijke tijdbreedtes, waarbij N de invoertijdbins zijn (zie softwarescripts die worden geleverd door de beamline en beschikbare online open-source repository⁶⁴).
3. Verminder de verstrooiingsgegevens in de prullenbak met behulp van de software die de beamline⁶⁵ heeft geleverd.

9. Analyseer de TR-SANS-gegevens.

1. Bereken de procestijd van belang (_t-proces) uit de meettijden met behulp van vergelijking (2).
   _t-proces = t_i - t_stop + t_vertraging (2)
   Waarbij t_i de meettijdbakken zijn die beginnen nadat de stroom is gestopt, is t_stop de meettijd onmiddellijk wanneer de stroom wordt gestopt en t_vertraging de vertragingstijd.
2. Plot de q-afhankelijke intensiteit I(q) als functie van de procestijd met behulp van de tijdbakken die zijn gedefinieerd in stap 8.2 en het_t-proces berekend in stap 9.1.
   OPMERKING: De vroegst toegankelijke procestijd wordt beperkt door_t-vertraging. Als u eerdere procestijdpunten wilt meten, verhoogt u het totale debiet (Q) of verlaagt u het totale leegtevolume (_V-leegte).
3. Haal de kinetische parameters van belang uit de verandering in I(q) als functie van de procestijd.

10. Beëindig het experiment.

1. Schakel de neutronenbundel uit door de sluiter van het lokale instrument te sluiten.
2. Voer een stralingscontrole uit met behulp van een stralingsmonitor die door de bundellijn wordt geleverd voordat u onderdelen, slangen loskoppelt of monsters of gemengde monstercontainers lost.
3. Breng de spuiten, slangen en gemengde monstercontainer over naar de afdeling gezondheidsfysica.
4. Vul gezondheidsfysicaformulieren in en wacht op evaluatie door gezondheidsfysicapersoneel.

Results

De hier getoonde representatieve neutronengegevens meten de lipide-uitwisselingskinetiek in aanwezigheid van methyl-β-cyclodextrine (mβCD), een additief dat de lipide-uitwisseling tussen blaasjes katalyseert met de wisselkoers (k_e)^66,67. Eerdere fluorescentiestudies hebben aangetoond dat k_e afhankelijk is van de mβCD-concentratie en dat de halfwaardetijd van het uitwisselingsproces in de orde van grootte van^{minuut 68} ...

Discussion

De huidige procedure beschrijft het mengapparaat en de stappen voor het uitvoeren van TR-SANS-metingen met gestopt stroom. Het apparaat en protocol zijn geoptimaliseerd voor vloeistofmonsters met een lage viscositeit waarbij de relevante tijdschalen ≈1 s tot 5 minuten zijn. Voor tijdschalen van meer dan 5 minuten kan het handmatig mengen van de monsters en het laden ervan in standaard verstrooiingscellen gemakkelijker en wenselijk zijn, vooral voor monsters met een hoge viscositeit, gels of pasta's. Toegang tot tijdschal...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dynamische mixer	Analytische wetenschappelijke instrumenten	462-0150A	Magneetgekoppelde rotor, binaire dynamische mixer-assemblage (ternair type beschikbaar), 0,15 mL dood volume (groter dood volume beschikbaar)
Fluoropolymer buis	IDEX Health & Science	1507L	PFA-buis Natuurlijk 1/16 inch OD x 0,040 inch ID x 50 ft
Fluoropolymer 1/4-28 flensloten	IDEX Health & Science	XP-245	PFA flenslot met ferrules, 1/4-28 draad, 1/16 inch OD buis
Glazen spuiten	Hamilton Company	81660	Hamilton 1000-serie spuiten, 10 mL (81660), model 1010 C syring, 1/4"-28 draaduitgang, andere volumes beschikbaar
Hogedruk flow selector kleppen	Vici Valco	C85X-1570EUTB	Vici 10 positie selector kleppen, 15000 psi max, 0,25 mm boring, 1/16 inch OD buis, 10-32 kegeldraadpoorten, USB universele actuator
Hogedruk schakelkleppen	Vici Valco	C82X-1574EUHB	Vici 4 poort schakelkleppen, 15000 psi max, 0,25 mm boring, 1/16 inch OD buis, 10-32 kegeldraadpoorten, USB universele actuator
Hogedruk spuiten	Cetoni	A2019000358	3 mL roestvrijstalen spuit, 510 bar max, 21 mL/min max stroomsnelheid
Lagedruk flow selector kleppen	Vici Valco	C25-3180EUHB	Vici 10 positie selector kleppen, max 250 psi vloeistof, 0,75 mm boring, 1/16 inch OD buis, 1/4-28 draadpoorten, USB universele actuator
neMESYS hogedruk spuitpompen	Cetoni	A3921000103	Max kracht 2600 N
neMESYS middendruk spuitpompen	Cetoni	A3921000131	Max kracht 1000 N
Voeding	Cetoni	A3921000127	Basis 600, levert stroom voor maximaal 4 hogedrukpompen
Kwarts doorstromende monstercel	Starna Scientific	3-2.30-Q-1/TC	Kwarts micro flow cellen, 2 mm padlengte (1 mm beschikbaar), 2 mm bij 2 mm bij 30 mm interne afmetingen
Kwarts vensters	Technical Glass Products	NA	GE 124 Heldere gefuseerde kwarts geslepen en gepolijste platen, 11,75 inch bij 23,75 inch bij 0,375 inch dik
Roestvrijstalen 10-32 kegelcompressiefittingen	IDEX Health & Science	U-321X, U-320X	316 roestvrijstalen ferrule (U-321X) en moer (U-320X) - Valco type, 10-32 kegeldraad, voor 1/16 inch OD roestvrijstalen buis
Roestvrijstalen buis	IDEX Health & Science	U-102	Roestvrij staalbuis 1/16 inch OD x 0,020 inch ID, 10 cm, verschillende voorgesneden lengtes beschikbaar
Spuitpomp besturingssoftware	Cetoni	T6000000004	QmixElements software voor nemesys pompen, QmixSDK softwareontwikkelingskit
Thermo-elektrische airconditioner	EIC Solutions	AAC-140C-4XT-HC	Thermo-elektrische airconditioner gemonteerd op geïsoleerde behuizing om de pomp, klep, mixer en monstertemperatuur te regelen
T-sleufrailing	McMaster-Carr	47065T103	Aluminium t-sleufrailing (1,5 inch bij 1,5 inch) gesneden op verschillende lengtes
Verdampingsslot flesdoppen	Cole-Parmer	EW-12018-02	Vier 304 SS poort-inzetstukken, 1/4"-28 draad, GL45 flesdop grootte, PTFE lichaam, SS schroefdraad, PP kraag