Dit protocol beschrijft een efficiënte en reproduceerbare aanpak voor histologische studies van muizenhersenen, waaronder perfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Vrij zwevende immunostaining van muizenhersenen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Immunohistochemische kleuring van muizenhersenen is een routinetechniek die vaak wordt gebruikt in de neurowetenschappen om centrale mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de regulatie van het energiemetabolisme en andere neurobiologische processen. De kwaliteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de histologische resultaten van de hersenen kan echter variëren tussen laboratoria. Voor elk kleuringsexperiment is het noodzakelijk om de belangrijkste procedures te optimaliseren op basis van verschillen in soorten, weefsels, gerichte eiwitten en de werkomstandigheden van de reagentia. Dit artikel demonstreert een betrouwbare workflow in detail, inclusief intra-aortaperfusie, hersensectie, vrij zwevende immunostaining, weefselmontage en beeldvorming, die gemakkelijk kan worden gevolgd door onderzoekers op dit gebied.
Ook wordt besproken hoe deze procedures kunnen worden aangepast om aan de individuele behoeften van onderzoekers te voldoen. Om de betrouwbaarheid en efficiëntie van dit protocol te illustreren, werden perineuronale netten gekleurd met biotine-gelabelde Wisteria florbunda agglutinin (WFA) en arginine vasopressine (AVP) met een anti-AVP-antilichaam in de muizenhersenen. Ten slotte zijn de kritieke details voor de hele procedure behandeld en de voordelen van dit protocol ten opzichte van die van andere protocollen. Alles bij elkaar presenteert dit artikel een geoptimaliseerd protocol voor vrij zwevende immunostaining van hersenweefsel van muizen. Het volgen van dit protocol maakt dit proces gemakkelijker voor zowel junior als senior wetenschappers om de kwaliteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van immunostainingstudies te verbeteren.
Inleiding
De prevalentie van obesitas en bijbehorende comorbiditeiten heeft epidemische niveaus bereikt, wat een enorme sociaaleconomische last veroorzaakt1,2. Er zijn verschillende muismodellen ontwikkeld om de biologische processen die verantwoordelijk zijn voor obesitas beter te begrijpen3,4. Omdat centrale mechanismen belangrijk zijn voor de regulatie van energiehomeostase in deze diermodellen, zijn neuroanatomische studies van muizenhersenen een noodzakelijke techniek op dit gebied geworden. De kwaliteit, betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van histologi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
C57BL/6J muizen van beide geslachten (8-16 weken oud) werden gebruikt in de huidige studie. De verzorging van alle dieren en alle procedures werden goedgekeurd door de institutional animal care and use committees van Baylor College of Medicine.
1. Perfusie
OPMERKING: Stappen 1.1 - 1.6 worden uitgevoerd in een zuurkast.
- Anesthesie
- Giet 5 ml isofluraan (zie de tabel met materialen) op een papieren handdoek die op de bodem van een exsiccator is geplaatst. Breng de muis op de holte barrière in de exsiccator en wacht tot tekenen van ademhaling zijn verdwenen.
OPME....
- Giet 5 ml isofluraan (zie de tabel met materialen) op een papieren handdoek die op de bodem van een exsiccator is geplaatst. Breng de muis op de holte barrière in de exsiccator en wacht tot tekenen van ademhaling zijn verdwenen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het stroomschema van dit protocol wordt kort geïllustreerd in figuur 1. De cryosectieprocedure van dit laboratorium is aangetoond in figuur 2A, waarbij 5 hersenmonsters tegelijkertijd werden gesneden. De montage van hersensecties is weergegeven in figuur 2B en een volledig gemonteerde dia met hersensecties is geïllustreerd in figuur 2C. In figuur 3, representatieve fluoresc.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol biedt een gevestigde methode voor neuroanatomische studies van de muizenhersenen, waaronder perfusie, weefselsectie, vrij zwevende immunostaining, weefselopbouw en beeldvorming. Een paar belangrijke details die essentieel zijn voor consistente en betrouwbare resultaten moeten echter worden geoptimaliseerd.
De kwaliteit van de perfusie is van cruciaal belang voor een succesvolle kleuring. Kleuringsresultaten kunnen worden beïnvloed als er bloed in de hersenen achterblijft, aangezie.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
De onderzoekers werden ondersteund door subsidies van de NIH (K01DK119471 aan CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 en R01DK120858 tot YX), USDA/CRIS (51000-064-01S tot YX) en American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) tot LT.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Alexa Flour 594 ezel anti-konijn IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose opgelost in 100 mL PBS |
| Neutraal gebufferd Formaldehyde | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6,8-7,2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Cultuur Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Cultuur Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading montage media met DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclaveerbare plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antilichaam | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotector buffer | Gebruikersvoorkeur | Niet van toepassing | 20% glycerol, 30% ethyleenglycol en 50% PBS |
| Isofluraan | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscoop | Leica | Niet van toepassing | |
| Microscoop foliedozen (50-plaats) | VWR | Niet van toepassing | |
| PBT | Gebruikersvoorkeur | Niet van toepassing | 2,5 mL van Triton X-100 opgelost in 1000 mL PBS |
| Perfusie twee geautomatiseerde Perfusie System | Leica | 39471005 | |
| Fosfaat gebufferde saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7,3-7,5, 1x samenstelling: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,8 mM Fosfaat buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Natriumchloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0,9%, 25 °C, pH 7,4 |
| Streptavidine Proteïne, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antilichaam | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Niet van toepassing | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
Referenties
- Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
- Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The Am....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
