Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

Samenvatting

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen, targeting-, vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode voor in vivo, directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Samenvatting

In de afgelopen jaren is het duidelijk geworden dat ribosomen niet alleen ons mRNA decoderen, maar ook de opkomst van de polypeptideketen in de drukke cellulaire omgeving begeleiden. Ribosomen bieden het platform voor ruimtelijk en kinetisch gecontroleerde binding van membraan-targeting factoren, het modificeren van enzymen en het vouwen van chaperonnes. Zelfs de assemblage in oligomere complexen van hoge orde, evenals eiwit-eiwitnetwerkvormingsstappen, werden onlangs ontdekt om te worden gecoördineerd met synthese.

Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode die is ontwikkeld om co-translationele interacties in vivo vast te leggen. We zullen de verschillende affiniteitszuiveringsstappen beschrijven die nodig zijn voor het vastleggen van ribosoom-ontluikende ketencomplexen samen met co-translationele interactoren, evenals de mRNA-extractie, grootte-uitsluiting, reverse transcriptie, deep-sequencing en big-data-analysestappen, die nodig zijn om co-translationele interacties in bijna-codonresolutie te ontcijferen.

Inleiding

Selective Ribosome Profiling (SeRP) is tot op heden de enige methode die co-translationele interacties, in vivo, op een directe manier^vastlegt en karakteriseert 1,2,3,4,5,6. SeRP maakt globale profilering van interacties van elke factor mogelijk met het vertalen van ribosomen in bijna codonresolutie ^2,7.

De methode is gebaseerd op het flashvriezen van groeiende cellen en het behoud van actieve translatie. Cellysaten worden vervolgens behandeld met RNase I om al het mRNA in de cel te verteren, behalve ribosoom-beschermde mRNA-fragmenten die "ribosoomvoetafdrukken" worden genoemd. Het monster wordt vervolgens in twee delen gesplitst; een deel wordt direct gebruikt voor de isolatie van alle cellulaire ribosomale voetafdrukken, die alle lopende vertaling in de cel vertegenwoordigen. Het tweede deel wordt gebruikt voor de affiniteitszuivering van de specifieke subset van ribosomen geassocieerd met een factor van belang, bijvoorbeeld: het modificeren van enzymen, translocatiefactoren, vouw chaperonnes en complex-assemblage interacties. De affiniteitsgezuiverde ribosomale voetafdrukken worden gezamenlijk het interactoom genoemd. Vervolgens worden de ribosoombeveiligde mRNA's geëxtraheerd en gebruikt voor het genereren van cDNA-bibliotheken, gevolgd door diepe sequencing.

Vergelijkende analyse van de totale translatoom- en interactoommonsters maakt het mogelijk om alle orfs te identificeren die verband houden met de factor van belang, evenals karakterisering van elk orf-interactieprofiel. Dit profiel rapporteert de precieze betrokkenheids- en beëindigingssequenties waaruit men de gedecodeerde codons en de respectieve residuen van de opkomende polypeptideketen kan afleiden, evenals op de ribosoomsnelheidsvariaties tijdens de interactie ^7,8. Figuur 1 geeft het protocol weer als een schema.

Figuur 1: Een overzicht van het SeRP-protocol. Dit protocol kan in zijn geheel binnen 7-10 dagen worden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Het genereren van stammen voor selectieve ribosoomprofilering

OPMERKING: Selective Ribosome Profiling (SeRP) is een methode die vertrouwt op affiniteitszuivering van factoren van belang, om hun interactiewijze met ribosomen-ontluikende ketencomplexen te beoordelen. Homologe recombinatie⁹, evenals CRISPR / Cas9^{10-gebaseerde} methoden worden gebruikt om verschillende factoren van belang te fuseren met tags voor affiniteitszuiveringen. Dergelijke tags zijn GFP, voor GFP-trap affiniteitszuiveringen, TAP-tag voor IgG-Sepharose kralenzuiveringen en AVI-Tag gezuiverd door avidin of streptavidin, om een paar succesvolle voorbeelden van de afgelopen jaren op te sommen.

1. Voer groei- of functionele testen uit om te valideren dat tagging geen invloed had op de eiwitfunctie. N' versus C' terminal tagging moet worden geëvalueerd.
   OPMERKING: De ribosomen (rRNA), evenals veel ribosoombindende domeinen in verschillende factoren, zijn sterk geladen, waardoor sterk geladen tags (zoals polyhistidine) onprefereerbaar zijn om te gebruiken, omdat dit kan leiden tot valse ontdekking of veranderde bindingsmodus.

2. Cultuurgroei

1. Cultiveer de geconstrueerde gistculturen (gebaseerd op de stam BY4741), die de gewenste gelabelde eiwitten bevatten, in vloeibaar gist-extract-pepton-dextrose (YPD)-rijk medium, of in synthetisch dextrose (SD) minimaal medium (1,7 g/ L giststikstofbasis met ammoniumsulfaat of 1,7 g / L giststikstofbasis zonder ammoniumsulfaat met 1 g / L mononatriumglutamaatzuur, 2% glucose en aangevuld met een volledig of geschikt mengsel van aminozuren).
2. Kweek 250-500 ml celcultuur tot een 0,5 OD₆₀₀ (mid-log), bij 30 °C, in een geschikt medium.

3. Celverzameling en lysis

1. Verzamel snel cellen door vacuümfiltratie op een nitrocellulose blotting membraan van 0,45 μm met een glasfiltersysteem (glazen filterhouder met 1 L glazen trechter, vacuümvoet en dop, roestvrijstalen scherm, pakking en veerklem, 90 mm; geslepen kolf 1 L).
2. Flash bevries de verzamelde cellen, door de gepelletiseerde cellen met een spatel te schrapen en ze onmiddellijk onder te dompelen in een met vloeibare stikstof gevulde buis van 50 ml.
   STOPPUNT: De cellen kunnen maximaal 3-4 weken bij -80 °C worden bewaard.
3. Voer cellyse uit door cryogene maling in een mengmolen: tweemaal gedurende 2 minuten bij 30 Hz, met 1 ml van de lysisbuffer (zie tabel 1). Koel af in vloeibare stikstof tussen de frezen.

Reagens	Hoeveelheid per monster (μL)	Eindconcentratie
10 mg/ml CHX (cycloheximide)	220	0,5 mg/ml
1M Tris-HCl pH 8,0	88	20m
3M KCl	205.7	140m
1m mgcl2	26.4	6mM
1M PMSF	4.4	1 mM
Np-40	4.4	0.10%
Proteaseremmer	2 tabletten
DNase I	8.8	0,02 U/ml
Eindvolume	4,400

Tabel 1: Recept voor de lysis buffer master mix.

OPMERKING: Lysisbuffer kan worden gewijzigd om meer proteaseremmers te bevatten (zoals bestatine, leupeptine, aprotinine, enz.) in het geval dat het eiwit van belang zeer onstabiel is, maar het is belangrijk om EDTA te vermijden om de kleine en grote subeenheden van het ribosoom te behouden die tijdens de volgende stappen zijn samengesteld. Om soortgelijke redenen moet u altijd ten minste 6 mM MgCl₂ in de bufferoplossing bewaren.

LET OP: HCl is zeer corrosief en PMSF is giftig. Draag handschoenen en hanteer met zorg.

4. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 30.000 x g, 4 °C om het lysaat te verwijderen en supernatant te verzamelen.

4. Zuivering van ribosoom-ontluikende ketencomplexen voor SeRP

1. Verdeel voor elk experiment het supernatant in twee delen; elk in een andere microcentrifugebuis: totaal RNA-monster (~ 200 μL) en immunozuivering (IP) monster (~ 700 μL) translatoommonsters.
2. Verwerking van het totale RNA-monster
   1. Vergist het totale RNA-monster met 10 U RNase I gedurende 25 minuten bij 4 °C; roteren bij 30 RPM met een roterend mixrek.
      OPMERKING: De spijsvertering kan worden gekalibreerd met behulp van polysoomprofilering om ervoor te zorgen dat er geen over- of ondervertering van monosomen piekt.
   2. Bereid de sucrosekussenmastermix zoals beschreven in tabel 2.

Reagens	Hoeveelheid per monster (μL)	Eindconcentratie
50% sucrose	200	25%
1M Tris-HCl pH 8,0	8	20m
3M KCl	18.7	140m
1m mgcl2	4	10m
100 mg/ml CHX	0.4	0,1 mg/ml
Proteaseremmer	1 tablet
Eindvolume	400

Tabel 2: Recept voor sucrose kussen master mix.

3. Laad het monster op 400 μL van het sucrosekussen en centrifugeer in een TLA120-rotor gedurende 90 minuten bij 245.000 x g en bij 4 °C.
4. Verwijder het supernatant snel met een vacuümpomp en leg pellets over elkaar met een lysisbuffer van 150 μL. Resuspendeer de pellets door gedurende 1 uur te schudden bij 4 °C en bij 300 RPM.
5. Resuspendeer de resterende pellet door pipetteer en breng over naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
   OPMERKING: 100-200 μg totaal RNA is meestal voldoende voor ribosoomprofilering van het totale translatoom. Men kan rRNA-depletiestap toevoegen om rRNA-verontreiniging te verminderen, wat de meest voorkomende verontreiniging is van ribosoom-ontluikende ketencomplexen affiniteitszuiveringen¹¹ (zie discussie voor meer details).

3. Verwerking van het immunozuiveringsmonster
   1. Was 100-400 μL van de affiniteitsbindende matrix (1:1 antilichaam-geconjugeerde kralen in 70% EtOH) per monster met 3 x 1 ml lysisbuffer (zonder DNase I en proteaseremmers); resuspendeer de affiniteitsmatrix in de lysisbuffer en roteer vervolgens op 30 RPM met een roterend mengrek bij 4 °C gedurende 5 min. Neerslaan door centrifugeren gedurende 30 s bij 3.000 x g, 4 °C. Gooi de bovenste vloeistof weg. Herhaal dit drie keer.
   2. Verwerk immunozuiveringsmonsters met behulp van 10 U per A260 nm-eenheid RNase I, samen met affiniteitsbindende matrix (bijvoorbeeld 100-400 μL GFP-TRAP per monster).
   3. Draai gedurende 25 minuten bij 30 RPM met een roterend mengrek om het eiwit te binden aan de affiniteitsmatrix, bij 4 °C.
   4. Bereid het wasbuffermengsel zoals beschreven in tabel 3.

Reagens	Hoeveelheid per monster (μL)	Eindconcentratie
10 mg/ml CHX	50	0,1 mg/ml
1M Tris-HCl pH 8,0	100	20m
3M KCl	233	140m
1m mgcl2	50	10m
1M PMSF	5	1 mM
Np-40	0.5	0.01%
Proteaseremmer	2 tabletten
50% glycerol	1,000	10%
Eindvolume	5,000

Tabel 3: Recept voor de wasbuffer master mix.

5. Was de affiniteitsbindende matrix driemaal met 1 ml wasbuffer, telkens gedurende ~1 min, draaiend in het mengrek bij 30 RPM, bij 4 °C.
6. Neerslaan door centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 30 s bij 4 °C. Gooi de bovenste vloeistof weg.
7. Was nog twee keer in een wasbuffer van 1 ml, telkens gedurende 5 minuten, draaiend in het mengrek bij 30 rpm, bij 4 °C.
8. Neerslaan door centrifugeren gedurende 30 s bij 3.000 x g en 4 °C.
9. Gebruik 50 μL kralen voor eiwitelutie met dezelfde hoeveelheid 2x monsterbuffer. Gebruik de rest van de kralen voor RNA-extractie.
10. Centrifugeer gedurende 30 s bij 3.000 x g, 4 °C om de kralen te pelleteren en gooi de bovenste vloeistof weg.
11. Bevries in vloeibare stikstof en bewaar bij -80 °C. Gebruik deze monsters voor latere RNA-extractie.
    STOPPLAATS: Monsters kunnen 's nachts of langer bij -80 °C worden bewaard. Dit kan een pleisterplaats zijn.
12. Beoordeel het succes van de affiniteitszuivering stap door western blot of Coomassie kleuring met aliquots (~ 10% van het volume, na mengen) van elke stap. Gebruik altijd mock IP op een niet-getagde WT-stam als controle voor niet-specifieke binding aan de affiniteitsmatrix.
    OPMERKING: Hoge niet-specifieke achtergrond kan worden overwonnen door extra wasstappen met toenemende zout- / wasmiddelconcentraties. Voorbijgaande interactie kan worden gestabiliseerd door verschillende cross-linking middelen behandeling, bijvoorbeeld paraformaldehyde (PFA) behandeling van levende cellen - het toevoegen van 0,4% -1% PFA aan de groeimedia gedurende 2-5 min, gevolgd door glycine (0,3 M) blussen gedurende 3 minuten, wordt sterk aanbevolen.
    LET OP: Paraformaldehyde is vermoedelijk carcinogeen. Omdat paraformaldehyde snel verdampt en corrosief is, werk je in een chemische veiligheidskap en draag je twee lagen handschoenen.

5. cDNA-bibliotheekvoorbereiding voor diepe sequencing

1. RNA-extractie
   OPMERKING: Werk met RNase-vrije antiaanbaksbuizen van 1,5 ml om mogelijke RNA- of DNA-uitputting te voorkomen.
   1. Ontdooi de monsters van stap 4.2.5 en 4.3.12 op ijs en resuspensiemonsters met 10 mM Tris-HCl pH 7.0 tot een eindvolume van 700 μL.
      LET OP: Zuurfenol en chloroform zijn vluchtig en schadelijk. Werk in een chemische veiligheidskap.
   2. Voeg 40 μL 20% SDS toe aan 0,7 ml Totale RNA- of IP-elutie. Een paar keer sluiten en omkeren. Eiwitprecipitatie moet de monsters wit maken.
   3. Voeg 0,75 ml voorverwarmd zuurfenol: chloroform toe aan monsters. Sluit de buizen goed af en schud in een thermische menger bij 1.400 RPM gedurende 5 min en bij 65 °C. Koel monsters op ijs gedurende 5 minuten.
   4. Centrifugeer de buis uit stap 5.1.3. bij 20.000 x g gedurende 2 min. Breng de bovenste waterige laag over in een verse buis en voeg er 0,7 ml zuur-fenol:chloroform aan toe.
   5. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, af en toe vortexing. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 20.000 x g. Breng de bovenste waterige laag over in een verse buis en voeg er 0,6 ml chloroform en vortex aan toe.
   6. Centrifugeer gedurende 1 minuut bij 20.000 x g. Breng de bovenste waterige laag over in een verse buis.
   7. Precipiteer nucleïnezuren door toevoeging van 78 μL 3 M NaOAc, pH 5,5, 2 μL GlycoBlue en 0,75 ml isopropanol. Vortex grondig gedurende 5 min. Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij -80 °C of 16 h bij -20 °C.
   8. Centrifugeer gedurende 30 minuten bij 20.000 x g en bij 4 °C en gooi het supernatant weg. Was de pellets met ijskoude 0,75 ml 80% ethanol. Keer de buisjes om voor een grondige wasbeurt. Centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant vervolgens weg.
   9. Draai af op 450 x g, 4 °C gedurende 20 s en verwijder de resterende ethanol en gooi de vloeistoffen weg. Droog de pellet met een open deksel gedurende 5 min bij 65 °C. Resuspensie van de monsters als volgt: voor IP resuspensie het monster in 10 μL van 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Voor totale translatoomanalyse resuspenseer het monster in 20 μL van 10 mM Tris-HCl, pH 7,0.
      STOPPUNT: RNA kan maandenlang bij -80 °C worden bewaard.
2. Kwantificeer de totale RNA-concentratie door fluorometrie
   OPMERKING: Alle volgende materialen en oppervlakken moeten RNase-vrij zijn terwijl de cDNA-bibliotheek wordt voorbereid op de volgende generatie sequencing. Draag bij het hanteren van RNA-monsters handschoenen.
   1. Verdun 1 μL zuurfenol-geëxtraheerd totaal RNA in 9 μL van 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Kwantificeren met behulp van een fluorometer, zoals aangegeven op de website van de fabrikant.
   2. Verdun de monsters die 50 μg RNA bevatten met 10 μL van 10 mM Tris-HCl, pH 7,0.
      OPMERKING: Meet geen IP-monsters, gebruik alles voor de volgende stap.
3. Gelzuiver ribosoom beschermde voetafdrukfragmenten
   1. Stel een 15% TBE-ureum polyacrylamide gel in en dompel onder in 1x TBE loopbuffer. Voer gedurende 30 minuten op 200 V voordat het monster wordt geladen. Voeg aan elk monster 20 μL 2x TBE-ureummonsterbuffer toe.
      OPMERKING: De verwachte bandgrootte is ongeveer 25-35 nt.
   2. Ontdooi een DNA-ladder van 10 bp en denaturatiemonsters (geen ladder) bij 80 °C gedurende 2 minuten en koel vervolgens op ijs. Laad elk monster op elke andere rijstrook. Laat de gel 50-70 min op 200 V lopen.
   3. Verdun 6 μL SYBR Gold (10.000 x concentraat) in 60 ml 1x TBE buffer en beits tijdens het schudden in lichtbeschermde dozen gedurende 15-20 minuten. Bereid tijdens het kleuren van de gel een steriel scalpel en 0,5 ml gelbrekerbuisjes in gelabelde tubes van 1,5 ml.
   4. Snijd de gewenste banden weg met een steriel scalpel (gebruik een vers scalpel of reinig goed tussen de monsters) en plaats elk gelstuk in een gel-breaker tube.
   5. Maak een afbeelding van de gel om er zeker van te zijn dat er geen monsterresten in de gel achterblijven.
   6. Centrifugeer de buisjes met gesneden plakjes op 20.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en breng de resterende gelstukken over van de gelbrekerbuis naar de buis van 1,5 ml.
   7. Voeg 0,5 ml 10 mM Tris toe, pH 7,0. Schud in een thermische menger bij 1.400 RPM gedurende 10 min bij 70 °C.
   8. Breng over in een celluloseacetaatkolom met een pipetpunt met brede boring en centrifugeer bij 20.000 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C.
   9. Breng de doorstroom over naar een nieuwe buis van 1,5 ml en koel op ijs.
   10. Om de nucleïnezuren neer te slaan, voegt u toe: 550 μL IPA, 55 μL 3 M NaOAc en 2 μL GlycoBlue en vortex om grondig te mengen. Breng de monsters gedurende ten minste 1 uur op -80 °C.
   11. Centrifugeer gedurende ten minste 1 uur bij 20.000 x g en 4 °C en gooi het bovennatuurlijke middel weg. Was de pellets met 0,75 ml ijskoude 80% ethanol. Keer de buizen om voor een grondige wasbeurt totdat de pellets van de bodem scheiden. Centrifugeer opnieuw bij 20.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.
   12. Draai af op 450 x g, 4 °C gedurende 20 s en verwijder de resterende ethanol. Droog de pellets met een open deksel gedurende 5 min bij 65 °C.
   13. Voeg 15 μL 10 mM Tris, pH 7,0 toe en resuspenseer de pellets grondig. Draai af op 450 x g, 4 °C gedurende 20 s en breng het monster over naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
       STOPPUNT: Gezuiverd RNA kan enkele maanden bij -80 °C worden bewaard.
4. Defosforylering
   1. Gebruik 3 μL van de volgende mix voor elk monster: Voeg 1 μL RNase-remmer toe aan 2 μL 10x T4 polynucleotidekinasereactiebuffer zonder ATP. Voeg 2 μL T4 polynucleotidekinase toe aan elk monster. Pipetteer voorzichtig om goed te mengen en incubeer op 37 °C gedurende 2 uur, zonder te schudden.
   2. Om het enzym te inactiveren, incubeer het monster bij 75 °C gedurende 10 minuten en spint u het monster bij 450 x g, 4 °C, gedurende 20 s. Voeg 0,5 ml 10 mM Tris toe, pH 7,0.
   3. Om nucleïnezuur neer te slaan, voegt u 2 μL GlycoBlue, 550 μL IPA en 55 μL 3 M NaOAc toe.
   4. Vortex om de monsters grondig te mengen en gedurende ten minste 1 uur bij -80 °C af te koelen.
      STOPPLAATS: Monsters kunnen 's nachts of langer bij -80 °C worden bewaard.
   5. Herhaal stap 5.3.11-5.3.13.
      STOPPUNT: Gedefosforyleerd RNA kan maandenlang bij -80 °C worden bewaard.
5. Kwantificering met behulp van een bioanalyzer
   1. Maak een 1:4 verdunning van elk RNA-monster door 1 μL monster en 4 μL DEPC-behandeld water te mengen.
      LET OP: DEPC is een carcinogeen. Draag handschoenen en werk voorzichtig.
   2. Voer een Bioanalyzer Small RNA Chip/TapeStation uit. Volg het protocol van de fabrikant.
      OPMERKING: De verwachte ribosoom-beschermde RNA-fragmentgrootte is ongeveer 28-30 nt.
6. Ligate 3' einde met Linker-1
   1. Verdun 5 pmol van kleine RNA-fragmenten tot 10 μL met 10 mM Tris, pH 7,0. Denaturatiemonsters bij 80 °C gedurende 2 minuten en koelen af op ijs.
   2. Bereid het basismengsel zoals beschreven in tabel 4 en gebruik 29 μL per monster.

Reagens	Hoeveelheid per monster (μL)	Eindconcentratie
50% steriel gefilterde PEG 8000	16	20%
DMSO	4	10%
10× T4 RNA ligase 2 buffer	4	1x
SUPERase-In RNase-remmer	2	2 U
10 mM geadenyleerde linker 3-L1	0.1	25 μM
DEPC-behandeld water	2.9
Eindvolume	29

Tabel 4: Recept voor 3' end ligation master mix.

3. Voeg 1 μL T4 RNA ligase 2 toe en pipetteer voorzichtig om goed te mengen. Incubeer bij 23 °C gedurende 2 uur.
4. Om de nucleïnezuren neer te slaan, voegt u toe: 550 μL IPA, 500 μL 10 mM Tris, pH 7,0, 55 μL van 3 M NaOAc en 2 μL GlycoBlue. Vortex om grondig te mengen en plaats de monsters minstens 1 uur bij -80 °C.
   STOPPLAATS: Bewaar de monsters bij -80 °C 's nachts of langer.
5. Herhaal stap 5.3.2-5.3.12.
6. Resuspendeer de pellet in 6 μL van 10 mM Tris, pH 7,0. Draai af bij 450 x g, 4 °C gedurende 20 s, en breng het monster over naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
   STOPPLAATS: Monsters kunnen maandenlang bij -80 °C worden bewaard.

7. Gelzuivering van 3' gekoppelde voetafdrukken
   1. Stel een 10% TBE-ureum polyacrylamide gel in en dompel onder in 1x TBE loopbuffer. Voer gedurende 30 minuten op 200 V voordat het monster wordt geladen. Voeg aan elk monster 6 μL 2x TBE-ureummonsterbuffer toe.
      OPMERKING: De verwachte bandgrootte is ongeveer 71-73 nt.
   2. Herhaal stap 5.3.2-5.3.13.
      STOPPLAATS: Monsters kunnen maandenlang bij -80 °C worden bewaard.
8. Omgekeerde transcribeer 3ʹ gekoppelde voetafdrukfragmenten om ssDNA te genereren
   1. Bereid een hoofdmengsel zoals beschreven in tabel 5 en gebruik 3 μL per monster.

Reagens	Hoeveelheid per monster (μL)	Eindconcentratie
10 mM dNTPs	1	0,5 mM
25 μM linker L(rt)	0.5	625 nM
DEPC-behandeld water	1.5
Eindvolume	3

Tabel 5: Recept voor de reverse transcriptie buffer master mix voorafgaand aan de denaturatie van nucleïnezuren.

2. Vortex en spin het monster.
3. Incubeer monsters bij 65 °C gedurende 5 min.
4. Koel monsters op ijs.
5. Bereid een hoofdmengsel zoals beschreven in tabel 6 en gebruik 6 μL per monster. Vortex en spin het monster. Voeg 1 μL Superscript III toe aan elk monster en pipetteer voorzichtig om goed te mengen en incubeer gedurende 30 minuten bij 50 °C.

Reagens	Hoeveelheid per monster (μL)	Eindconcentratie
5× FS-buffer	4	1x
SUPERase-In RNase-remmer	1	2 U
DTT 0,1 m	1	5mM
Eindvolume	6

Tabel 6: Recept voor de reverse transcriptie buffer master mix na denaturatie van nucleïnezuren.

6. Voeg 2,3 μL 1 N NaOH toe, die RNA hydrolyseert en de reverse transcriptie dooft.
   LET OP: NaOH is zeer corrosief. Draag handschoenen en oogbescherming.
7. Incubeer gedurende 15 minuten bij 95 °C, totdat het monster roze wordt.
8. Stel een 10% TBE-ureum polyacrylamide gel in en dompel onder in 1x TBE loopbuffer. Voer gedurende 30 minuten op 200 V voordat het monster wordt geladen. Voeg aan elk monster 23 μL 2x TBE-ureummonsterbuffer toe.
   OPMERKING: De verwachte DNA-bandgrootte is 115-117 nt.
9. Herhaal stap 5.3.2-5.3.12.
10. Resuspendeer de pellet in 15 μL van 10 mM Tris, pH 8,0. Draai af op 450 x g, 4 °C gedurende 20 s en breng het monster over naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
    STOPPLAATS: Monsters kunnen maandenlang bij -80 °C worden bewaard.

9. ssDNA circulaireisatie
   1. Bereid de volgende basismix voor en laad 4 μL per monster, zoals beschreven in tabel 7.

Reagens	Hoeveelheid per monster (μL)	Eindconcentratie
10× CircLigase II buffer	2	1x
5 M Betaïne (optioneel)	1	0,25 m
50 mm MnCl2	1	2,5 mM
Eindvolume	4

Tabel 7: Recept voor ssDNA circularisatie master mix.

2. Voeg 1 μL CircLigase II ssDNA ligase toe aan elk monster en incubeer gedurende 1 uur bij 60 °C.
   OPMERKING: De efficiëntie van deze stap kan worden verhoogd door 1 μL CircLigase II ssDNA ligase na 1 uur incubatie aan elk monster toe te voegen.
3. Inactiveer het enzym door gedurende 10 minuten bij 80 °C te broeden.
4. Koel af op ijs en ga verder met PCR-versterking of bewaar bij -80 °C.
   STOPPUNT: Monsters kunnen jarenlang bij -80 °C worden bewaard.

10. PCR-versterking
    1. Bereid de volgende PCR-mastermix voor en laad 82 μL per monster, zoals beschreven in tabel 8.

Reagens	Hoeveelheid per monster (μL)	Eindconcentratie
DEPC-behandeld water	61.6
5× Phusion HF reactiebuffer	17.6	1x
10 mM dNTPs	1.8	200 μM
100 μM PCR voorwaartse primer	0.2	225 nM
HF Phusion polymerase |	0.8	1,6 U
Eindvolume	82

Tabel 8: Recept voor PCR-versterkingsmastermix.

2. Voeg aan elke buis met mastermix 5 μL gecirculeerd DNA toe.
   OPMERKING: Bewaar de rest van de gecirculeerde DNA-monsters bij -80 °C.
3. Voeg een andere 1 μL van 20 μM PCR reverse barcode primer toe aan elk monster (zie tabel 9) en vortex om grondig te mengen.
4. Aliquot elke buis in vier afzonderlijke PCR-buizen, elk zal worden gebruikt voor een ander aantal PCR-cycli.
5. Voer een PCR-reactie uit volgens het volgende programma, zoals beschreven in tabel 10.

Cyclus	Denaturatie (98 °C)	Gloeien (60 °C)	Uitschuiven (72 °C)
1	30 s
2-16	10 s	10 s	5 s

Tabel 10: PCR-programma voor PCR-reactie.

6. Verwijder na cycli 8, 9, 10 en 11 PCR-buizen (voor IP-monsters variëren de cycli van 9 tot 15) als eerste poging. Pauzeer na elke cyclus het programma, haal er een aliquot uit en zet het in de ijskast en hervat het programma vervolgens snel.
   OPMERKING: Het aantal cycli moet worden aangepast op basis van de hoeveelheid gecirculeerd DNA in elke reactie. Zie figuur 4 voor een voorbeeld en verdere verduidelijking.
7. Voeg aan elke reactie van 17 μL 3,5 μL 6x DNA-ladende kleurstof toe.
8. Ontdooi een 10 bp DNA ladder.
9. Voor groottescheiding door gel-elektroforese dompelt u 8% TBE polyacrylamide onder in 1x TBE-loopbuffer en laadt u de monsters van elk verschillend cyclusnummer in aangrenzende putten en laat u de gel gedurende 50 minuten bij 180 V lopen.
10. Verdun 6 μL SYBR Gold (10.000 x concentraat) in 60 ml 1x TBE buffer en beits tijdens het schudden in lichtbeschermde dozen gedurende 15-20 minuten.
11. Bereid tijdens het kleuren van de gel een steriel scalpel en 0,5 ml gelbrekerbuisjes in gelabelde tubes van 1,5 ml.
12. Maak een afbeelding van de gekleurde nucleïnezuren.
13. Snijd de gewenste band met een verwachte bandgrootte van 174-176 bp met het steriele scalpel en plaats de gelplak in de bereide gelbrekerbuis van 0,5 ml (reinig grondig tussen de monsters en gebruik RNase-inactiverend middel, of schakel over op een nieuw mes).
14. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten bij 20.000 x g en 4 °C en breng vervolgens de resterende gelstukken over van de gelbrekerbuis van 0,5 ml naar de buis van 1,5 ml.
15. Voeg 500 μL 10 mM Tris, pH 8,0 toe en schud in een thermische menger bij 1.400 RPM gedurende 10 min en 70 °C.
16. Breng de opgeloste gel over in een celluloseacetaatkolom met een pipetpunt met brede boring.
17. Centrifugeer de kolom gedurende 3 minuten bij 20.000 x g en 4 °C en breng de doorstroom over naar een nieuwe buis van 1,5 ml en koel op ijs.
18. Om het nucleïnezuur neer te slaan, voegt u toe: 550 μL IPA, 32 μL van 5 M NaCl, 1 μL van 0,5 M EDTA en 2 μL GlycoBlue en vortex om grondig te mengen.
19. Bewaar de monsters gedurende ten minste 1 uur bij -80 °C of -20 °C 's nachts.
    STOPPLAATS: Monsters kunnen 's nachts of langer bij -80 °C worden bewaard.
20. Herhaal stap 5.3.11-5.3.12.
21. Resuspend in 11 μL van 10 mM Tris, pH 8,0. Draai af op 450 x g, 4 °C gedurende 20 s en breng het monster over naar een nieuwe buis van 1,5 ml.
    STOPPUNT: Monsters kunnen jarenlang bij -80 °C worden bewaard.

11. Kwantificeer de grootteverdeling door Bioanalyzer
    1. Maak een 1:4 verdunning van elk monster door 1 μL monster te mengen met 4 μL met DEPC-behandeld water.
    2. Voer de Bioanalyzer Small RNA Chip uit. Volg het protocol van de fabrikant.
       OPMERKING: De verwachte lengte is 175 ± 5 bp.
12. Kwantificeer DNA-concentratie door fluorometer
    1. Voer een dsDNA-concentratiecontrole met hoge gevoeligheid uit met een fluorometer volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
    2. Multiplex- en sequentiemonsters volgens de Illumina-aanbevelingen (Index Adapters Pooling Guide¹²).

6. Data-analyse

1. Voer een analyse uit zoals beschreven in het aanvullende bestand.

Resultaten

Zoals geïllustreerd in het stroomschema van dit protocol (figuur 1), werden cellen gekweekt tot logfase en vervolgens snel verzameld door filtratie en gelyseerd door cryogene slijping. Het lysaat werd vervolgens in tweeën gedeeld: een voor totale ribosoom-beschermde mRNA-voetafdrukken en de andere voor geselecteerde ribosoom-beschermde mRNA-voetafdrukken, waarop we affiniteitszuivering uitvoerden om de gelabelde eiwit-ribosoom-ontluikende ketencomplexen naar beneden te halen. We zorgden voor...

Discussie

Hier beschrijft het protocol de Selective Ribosome Profiling-benadering voor het vastleggen van co-translationele interacties in bijna codonresolutie. Naarmate het ribosoom stijgt als een hub voor het coördineren van de ontluikende ketenopkomst in het overvolle cytoplasma, is dit een cruciale methode om de verschillende co-translationele interacties te identificeren en te karakteriseren die nodig zijn om een functioneel proteoom te garanderen, evenals voor het bestuderen van verschillende ziekten. Tot op heden is SeRP de...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
3'-Phosphorylated 28 nt RNA control oligonucleotide	IDT	custom order	RNase free HPLC purification; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'
Absolute ethanol	VWR	20821
Acid phenol–chloroform	Ambion	AM9722
Antibody: mouse monclonal anti-HA	Merck	11583816001	12CA5
Aprotinin	Roth	A162.3
ATP*	NEB	P0756S	10 mM
Bacto agar	BD	214030
Bacto peptone	BD	211820
Bacto tryptone	BD	211699
Bacto yeast extract	BD	212720
Bestatin hydrochloride	Roth	2937.2
Chloroform	Merck	102445
CircLigase II ssDNA Ligase*	Epicentre	CL9025K	100 U/μL
Colloidal Coomassie staining solution	Roth	4829
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets	Roche Diagnostics	29384100
Cycloheximide	Biological Industries	A0879
DEPC treated and sterile filtered water*	Sigma	95284
D-Glucose anhydrous	Merck	G5767-500G
Diethylpyrocarbonate	Roth	K028
Dimethylsulfoxide*	Sigma-Aldrich	276855
DNA ladder, 10 bp O'RangeRuler*	Thermo Fisher Scientific	SM1313
DNA loading dye*	Thermo Fisher Scientific	R0631	6×
DNase I, recombinant	Roche	4716728001	RNAse free
dNTP solution set*	NEB	N0446S
EDTA*	Roth	8043
Glycerol	VWR	24388.260.
Glycine solution	Sigma-Aldrich	67419-1ML-F	1 M
GlycoBlue	Ambion	AM9516	15 mg/mL
HEPES	Roth	HN78.3
HF Phusion polymerase*	NEB	M0530L
HK from S. cerevisiae	Sigma-Aldrich	H6380-1.5KU
Hydrochloric acid	AppliChem	A1305
Isopropanol	Sigma-Aldrich	33539
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Roth	CN08
Kanamycin	Roth	T832.4
KCl	Roth	6781.1
KH2PO4	Roth	3904.1
Leupeptin	Roth	CN33.4
Linker L(rt)	IDT	custom order
Liquid nitrogen
MgCl2	Roth	KK36.3
Na2HPO4	Roth	P030.2
Na2HPO4·2H2O	Roth	T879.3
NaCl*	Invitrogen	AM97606	5 M
NaH2PO4·H2O	Roth	K300.2
NHS-activated Sepharose 4 fast-flow beads	GE Life Sciences	17090601
Nonidet P 40 substitute	Sigma	74385
Pepstatin A	Roth	2936.2
Phenylmethyl sulfonyl fluoride	Roth	6367
Precast gels	Bio-Rad	5671034	10% and 12%
RNase I	Ambion	AM2294
SDS, 20%	Ambion	AM9820	RNase free
Sodium acetate*	Ambion	AM9740	3 M, pH 5.5
Sodium azide	Merck	S8032-100G
Sodium chloride	Roth	9265
Sodium hydroxide*	Sigma	S2770	1 N
Sucrose	Sigma-Aldrich	16104
SUPERase-In RNase Inhibitor	Ambion	AM2694
Superscript III Reverse Transciptase*	Invitrogen	18080-044
SYBR Gold*	Invitrogen	S11494
T4 polynucleotide kinase*	NEB	M0201L
T4 RNA ligase 2*	NEB	M0242L
TBE polyacrylamide gel*	Novex	EC6215BOX	8%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC68752BOX	10%
TBE–urea polyacrylamide gel*	Novex	EC6885BOX	15%
TBE–urea sample buffer*	Novex	LC6876	2×
Tris	Roth	4855
Tris*	Ambion	AM9851	1 M, pH 7.0
Tris*	Ambion	AM9856	1 M, pH 8.0
UltraPure 10× TBE buffer*	Invitrogen	15581-044
* - voor bibliotheekvoorbereiding
gasket and spring clamp, 90 mm,	Millipore	XX1009020
ground joint flask 1 L,	Millipore	XX1504705