Methodenartikel

Analyse van oxidatieve stress in murine intestinale organoïden met behulp van reactieve zuurstof soortgevoelige fluorogene sonde

DOI:

10.3791/62880

⸱

17 september 2021

 ,  ,  , 
1Molecular Microbial Pathogenesis Unit, Institut Pasteur, 2Chaire de Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Institut de Biologie Paris Seine (IBPS) - Developmental Biology Unit, Sorbonne Université, CNRS UMR7622, INSERM U1156, 4Molecular Radiotherapy, INSERM U1030, Gustave Roussy, Université Paris-Saclay, 5The Center for Microbes, Development and Health, Institut Pasteur Shanghai and Chinese Academy of Sciences, 6Microenvironment and Immunity Unit, Institut Pasteur

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft een methode om reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de intestinale muriene organoïden te detecteren met behulp van kwalitatieve beeldvorming en kwantitatieve cytometrie-assays. Dit werk kan mogelijk worden uitgebreid naar andere fluorescerende sondes om het effect van geselecteerde verbindingen op ROS te testen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) spelen een essentiële rol in intestinale homeostase. ROS zijn natuurlijke bijproducten van het celmetabolisme. Ze worden geproduceerd als reactie op infectie of letsel op mucosaal niveau omdat ze betrokken zijn bij antimicrobiële reacties en wondgenezing. Ze zijn ook kritische secundaire boodschappers, die verschillende routes reguleren, waaronder celgroei en differentiatie. Aan de andere kant leiden overmatige ROS-niveaus tot oxidatieve stress, wat schadelijk kan zijn voor cellen en darmziekten zoals chronische ontsteking of kanker kan bevorderen. Dit werk biedt een eenvoudige methode om ROS in de intestinale muriene organoïden te detecteren door middel van live beeldvorming en flowcytometrie, met behulp van een commercieel verkrijgbare fluorogene sonde. Hier beschrijft het protocol het testen van het effect van verbindingen die de redoxbalans in intestinale organoïden moduleren en ROS-niveaus detecteren in specifieke darmceltypen, hier geïllustreerd door de analyse van de darmstamcellen genetisch gelabeld met GFP. Dit protocol kan worden gebruikt met andere fluorescerende sondes.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) zijn natuurlijke bijproducten van cellulair metabolisme. Ze kunnen ook actief worden geproduceerd door gespecialiseerde enzymatische complexen zoals de membraangebonden NADPH-Oxidasen (NOX) en Dual Oxidases (DUOX), die superoxide-anion en waterstofperoxide genereren1. Door antioxiderende enzymen en ROS-aaseters tot expressie te brengen, kunnen cellen hun redoxbalans fijn afstemmen, waardoor weefselhomeostase wordt beschermd2. Hoewel ROS zeer giftig kan zijn voor de cellen en DNA, eiwitten en lipiden kan beschadigen, zijn het cruciale signaalmoleculen2. In het darmepitheel zijn matige ROS-niveaus vereist voor stam- en voorlopercelproliferatie3; hoge ROS-waarden leiden tot hun apoptose4. Chronische oxidatieve stress is gekoppeld aan veel gastro-intestinale ziekten, zoals inflammatoire darmziekten of kanker. In een muismodel van Wnt-gedreven darmkanker bleek bijvoorbeeld een verhoogde ROS-productie door activering van NADPH-oxidasen nodig te zijn voor hyperproliferatie van kankercellen5,6. Definiëren hoe darmcellen, in het bijzonder stamcellen, stamcellen omgaan met oxidatieve stress en hoe de cellulaire omgeving deze capaciteit kan beïnvloeden, is essentieel om de etiologie van deze ziekte beter te begrijpen7.

In een weefsel vertonen verschillende celtypen een basale oxidatieve toestand die kan variëren afhankelijk van hun functie en metabolisme en de expressie van verschillende niveaus van oxidant- en antioxidantmoleculen4,7. Het monitoren van ROS in vivo is een grote uitdaging. Celdoorlatende kleurstoffen die fluorescentie uitzenden volgens hun redoxtoestand zijn ontwikkeld om cellulaire ROS in levende cellen en dieren te visualiseren en te meten. Hun werkzaamheid hangt echter af van hun diffusie in levende weefsels en hun snelle uitlezing, waardoor ze moeilijk te gebruiken zijn in diermodellen8.

In het verleden werd de studie van het effect van verbindingen op ROS-generatie gedaan met behulp van cellijnen, maar dit weerspiegelt mogelijk niet de in vivo situatie. Het intestinale organoïde model, ontwikkeld door de groep van Clevers9, maakt de groei van intestinale primaire cellen ex vivo mogelijk. Cultuur van intestinale crypten in matrices, in aanwezigheid van gedefinieerde groeifactoren, leidt tot driedimensionale structuren, organoïden (mini-darm) genoemd, die de crypt-villus-organisatie reproduceren, met cellen uit de verschillende epitheliale afstammingslijnen die een intern lumen bekleden, en de darmstamcellen die zich in kleine crypten-achtige uitsteeksels bevinden.

Hier wordt, gebruikmakend van dit model, een eenvoudige methode beschreven om oxidatieve stress in primaire darmcellen met de eencellige resolutie te bestuderen door een commercieel beschikbare ROS-gevoelige kleurstof toe te voegen aan het organoïde kweekmedium.

Plaatlezers worden vaak gebruikt om ROS-productie in een totale populatie te detecteren. Dit protocol maakt gebruik van flowcytometrie of imaging assay om ROS te detecteren in een bepaald celtype met genetisch gemodificeerde cellen of specifieke antilichaamkleuring. Dit werk omvat intestinale organoïde cultuur van muizen en ROS-visualisatie door confocale beeldvorming en kwantificering door flowcytometrie. Met behulp van Lgr5-GFP muizen-afgeleide dunne darm organoïden, is het mogelijk om specifiek het niveau van oxidatieve stress in intestinale stamcellen te analyseren op verschillende behandelingen. Dit protocol kan worden aangepast om de invloed van exogene moleculen, zoals microbiota-afgeleid muramyl-dipeptide (MDP)10, op de ROS-balans te testen, na het stimuleren van organoïden met de geselecteerde verbindingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden uitgevoerd na goedkeuring door het Institut Pasteur Use Committee en door het Franse ministerie van Landbouw nr. 2016-0022. Alle stappen worden uitgevoerd in een weefselkweekkap.

1. Bereiding van reagentia en materialen voor het kweken van intestinale organoïden

  1. Om groeikweekmedium te bereiden, meng geavanceerde DMEM / F-12 aangevuld met 1x glutamine, 1x penicilline / streptomycine (P / S) -oplossing, 10 mM HEPES, 50 ng / ml murine EGF, 20 μg / ml murine Noggin 500 ng / ml muis R-Spondin1 (zie Tabel met materialen). Laat het medium op kamertemperatuur (RT) staan tijdens de extractie van de crypte.
    OPMERKING: Vries het ongebruikte medium in aliquots in bij -20 °C. Vermijd bevriezen en ontdooien.
  2. Vul een buis van 50 ml met 40 ml Advanced DMEM/F-12 en houd deze op ijs.
    OPMERKING: Houd het ongebruikte medium op 4 °C. Het zal worden gebruikt voor organoïden passaging.
  3. Verwarm de celkweekplaten (μ-Slide 8 putkamers en/of 96-well ronde bodem) in de incubator bij 37 °C.
  4. Ontdooi keldermembraanmatrix (BMM) (zie Tabel met materialen) aliquots op ijs (voordat het protocol wordt gestart of ten minste 1 uur voor het platen van crypten).
    OPMERKING: De BMM zal snel stollen als het niet koud wordt gehouden.
  5. Bereid was-/spoeloplossing voor door 1% penicilline-streptomycine-oplossing toe te voegen aan DPBS (DPBS-P/S).
  6. Vul een petrischaaltje van 100 mm met 10 ml koude DPBS-P/S. Vul zes buizen van 15 ml met 10 ml DPBS en label ze van F1 tot F6.
  7. Bereid 30 ml 10 mM EDTA-oplossing door verdunning uit 0,5 M EDTA in DPBS. Vul twee buizen van 15 ml met 10 ml 10 mM EDTA en label ze E1 en E2.
  8. Houd alle oplossingen voorgekoeld op 4°C en houd ze tijdens de procedure op het ijs.

2. Intestinale organoïden cultuur

  1. Offer een 8-10 weken oude Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) muis op volgens de nationale regels en voorschriften.
  2. Verzamel 5-8 cm van het jejunum dat het gebied tussen de twaalfvingerige darm (5 cm van de maag) en het ileum (10 cm van de blindedarm) omvat en bewaar dpbs-p/s koud op ijs.
  3. Reinig het darmgehalte door te spoelen met 5-10 ml koude DPBS-P /S.
    OPMERKING: Zelfgemaakte spoelspuiten kunnen worden verkregen door een tip van 200 μL op een spuitmondstuk van 10 ml te steken.
  4. Open de darm in de lengterichting met een kogelpuntschaar (zie Materialentabel) (om beschadiging van het weefsel te voorkomen).
  5. Breng het weefsel met een tang over in een petrischaaltje met koude DPBS-P/S bij kamertemperatuur en schud het om af te spoelen.
  6. Pak met een plastic Pasteur-pipet de darm door aspiratie en breng deze over in een buis van 15 ml met het label E1 met 10 ml koude 10 mM EDTA.
  7. Keer de buis 3 keer om en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
  8. Breng met behulp van een plastic Pasteur pipet het weefsel over in buis F1 met 10 ml DPBS. Vortex gedurende 2 min (op normale vortex, de buis met de hand vasthouden en ervoor zorgen dat de darm mooi wervelt).
  9. Doe 10 μL van de fractie in een petrischaaltje en beoordeel de kwaliteit van de fractie onder een microscoop.
    OPMERKING: Alle vortexstappen worden met maximale snelheid uitgevoerd en de kwaliteit van elke fractie moet onder de microscoop worden beoordeeld (figuur 1).
  10. Pak met een plastic Pasteur pipet de darm door aspiratie en breng deze gedurende 2 minuten over in buis F2 met 10 ml DPBS en vortex.
  11. Herhaal stap 2.10 en breng het weefsel over in buis F3 met 10 ml DPBS en vortex gedurende 2 minuten.
  12. Herhaal de EDTA-incubatie zoals in stap 2.6, waarbij het weefsel wordt overgebracht in buis E2 met 10 mM EDTA.
  13. Keer de buis 3 keer om en incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
  14. Herhaal stap 2.10 en breng het weefsel over in buis F4 met 10 ml DPBS en vortex gedurende 3 minuten.
  15. Herhaal stap 2.14 en breng het weefsel over in buis F5 met 10 ml DPBS en vortex gedurende 3 minuten.
  16. Herhaal stap 2.15 en breng het weefsel over in buis F6 met 10 ml DPBS en vortex gedurende 3 minuten.
  17. Combineer de beste fracties die door de zwaartekracht filteren door een celzeef van 70 μm in een buis van 50 ml (op ijs) om villi en aanzienlijk vuil te verwijderen.
    OPMERKING: Meestal zijn F5 en F6 de fracties die talrijke crypten en minder puin bevatten.
  18. Draai de crypten op 150 x g bij 4 °C gedurende 3 minuten.
  19. Leeg de buis, verstoor de pellet mechanisch en voeg 5 ml koude DMEM/F12 toe.
  20. Doe 10 μL van de suspensie in een petrischaaltje en tel het aantal crypten dat in de aliquot aanwezig is handmatig onder een microscoop.
    OPMERKING: Tel geen enkele cellen of klein vuil.
  21. Bereken het volume (V) van cryptensuspensie vereist in μL, rekening houdend met het feit dat 300 crypten per put worden verguld, W het aantal putten is en N het aantal crypten geteld uit 10 μL van de suspensie. Breng de crypten over naar een nieuwe buis van 15 ml.
    OPMERKING: V = 300 x B x 10/N. Als in het geplande experiment een klein volume wordt gebruikt, kan een centrifugebuis van 1,5 ml worden gebruikt.
  22. Draai de crypten op 200 x g bij 4 °C gedurende 3 minuten.
  23. Verwijder het supernatant voorzichtig met een pipet.
  24. Verstoor de pellet mechanisch en voeg voorzichtig groeicultuurmedium toe om een concentratie van 90 crypten /μL te verkrijgen.
  25. Voeg 2 volumes onverdund BMM toe om een eindconcentratie van 30 crypten/μL te hebben. Pipetteer voorzichtig op en neer zonder luchtbellen in het mengsel te brengen.
    OPMERKING: Houd de buis altijd op ijs om Stolling van BMM te voorkomen.
  26. Plaat 10 μL van de crypten/BMM mengen in elke put. Gebruik voor flowcytometrie-analyse 96-putplaten met ronde bodem. Verdeel 10 μL in het midden van elke put als een koepel. Gebruik voor beeldvorming μ-slide 8-put (zie Materiaaltabel) en zet de 10 μL af als een dunne laag.
    OPMERKING: Plaats de organoïden als een dunne laag voor de beeldvormingstest om hun diepgaande beeldvorming mogelijk te maken.
  27. Laat de plaat 5 minuten bij RT staan om de BMM te laten stollen. Plaats de plaat in de couveuse bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 15 min.
  28. Voeg 250 μL groeimedium toe aan elke put en zorg ervoor dat u de BMM niet losmaakt.
  29. Plaats de platen in de couveuse bij 37 °C en 5% CO2.
  30. Voer de ROS-analyse uit tussen dag 4 en 6 van cultuur. Verander anders het medium en splits de organoïden na het verschijnen van verschillende en lange ontluikende structuren en wanneer dode cellen zich ophopen in de organoïden lumens.

3. Organoïden passeren

  1. Begin met het passeren van dunne darmorganoïden vanaf de 6e dag van de cultuur, wanneer significante ontluikende structuren zijn gevormd en de organoïden lumens donker zijn geworden.
    OPMERKING: Het lumen van de organoïde wordt donker door de opeenhoping van dode cellen, puin en slijm. Vermijd het laten overwoekeren van de organoïden voordat ze splitsen. De splitsingsverhouding is afhankelijk van de groei van de organoïden. Het doorgeven van de organoïden met een verhouding van 1:2 op dag 6 en 1:3 op dag 10 wordt aanbevolen.
  2. Vul een buis van 15 ml met 4 ml koude Advanced DMEM / F-12 en houd deze op ijs.
    OPMERKING: Hier worden volumes voor een 96-well cultuurplaat verstrekt. Als een andere indeling wordt gebruikt, past u het volume dienovereenkomstig aan.
  3. Zuig het medium voorzichtig op met een pipet of een vacuümpomp uit de putten zonder de BMM-koepels aan te raken en gooi het weg.
  4. Voeg 100 μL koude Advanced DMEM/F-12 per put toe. Pipetteer op en neer om de BMM te breken en breng de inhoud van de put over in de buis van 15 ml.
  5. Was de put met 200 μL koude Advanced DMEM/F-12 en verzamel deze in dezelfde buis.
    OPMERKING: Als u meerdere putten uit dezelfde experimentele toestand passeert, kan de inhoud van de putten worden samengevoegd in dezelfde verzamelbuis van 15 ml.
  6. Draai de opvangbuis van 15 ml op 100 x g gedurende 5 minuten bij 4°C.
  7. Gooi het supernatant weg en voeg 1 ml koude Advanced DMEM/F-12 toe aan de pellet. Gebruik een P1000-tip om een P10-tip (zonder filter) op en neer te nemen en pipetteer minstens 20 keer op en neer.
  8. Voeg 4 ml koude Advanced DMEM/F-12 toe aan de buis. Draai 5 min bij 300 x g bij 4°C.
  9. Zuig het supernatant op met een pipet of een vacuümpomp zonder de pellet te verstoren. Verstoor vervolgens de pellet mechanisch.
  10. Voeg BMM verdund toe in groeicultuurmedium (verhouding 2:1). Pipetteer voorzichtig op en neer zonder luchtbellen in het mengsel te brengen.
  11. Plaat 10 μL van de crypten/BMM mengen in elke put.
  12. Houd de plaat 5 minuten bij RT om de BMM te laten stollen. Plaats de plaat in de couveuse bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 15 min.
  13. Voeg 250 μL groeimedium toe aan elke put.
    OPMERKING: Pas op dat u de BMM niet losmaakt.
  14. Plaats de platen in de couveuse bij 37 °C en 5% CO2.

4. Bereiding van reagentia en materialen om oxidatieve stress in intestinale organoïden te beoordelen

  1. Bereid een 250 mM stockoplossing van inhibitor N-acetylcysteïne (NAC) (zie tabel met materialen), resuspend 10 mg met 245 μL DPBS. Gebruik bij 1 mM eindconcentratie.
  2. Bereid een 50 mM stamoplossing van inductor Tert-butylhydroperoxide (tBHP), 70% in water, verdun 3,22 μL met 496,8 μL DPBS. Gebruik bij een eindconcentratie van 200 μM.
  3. Bereid voor het flowcytometrieonderzoek een 250 μM werkoplossing van een fluorogene sonde (zie Tabel met materialen) door de stamoplossing 1/10 in DMSO te verdunnen. Gebruik bij 1 μM eindconcentratie.
    OPMERKING: Zoals aangegeven in de instructies van de fabrikant, is de fluorogene sonde gevoelig voor licht en zuurstof. Voorraden en aliquots mogen niet te vaak open en dicht zijn.
  4. Bereid voor het beeldvormende onderzoek een 1,25 mM werkoplossing van de fluorogene sonde voor door de stamoplossing 1/2 in DMSO te verdunnen. Gebruik bij een eindconcentratie van 5 μM.
  5. Bereid een eindoplossing van 0,1 μg/ml DAPI in DPBS voor, te gebruiken voor dode celdiscriminatie in de flowcytometrietest.
  6. Verdun Hoechst 33342 tot 1,25 mg/ml in DPBS. Gebruik bij 5 μg/ml eindconcentratie voor nucleaire kleuring in de beeldvormingstest.
  7. Dmem verwarmen zonder fenolrood bij 37 °C.
    OPMERKING: Deze stappen beschrijven het gebruik van negatieve en positieve controles die in alle testen moeten worden opgenomen, met behulp van de voorwaarden die zijn aangegeven in figuur 2A. De test kan worden gebruikt om anti- of pro-oxidant verbindingen te testen. De stappen zijn hetzelfde en het enige verschil is wanneer de verbindingen worden toegevoegd voordat de fluorogene kleurstof wordt gebruikt.

5. Visualisatie van oxidatieve stress in 3D-organoïden door confocale microscopie

  1. Neem de organoïden die in de μ-Slide 8 putkamers zijn verguld en voeg 1 μL NAC-stamoplossing toe in de overeenkomstige putten om een uiteindelijke concentratie van 1 mM te verkrijgen.
  2. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2.
  3. Voeg 1 μL tBHP-stamoplossing toe in de overeenkomstige putten om een eindconcentratie van 200 μM te verkrijgen.
  4. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C en 5% CO2.
  5. Voeg 1 μL per putje van de 1,25 mM verdunning van de fluorogene sonde toe om een eindconcentratie van 5 μM te verkrijgen.
  6. Voeg 1 μL per putje van de 1,25 mg/ml verdunning van Hoescht toe om een eindconcentratie van 5 μg/ml te verkrijgen.
  7. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C en 5% CO2.
  8. Verwijder het medium zonder de BMM te storen. Voeg voorzichtig 250μL warme DMEM zonder fenolrood toe.
    OPMERKING: Als een overname op lange termijn is gepland, voeg dan groeifactorenverbindingen toe aan DMEM zonder fenolrood.
  9. Stel de organoïden voor met behulp van een confocale microscoop uitgerust met een thermische kamer en gastoevoer die de fluorogene sonde (ROS) detecteert.
    OPMERKING: De excitatie/emissie (ex/em) voor de fluorogene sonde is 644/665, ex/em voor Hoechst (kernen) is 361/486 en ex/em voor GFP (intestinale stamcel van de Lgr5-GFP muizen) is 488/510. Een 63x olie-onderdompelingsobjectief wordt gebruikt om signalen in stamcellen te detecteren. Wijzig de laserinstellingen niet tussen de monsters. Een 20x-doelstelling kan worden gebruikt om een overzicht van de ROS-productie mogelijk te maken.
  10. Gebruik de positieve regeling om de laserintensiteit en tijdblootstelling voor het ROS-signaal in te stellen en controleer of dit signaal lager is in de negatieve regeling.
  11. Met behulp van oculair scherm de dia om de GFP organoïden uit te drukken en aan te passen laser intensiteit.
    OPMERKING: Deze stap wordt handmatig uitgevoerd.
  12. Definieer posities om een gestikt beeld van de hele organoïde te verkrijgen. Stel een z-stack van 25 μm (stapgrootte 5 μm) in om een deel van de organoïden te krijgen met één laag cellen.
    OPMERKING: Raadpleeg de gebruikershandleiding van de microscoop om de installatie te optimaliseren. Met behulp van levende cellen moet de acquisitie binnen 1 uur na het einde van de incubatie worden gedaan.
  13. Open de afbeeldingen in een open-source beeldverwerkingssoftware (zie Tabel met materialen).
  14. Ga door de z-stack en kies de sectie waarin het midden van de organoïden goed is weergegeven en maak een nieuw beeld met het geselecteerde gebied.
  15. Kwantificeer de afbeeldingen volgens stap 5.15.1 - 5.15.5.
    1. Selecteer het gereedschap Lijn uit de vrije hand.
    2. Teken een lijn langs de kernen.
      OPMERKING: Selecteer alleen regio's met GFP-positieve cellen als alleen stamcellen worden geanalyseerd.
    3. Vergroot de lijnbreedte om de cellaag met de lijn te bedekken zonder het luminale vuil op te nemen.
    4. Selecteer het kanaal voor het ROS-signaal en meet de fluorescentie-intensiteit in het geselecteerde gebied en annoteer de waarden.
    5. Teken een lijn waar geen signaal is en meet de fluorescerende intensiteit van de achtergrond die wordt afgetrokken van de vorige waarde om de uiteindelijke intensiteit te krijgen.

6. Kwantificering van de oxidatieve stress op de gedissocieerde organoïden met behulp van flowcytometer

  1. Voeg 1 μL NAC-stamoplossing toe in de putten voor negatieve controles om een eindconcentratie van 1 mM te verkrijgen.
    OPMERKING: Gebruik de organoïden die zijn verguld in de 96-well ronde bodemplaten.
  2. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C en 5% CO2.
  3. Voeg 1 μL tBHP-stamoplossing toe in de overeenkomstige putten om een eindconcentratie van 200 μM te verkrijgen.
  4. Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C en 5% CO2.
  5. Verwijder met een meerkanaalspipet het medium zonder de aangesloten BMM te verstoren en breng het over op een andere 96-well ronde bodemplaat. Houd dit bord apart.
  6. Voeg 100 μL trypsine toe en pipetteer met een meerkanaalspijl ten minste vijf keer op en neer om de BMM te vernietigen.
  7. Incubeer gedurende niet meer dan 5 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
  8. Pipetteer met een meerkanaalspipet minstens vijf keer op en neer om de organoïden te dissociëren.
  9. Draai 5 min op 300 x g bij RT.
  10. Gooi het bovennatuurlijk weg door de plaat om te keren. Voeg het in stap 6.3 verzamelde medium toe aan de overeenkomstige putjes en resuspend de cellen door 5 keer op en neer te pipetteren.
  11. Voeg de fluorogene sonde toe bij de eindconcentratie van 1 μM. Voeg 1 μL per put toe uit de verdunning van 250 μM en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
    OPMERKING: Voeg de fluorogene sonde niet toe aan de putten die nodig zijn voor de instellingen van het instrument (figuur 2B).
  12. Draai 5 min op 300 x g bij RT.
  13. Resuspend de cellen met 250 μL 0,1 μg/ml DAPI-oplossing. Breng de monsters over in de juiste flowcytometriebuizen, houd de buizen op ijs en ga verder met de analyse.
    OPMERKING: Voeg PBS in plaats van DAPI toe aan de putten die nodig zijn voor de instellingen van het instrument (figuur 2B).
  14. Optimaliseer de instellingen voor voorwaartse en zijdelingse verstrooiingsspanningen op onbevlekte besturings- en laserspanningen voor elke fluorofoor met behulp van mono-gekleurde monsters.
  15. Gebruik een geschikte gating-strategie (figuur 4A) en verzamel minimaal 20.000 gebeurtenissen.
    OPMERKING: 50.000 evenementen hebben de voorkeur. Gedetailleerde acquisitie-instellingen variëren afhankelijk van het gebruikte instrument.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Als een proof of concept van het beschreven protocol werden de crypten verkregen uit de Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 muislijn gebruikt waarin intestinale stamcellen mozaïek GFP-expressie vertonen, die werd vastgesteld door Barker et al., om darmstamcellen10 in eerste instantie te karakteriseren en deze cellen in kaart te brengen op basis van hun GFP-expressie. Daarbij wordt een model geleverd om ROS-niveaus in een specifieke celtypepopulatie te vergelijken op verschillende behandelingen. Een ROS-remmer ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk biedt een stapsgewijs protocol om murine jejunale crypten te isoleren, ze te kweken tot 3D-organoïden en ROS in organoïden te analyseren door een ROS-gevoelige fluorogene sonde te combineren met kwalitatieve microscopiebeeldvorming van hele organoïden en kwantitatieve ROS-meting met behulp van flowcytometrie op afzonderlijke cellen na organoïde dissociatie.

De eerste kritieke stap in deze methode is de extractieprocedure voor crypten. Inderdaad, de kwaliteit van de voorbereiding van c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de subsidie 17-CE14-0022 (i-Stress) van het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Muizen
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)The Jackson Laboratory
Groeicultuurmedium
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)ThermoFisher12634010
B-27 Supplement, minus vitamin AThermoFisher12587010Stock Concentratie: 50x
GlutaMAX (glutamine)ThermoFisher35050038Stock Concentratie: 100x
HepesThermoFisher15630056Stock Concentratie: 1 M
Murine EGFR&D2028-EG-200Stock Concentratie: 500 µg/mL in PBS
murine NogginR&D1967-NG/CFStock Concentratie: 100 µg/mL in PBS
Murine R-spondin1R&D3474-RS-050Stock Concentratie: 50 µg/mL in PBS
N-2 SupplementThermoFisher17502048Stock Concentratie: 100x
Penicilline-Streptomycine (P/S)ThermoFisher15140122Stock Concentratie: 100x (10.000 eenheden/mL penicilline en 10.000 µg/mL streptomycine)
Materiaal
70 µm celstrainerCorning352350
96-well ronde bodemCorning3799
balpuntschaarFine Science Tools GMBH14086-09
CellROX® Deep Red ReagensThermoFisherC10422
DAPI (4’,6-diamidino-2-fenylindole, dihydrochloride) (fluorgene probe)ThermoFisherD1306voorraad bij 10 mg/mL
DPBS 1x geen calcium geen magnesium (DPBS)ThermoFisher14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM geen fenolrood)ThermoFisherA1896701
Hoechst 33342ThermoFisherH3570voorraad bij 10 mg/mL
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)Corning356231na ontvangst o/n in de koelkast ontdooien, 1 uur op ijs bewaren en 500 mL aliquoten maken en bewaren bij -20 °C
µ-Slide 8 Well kamersIbidi80826
N-acetylcysteïne (NAC)SigmaA9165
tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)oplossing (70%wt. In H2O2)Sigma458139
TrypLE Express Enzym (1X), geen fenolrood (trypsine)ThermoFisher12604013
UltraPure 0,5 M EDTA, pH8,0ThermoFisher15575020
Y-27632SigmaY0503Rock-inhibitor te gebruiken om celdood bij weefselontleding tot een minimum te beperken
Programma's en apparatuur
Attune NxT (Flow Cytometer)ThermoFischerFlow cytometer analyzer
Fiji/ImageJhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsafbeeldingengeneratie
FlowJoBD BioscienceFACS analyse
Observer.Z1Zeissconfocal systeem
Opterra (swept-field confocal)Brukerconfocal systeem
high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512Photometricsconfocal systeem
PrismGraphPad Softwarestatistische analyse

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aviello, G., Knaus, U. G. NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article. Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).
  2. Holmström, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  3. vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation. Cell Reports. 35 (1), 108949(2021).
  4. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
  5. Myant, K. B., et al. ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation. Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).
  6. Juhasz, A., et al. NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction. Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).
  7. Aviello, G., Knaus, U. G. ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage. British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).
  8. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Levy, A., et al. Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).
  11. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).
  12. Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death. Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).
  13. Ahn, H. Y., et al. Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides. Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).
  14. Bidaux, G., et al. Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).
  15. Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316(2010).
  16. Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model. Journal of Visualized Experiments. (141), e58450(2018).
  17. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Muizenorgano denflowcytometrieconfocale microscopieorgano dkweekstamcelanalyselive imaging

Gerelateerde artikelen