Ontwerp en ontwikkeling van een model om het effect van aanvullende zuurstof op het cystische fibrose-luchtwegmicrobioom te bestuderen

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om een modelsysteem te ontwikkelen voor het effect van hyperoxie op cystic fibrosis airway microbial communities. Kunstmatig sputummedium emuleert de samenstelling van sputum en hyperoxische cultuuromstandigheden modelleren de effecten van aanvullende zuurstof op microbiële longgemeenschappen.

Samenvatting

Van microbiële gemeenschappen in de luchtwegen wordt gedacht dat ze een belangrijke rol spelen bij de progressie van cystische fibrose (CF) en andere chronische longziekten. Microben zijn van oudsher geclassificeerd op basis van hun vermogen om zuurstof te gebruiken of te verdragen. Aanvullende zuurstof is een veel voorkomende medische therapie die wordt toegediend aan mensen met cystische fibrose (pwCF); bestaande studies over zuurstof en het luchtwegmicrobioom hebben zich echter gericht op hoe hypoxie (lage zuurstof) in plaats van hyperoxie (hoge zuurstof) de overwegend aerobe en facultatieve anaerobe microbiële longgemeenschappen beïnvloedt. Om deze kritieke kenniskloof aan te pakken, is dit protocol ontwikkeld met behulp van een kunstmatig sputummedium dat de samenstelling van sputum van pwCF nabootst. Het gebruik van filtersterilisatie, dat een transparant medium oplevert, maakt optische methoden mogelijk om de groei van eencellige microben in suspensieculturen te volgen. Om hyperoxische omstandigheden te creëren, maakt dit modelsysteem gebruik van gevestigde anaerobe kweektechnieken om hyperoxische omstandigheden te bestuderen; in plaats van zuurstof te verwijderen, wordt zuurstof aan culturen toegevoegd door dagelijks serumflessen te sparen met een mengsel van gecomprimeerde zuurstof en lucht. Sputum van 50 pwCF onderging dagelijks sparen gedurende een periode van 72 uur om het vermogen van dit model om differentiële zuurstofcondities te handhaven te verifiëren. Shotgun metagenomische sequencing werd uitgevoerd op gekweekte en niet-gekweekte sputummonsters van 11 pwCF om het vermogen van dit medium te verifiëren om de groei van commensale en pathogene microben te ondersteunen die vaak worden aangetroffen in cystic fibrosis sputum. Groeicurven werden verkregen uit 112 isolaten verkregen van pwCF om het vermogen van dit kunstmatige sputummedium te verifiëren om de groei van veel voorkomende cystische fibrose pathogenen te ondersteunen. We vinden dat dit model een breed scala aan pathogenen en commensalen in CF-sputum kan kweken, een gemeenschap herstelt die sterk lijkt op ongecultiveerd sputum onder normoxische omstandigheden en verschillende kweekfenotypen creëert onder verschillende zuurstofomstandigheden. Deze nieuwe aanpak kan leiden tot een beter begrip van onverwachte effecten veroorzaakt door het gebruik van zuurstof in pwCF op microbiële gemeenschappen in de luchtwegen en veel voorkomende respiratoire pathogenen.

Inleiding

Cystic fibrosis (CF) is een genetische ziekte die wordt gekenmerkt door een onvermogen om dik slijm uit de longen te verwijderen, wat leidt tot herhaalde infecties en progressieve achteruitgang van de longfunctie die vaak resulteert in de noodzaak van longtransplantatie of de dood. Het luchtwegmicrobioom van mensen met cystische fibrose (pwCF) lijkt de ziekteactiviteit te volgen¹, met een vermindering van microbiële diversiteit geassocieerd met nadelige langetermijnresultaten^2,3. In klinische studies van pwCF is aanvullende zuurstoftherapie in verband gebracht met meer geavanceerde ziekte^4,5, hoewel traditioneel het gebruik van zuurstoftherapie wordt gezien als eenvoudigweg een marker voor de ernst van de ziekte⁶. Recente studies van een klinische studie van patiënten met respiratoire insufficiëntie hebben aangetoond dat hogere zuurstofniveaus van patiënten paradoxaal genoeg geassocieerd zijn met een toename van ernstige bacteriële infecties en hogere mortaliteit⁷, wat suggereert dat aanvullende zuurstof kan bijdragen aan de pathogenese van de ziekte. Het effect van aanvullende zuurstof op het cystic fibrosis longmicrobioom en de bijbehorende long- en luchtwegmicrobiële gemeenschappen is niet goed bestudeerd.

Mechanistische studies kunnen vaak niet rechtstreeks op menselijke proefpersonen worden uitgevoerd vanwege logistieke problemen en mogelijke ethische problemen in verband met interventies met onbekend medisch voordeel of schade. Translationele benaderingen die menselijke biospecimens integreren in modelsystemen kunnen in deze gevallen belangrijke biologische inzichten bieden. Hoewel het vermogen om zuurstof te gebruiken of te verdragen van oudsher een belangrijk onderdeel is van microbiële classificatie, is er weinig bekend over hoe de therapeutische introductie van aanvullende zuurstof in het milieu microbiële gemeenschappen in de luchtwegen zou kunnen verstoren. Om licht te werpen op de onbekende effecten van extra zuurstof op de luchtwegmicrobiomen van pwCF, moesten we twee grote uitdagingen aanpakken; ten eerste, de creatie van een kweekmedium dat fysiologisch de samenstelling van CF-sputum benadert; ten tweede, de creatie van een modelsysteem dat het mogelijk maakt om gedurende langere tijd verhoogde zuurstofconcentraties in cultuur te behouden.

Kunstmatige sputummedia (ASM) worden veel gebruikt om longsputum ex vivo^8,9,10na te bootsen, maar er is geen duidelijke consensus over een specifiek recept. Dit protocol beschrijft een recept en bereidingsstrategie voor kunstmatig sputummedium, zorgvuldig ontworpen om sputum van pwCF fysiologisch te benaderen. Tabel 1 geeft een overzicht van de gekozen receptwaarden op basis van gepubliceerde literatuur. Chemische basiscomponenten en pH werden gematcht met waarden geïdentificeerd door studies van menselijk CF-sputum^11,12,13. Fysiologische voedingsstoffen met een lage concentratie werden toegevoegd met behulp van eigeel, dat werd opgenomen als 0,25% van het uiteindelijke volume¹⁰, evenals vitamine- en sporenmetaalmengsels^14,15. Mucine, het belangrijkste bestanddeel van sputum¹⁶, werd opgenomen bij 1% w / v¹⁴. Hoewel arbeidsintensiever, werd filtersterilisatie gekozen boven de meer conventionele praktijk van warmtesterilisatie om potentiële problemen door warmte-geïnduceerde denaturatie van essentiële mediacomponenten te verminderen¹⁰. Een bijkomend voordeel van filtersterilisatie is dat het media genereert die transparant zijn (warmtesterilisatie kan troebele media creëren als gevolg van precipitatie en coagulatie van zouten en eiwitten), waardoor dit kunstmatige sputummedium kan worden gebruikt om microbiële groei te volgen op basis van toename van troebelheid.

Dit modelsysteem voor de hyperoxische cultuur is gebaseerd op anaerobe kweektechnieken waarbij zuurstof wordt toegevoegd in plaats van verwijderd, waardoor een model ontstaat voor het effect van aanvullend zuurstofgebruik voor pwCF. Figuur 1 en het bijbehorende zuurstofsparende protocol schetst de componenten van een zuurstofspaarsysteem, dat tegen lage kosten kan worden verkregen bij leveranciers van algemene laboratoria en ziekenhuizen. Dit systeem maakt het mengen van gecomprimeerde zuurstof en lucht tot vaste concentraties variërend van 21% -100% zuurstof mogelijk. De integratie van een zuurstofsensor maakt het mogelijk om de concentratie van het uitgaande gasmengsel te verifiëren en de uitstroomgassamenstelling van eerder gespargeerde serumflessen te controleren om te controleren of de zuurstofcondities binnen het gewenste bereik zijn gehouden.

Dit protocol schetst procedures voor het creëren van een kunstmatig sputummedium, de constructie en het gebruik van een zuurstofspaarsysteem en de toepassing van beide om CF-sputum te kweken onder differentiële zuurstofomstandigheden.

Protocol

Deze studie kreeg goedkeuring van de Partners Institutional Review Board (Protocol # 2018P002934). Inclusiecriterium omvatte volwassen patiënten met cystische fibrose die schriftelijke geïnformeerde toestemming gaven voor het onderzoek. Er was geen uitsluitingscriterium. Volgens protocolrichtlijnen werden alle sputummonsters verzameld van patiënten met cystische fibrose tijdens een gepland poliklinisch bezoek aan hun klinische zorgverlener.

1. Kunstmatige sputum medium voorbereiding

OPMERKING: De hier vermelde hoeveelheden zijn voor de productie van 1 l kunstmatig sputumhoudend eindmedium en gaan uit van de specifieke reagentia die in de materialentabelworden vermeld. De nummers moeten worden aangepast voor andere volumes of voor het gebruik van verschillende reagentia om hetzelfde eindproduct te garanderen. Zie tabel 1 voor streefconcentraties.

1. Kunstmatige sputum chemische mix (ASCM)
   OPMERKING: ASCM maakt 25% uit van het uiteindelijke medium volume. Het is houdbaar en kan in bulk of van tevoren worden bereid. Als het wordt voorbereid voor later gebruik, autoclaaf het chemische mengsel en bewaar het veilig bij kamertemperatuur.
   1. Meng de samenstellende chemische stamoplossingen.
      1. Bereid 1 M NaCl-bouillon voor: voeg 58,44 g NaCl per liter steriel water toe.
      2. Bereid 1 M KCl bouillon voor: Voeg 74,55 g KCl per liter steriel water toe.
      3. Bereid 1 M MgSO₄ bouillon: Voeg 246,47 g MgSO₄·7H₂O per liter steriel water toe, of 120,37 g watervrij MgSO4 per liter steriel water.
      4. Bereid 1 M glucosevoorraad voor: Voeg 180,16 g glucose per liter steriel water toe.
   2. Autoclaaf steriliseert de chemische stamoplossingen, evenals een lege fles van 250 ml. Voer de autoclaveerstappen uit tot ten minste standaardwaarden van 121 °C en 15 PSI gedurende 30 minuten.
   3. Voeg 80,59 ml steriel water toe aan de lege fles van 250 ml.
   4. Voeg 152,30 ml 1 M NaCl bouillon toe aan het mengsel.
   5. Voeg 15,8 ml bouillon van 1 M KCl toe aan het mengsel.
   6. Voeg 610 μL van 1 M MgSO₄ bouillon toe aan het mengsel.
   7. Voeg 700 μL 1 M glucosebouillon toe aan het mengsel.
2. Kunstmatige sputum mucine mix (ASMM)
   OPMERKING: ASMM maakt 50% uit van het uiteindelijke medium volume. Zorg ervoor dat het op dezelfde dag wordt bereid als de laatste medium batch.
   1. Voeg 450 ml steriel water toe aan een lege fles van 1 liter.
   2. Voeg 50 ml 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de fles.
   3. Voeg een magnetische roerstaaf voor eenmalig gebruik toe aan de fles.
   4. Autoclaaf de fles met PBS en de roerstaaf.
   5. Meet 10 g mucinepoeder af en voeg het toe aan de PBS.
   6. Schud de fles krachtig voor voorafgaande menging.
   7. Plaats de fles op een hete plaat met een magneetroerder. Stel het vuur in op middelhoog richten op 50 °C en roersnelheid op 1100 tpm. Verhoog de snelheid geleidelijk zodat de stang niet van de magneet vliegt.
      1. Laat 15 min verwarmen en roeren.
      2. Pak de fles op met hittebestendige handschoenen. Observeer om te controleren of mucinepoeder uit de oplossing bezinkt.
      3. Als mucinepoeder niet volledig is opgelost, breng de fles dan terug naar de hitte / roerder gedurende intervallen van 5 minuten totdat deze volledig is opgelost.
   8. Laat het mucinemengsel afkoelen tot kamertemperatuur.
3. Kunstmatige sputum biologische mix (ASBM)
   OPMERKING: ASBM is 25% van het uiteindelijke medium volume. Bereid het op dezelfde dag als de laatste medium batch, en in tegenstelling tot de andere mixen, stel de componenten niet bloot aan enige hitte.
   1. Ontdooi de 100x vitaminebouillon in een koelkast van 4 °C of op ijs.
      OPMERKING: Portioneer de vitaminevoorraad voor in 10 ml aliquots om het aantal vries- / dooicycli te minimaliseren.
   2. Voeg 124,24 ml steriel water toe aan de lege geautoclaveerde fles van 250 ml.
   3. Voeg 25,76 ml 50x essentiële aminozuurbouillon toe aan de mix.
   4. Voeg 80,14 ml 100x niet-essentiële aminozuurvoorraad toe aan de mix.
   5. Voeg 10 ml (ontdooide) 100x vitaminebouillon toe aan de mix.
   6. Voeg 1 ml 1000x sporenmetaalvoorraad toe aan het mengsel.
   7. Voeg 8,33 ml 30% eigeel-emulsie toe aan het mengsel.
   8. Voeg 400 μL van 10 g/L ferritinebouillon toe aan het mengsel.
   9. Meng de oplossing goed door handmatig te schudden.
4. Kunstmatig sputummedium (ASM)
   1. Voeg 250 ml ASCM toe aan de fles van 1 l met ASMM.
   2. Voeg 250 ml ASBM toe aan de middelgrote fles.
   3. Titreer het medium met basis MOPS-buffer (1 M) om een pH van 6,3 te bereiken op een smal pH-papier. Voorafgaand aan de titratie zal het mediummengsel te zuur zijn.
   4. Koel het resulterende kunstmatige sputummedium bij 4 °C totdat het klaar is voor filtratie.
   5. Om het filtratieproces te starten, brengt u 200 ml ongefilterd kunstmatig sputummedium over naar een vacuümfiltratiesysteem met een poriegroottefilter van 0,22 μm.
   6. Sluit het filtersysteem aan op de vacuümpomp, zet de vacuümpomp aan, stel deze in op 70 mbar en plaats de kamer vervolgens op een orbitale shaker die met 90 tpm schudt in een koude ruimte bij 4 °C.
      1. Vul af met nog eens 150 ml van het medium als een aanzienlijke hoeveelheid wordt gefilterd. Het duurt 1-2 dagen om 1 L medium volledig te filteren.
      2. Herhaal dit met extra kamers totdat alle media zijn gefilterd.
         OPMERKING: Probeer niet meer dan 350 ml van het medium door hetzelfde filter van 0,22 μm te filteren, omdat mucine het filter na verloop van tijd zal afsluiten.
   7. Koel gefilterd kunstmatig sputummedium bij 4 °C tot het klaar is voor gebruik. Gebruik ASM binnen een maand na voorbereiding voor het beste resultaat.

2. Zuurstof sparen

1. Sparging station setup
   OPMERKING: Dit protocol hoeft slechts één keer volledig te worden uitgevoerd, waarna de installatie kan worden onderhouden door eenvoudig onderhoud indien nodig. Zie figuur 1 voor een visueel schema van het zuurstofsparende systeem.
   1. Verkrijg en beveilig de perslucht- en zuurstoftanks goed.
      LET OP: Hoge druk maakt de tanks extreem gevaarlijk wanneer ze verkeerd worden behandeld. Zorg ervoor dat de tanks volledig zijn afgedicht en beveiligd, dat er geen lekken zijn wanneer de tank gesloten is en dat al het behandelend personeel volledig is opgeleid in het gebruik ervan.
   2. Bevestig een luchtregelaar aan de persluchttank met een moersleutel. Voor een optimale stroomaflezing op de regelaar bevestigt u de regelaar zo dicht mogelijk bij een rechtopstaande positie.
   3. Bevestig een zuurstofregelaar aan de gecomprimeerde zuurstoftank en bevestig zo dicht mogelijk bij een rechtopstaande positie. Afhankelijk van de zuurstoftank kan het nodig zijn om de richting om aan te draaien om te keren.
   4. Sluit de buizen van de regelaars aan op een Y-connector om de gasstroom uit de twee tanks te combineren.
   5. Sluit de uitgang van de Y-connector aan op de centrale T-junctieklep.
   6. Sluit een kant van de centrale T-junctieklep aan op een gasdrukmeter.
   7. Sluit de andere kant van de gasdrukmeter aan op een steriel spuitfilter met een diameter van 25 mm met een poriegrootte van 0,22 μm.
   8. Bevestig een tweede spuitfilter met een diameter van 25 mm aan een spuit zonder zuiger om te worden gebruikt als gasafgifte tijdens het sparren.
   9. Sluit de laatste zijde van de centrale T-junctieklep aan op een tweede T-junctieklep voor de zuurstofmonitor.
   10. Sluit een spuitfilter met een diameter van 25 mm aan op de ene kant van deze tweede T-junctieklep, samen met slangen om naalden van 18 G te bevestigen.
   11. Sluit de laatste zijde van de tweede T-junctieklep aan op het zuurstofbewakingsapparaat.
   12. Sluit een afsnijbuis aan op de andere kant van het zuurstofbewakingsapparaat om te worden gebruikt als gasafgifte tijdens de bewaking.
       LET OP: Let bij het testen/gebruiken van het zuurstofsparende systeem goed op de positie van de T-juncties en zorg ervoor dat deze overeenkomt met het beoogde pad door het systeem. Als u dit niet doet, zal dit resulteren in drukopbouw in het systeem en ervoor zorgen dat componenten falen en uit elkaar vallen.
   13. Voor het onderhoud van het systeem en om het optimaal te laten werken, zijn de volgende praktijken gunstig.
       1. Versterk de verbindingen met royale hoeveelheden teflontape om hun afdichting aanzienlijk te verbeteren en de kans te verkleinen dat componenten loskomen van de interne druk.
       2. Houd het gecombineerde debiet onder de 10 l/min om de maximale druk te verminderen en storingen te voorkomen.
       3. Als een lek wordt vermoed, gebruik dan een reinigingsmiddeloplossing zoals in de handel verkrijgbare vloeistoflekdetectoren om de locatie gemakkelijk te identificeren, omdat deze boven eventuele gaslekken zal borrelen. Patch lekken met behulp van een polytetrafluorethyleen tape (bijv. Teflon).
       4. Vervang de spuitfilters met een diameter van 25 mm tweewekelijks in het zuurstofsparende systeem, maar dit varieert met de gebruiksfrequentie. Na verloop van tijd verminderen deeltjes die in het filter worden gevangen het gasdebiet en veroorzaken drukopbouw.
       5. Kalibreer de zuurstofmonitor op 21% zuurstof perslucht voordat u metingen uitvoert.
       6. Na voltooiing van het systeemgebruik schakelt u de tanks uit en laat u het overtollige gas van de regelaars ontluchten totdat de stroom volledig stopt.
2. Serumfles cultuur sparging
   1. Etiketteer 500 ml geautoclaveerde serumflessen met monsteridentificaties, datum / tijd van inenting en doelzuurstofpercentage.
   2. Voeg in een biologische kap 24 ml van het kunstmatige sputummedium toe aan elke serumfles die wordt opgezet.
   3. Voeg 1 ml van het sputum van de patiënt gehomogeniseerd met een naald van 18 G (indien nodig verdund met steriele zoutoplossing om voldoende monstervolume voor elke kweekconditie te verkrijgen) toe aan elke serumfles.
   4. Gebruik een steriel pincet en plaats de geautoclaveerde rubberen stoppen op de bovenkant van elke serumfles.
   5. Druk de rubberen stoppen naar beneden, zorg ervoor dat u de onderkant van de stop niet met de handen aanraakt.
   6. Haal de flessen van de kap, breng de aluminium afdichtingen aan en krimp ze. Verwijder het middenstuk van de afdichtingen.
   7. Veeg de bovenkant van flessen af met een alcoholdoekje en haal ze door een Bunsen-brandervlam.
   8. Bevestig een steriele naald van 18 G op een zuigerloze spuit met een filter. Steek deze gasafgifte eerst in de fles.
   9. Bevestig een steriele 18-G naald op de gasafgifte van het systeem en steek de gasafgiftever ook in de fles.
   10. Leid de T-splitsingen van de tanks door de zuurstofmonitor. Controleer of de beoogde zuurstofconcentratie door het systeem stroomt. Richt u op ongeveer 5 l/min gasstroom.
   11. Leid de T-splitsingen van de tanks om naar de gasafgifte. Het gas begint door de serumfles te stromen.
       LET OP: Let goed op de manometer tijdens het zuurstofsparen. Als de druk onverwacht toeneemt, sluit u het systeem onmiddellijk uit.
   12. Laat de zuurstofspaan gedurende 1 min door de serumfles lopen. Bij 5 L/min zorgt dit voor 10 luchtuitwisselingen en zorgt ervoor dat de interne atmosfeer de gewenste partiële druk bereikt.
   13. Verwijder de gasafgifte 18-G naald.
   14. Laat de druk in de serumfles opbouwen tot +1 atmosfeer (2 atmosferen op zeeniveau) en verwijder vervolgens onmiddellijk de gasafgiftever.
       OPMERKING: Het handhaven van druk helpt bij het vasthouden van hyperoxische omstandigheden in de loop van de tijd.
   15. Plaats de serumfles in een incubator shaker van 37 °C bij 150 RPM. Incubeer de monsters gedurende drie intervallen van 24 uur. Neem bij elk interval van 24 uur een aliquot voor downstream-analyse, spaar de monsters opnieuw en breng ze terug naar incubatie voor een totale incubatietijd van 72 uur.
3. Uitstroom zuurstofmeting
   1. Kalibreer de zuurstofmeter op 21% perslucht en schakel vervolgens de tank uit.
   2. Leid de inname van de serumfles door de zuurstofmonitor en bevestig een steriele naald aan het uiteinde.
   3. Steek de naald door de rubberen stop in de serumfles.
   4. Wacht tot de uitstroommeting is gestabiliseerd. Een laag debiet uit de serumflessen betekent dat dit tot 2 minuten kan duren. Rapporteer het piekverschil met kamerlucht (aantal het verst van 21%).
   5. Als u meerdere metingen uitvoert, spoelt u het systeem tussen de metingen door met perslucht.

Resultaten

Deze protocollen werden toegepast op 50 slijmoplossende sputummonsters van pwCF die zich presenteerden voor routinezorg aan een poliklinische cystic fibrosis-kliniek in het Massachusetts General Hospital in Boston, Massachusetts. Het sputum van elke patiënt werd gekweekt onder 21%, 50% en 100% zuurstofcondities met behulp van het kunstmatige sputummedium, met 0,5 ml aliquots uit elke cultuur na 24 uur, 48 uur en 72 uur kweektijd voor testen. Culturen werden gefotografeerd wanneer extracties werden gemaakt om visuele vera...

Discussie

In deze studie werd een in vitro model ontwikkeld om het effect van hyperoxie op microbiële longgemeenschappen te bestuderen. Dit model, gebaseerd op kunstmatig sputummedium en dagelijks sparen van serumflessen, handhaaft verhoogde zuurstofconcentraties en ondersteunt de groei van microben geïdentificeerd in sputum van pwCF.

Er zijn verschillende kritische stappen van deze aanpak. Ten eerste is de keuze om filtersterilisatie te gebruiken in plaats van warmtesterilisatie van het kunstm...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BME Vitamins (100x) Solution	MilliporeSigma	B6891	Geconcentreerde oplossing van aanvullende vitaminen.
Crimper, 30 mm	DWK Life Sciences	224307	Crimper voor het bevestigen van aluminium afdichtingen op serumflessen.
D-(+)-Glucose	MilliporeSigma	G7021	Vaste glucosepoeder (dextrorotatorisch isomer).
Diaphragm Pump ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	Vacuumpomp voor vacuümfiltratie.
Egg Yolk Emulsion	HiMedia	FD045	Steriele emulsie van 30% eigeel in zoutoplossing.
Ferritin, Cationized from Horse Spleen	MilliporeSigma	F7879	Ferritine (ijzeropslag-eiwit) oplossing.
FIREBOY plus Safety Bunsen Burner	Integra Biosciences	144000	Bunsenbrander met gebruikersinterface en veiligheidsfuncties.
Hydrion pH Paper (1.0–14.0)	Micro Essential Laboratory	94	pH-testpapier voor het bereik van 1.0–14.0.
Hydrion pH Paper (4.0–9.0)	Micro Essential Laboratory	55	pH-testpapier voor het bereik van 4.0–9.0.
Hydrion pH Paper (6.0–8.0)	Micro Essential Laboratory	345	pH-testpapier voor het bereik van 6.0–8.0.
Hypodermic Needle-Pro EDGE Safety Device, 18 G	Smiths Medical	401815	18 G naalden met veiligheidsdoppen.
In-Line Pressure Gauge	MilliporeSigma	20469	Gasdrukmeter voor het bewaken van de flesdruk.
Innova 42 Incubated Shaker	Eppendorf	2231000756	Gecombineerde incubator/orbitale shaker.
Luer-Lok Syringe with Attached Needle	Becton Dickinson	309580	Gecombineerde 3 mL spuit en 18 G naald.
Luer Valve Assortment	World Precision Instruments	14011	Ventielen voor gasstroombuis.
LSE Orbital Shaker	ThermoFisher Scientific	6780-NP	Orbitale shaker om media tijdens filtratie te agiteren.
Magnesium Sulfate Heptahydrate	MilliporeSigma	M2773	Vaste Epsom-zout (magnesiumsulfaat heptahydraat).
Medical Air Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-346-15FM	Luchtstroomsnelheidsregelaar met 15 L/min meter.
MEM Amino Acids (50x) Solution	MilliporeSigma	M5550	Geconcentreerde oplossing van essentiële aminozuren.
MEM Non-Essential Amino Acids (100x) Solution	MilliporeSigma	M7145	Geconcentreerde oplossing van niet-essentiële aminozuren.
Millex-GP Filter, 0.22 µm	MilliporeSigma	SLMP25SS	0,22 µm polyethersulfone membraan steriele spuitfilter.
Milli-Q Academic	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Milli-Q steriele waterfiltratiesysteem.
MiniOX 3000 Oxygen Monitor	MSA	814365	Gasstroomsnelheidsmonitor voor zuurstofpercentage.
MOPS Buffer (1 M, pH 9.0)	Boston BioProducts	BBM-90	MOPS-buffer voor het aanpassen van media pH.
Mucin from Porcine Stomach	MilliporeSigma	M2378	Mucine (geglycosyleerd gel-vormend eiwit) poeder.
Natural Polypropylene Barbed Fitting Kit	Harvard Apparatus	72-1413	Connectors voor gasstroombuis.
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1096	Bibliotheekvoorbereiding voor identificatie tijdens sequencing.
NovaSeq 6000 Sequencing System	Illumina	770-2016-025-N	Shotgun sequencing platform voor het genereren van steekproeflezen.
Oxygen Single Stage Regulator with Flowmeter	Western Enterprises	M1-540-15FM	Zuurstofstroomsnelheidsregelaar met 15 L/min meter.
Oxygen Tubing with 2 Standard Connectors	SunMed	2001-01	Buis voor het verbinden van gassysteemcomponenten.
Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4	Molecular Biologicals International	MRGF-6235	Geconcentreerde fosfaat-gebufferde zoutoplossing.
PC 420 Hot Plate/Stirrer	Marshall Scientific	CO-PC420	Gecombineerde hot plate/roerder.
Potassium Chloride	MilliporeSigma	P9541	Vaste kaliumchloridezout.
PTFE Disposable Stir Bars	ThermoFisher Scientific	14-513-95	Weggeefbare magnetische roerstaven.
PTFE Thread Seal Teflon Tape	VWR	470042-938	Teflon tape voor het versterken van gassysteemverbindingen.
Q-Gard 2 Purification Cartridge	MilliporeSigma	QGARD00D2	Zuiveringscartridge voor Milli-Q-systeem.
Reusable Media Storage Bottles	ThermoFisher Scientific	06-423A	Flessen voor het mengen en opslaan van kweekmedia.
Rubber Stopper, 30 mm, Gray Bromobutyl	DWK Life Sciences	224100-331	Rubberen stoppen voor serumflessen.
Serum Bottle with Molded Graduations, 500 mL	DWK Life Sciences	223952	Glas serumflessen voor verzegelde cultuur.
Small Bore Extension Set	Braun Medical	471960	Buisverlenging met luer lock connectoren.
Sodium Chloride	MilliporeSigma	S3014	Vaste natriumchloridezout.
Spike-in Control I (High Microbial Load)	ZymoBIOMICS	D6320	Spike-in microben (I. halotolerans en A. halotolerans) voor absolute microbiële belastingsberekeningen
Stericup Quick Release Sterile Vacuum Filtration System	MilliporeSigma	S2GPU02RE	250 mL 0,22 µm vacuümfiltratiekamer.
Super Sani-Cloth Germicidal Disposable Wipes	Professional Disposables International	H04082	Weggeefbare germicide doekjes voor sterilisatie.
Trace Metals Mixture, 1000x