Een high-throughput protocol voor de oppervlaktesterilisatie van Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) zaden wordt geleverd, waarbij de vloeistofbehandelingsstappen worden geoptimaliseerd met een eenvoudig zuigapparaat dat is gebouwd met een vacuümpomp. Honderden zaadmonsters kunnen op één dag aan de oppervlakte worden gesteriliseerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
High-throughput, robuuste en zeer tijdflexibele methode voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Arabidopsis is veruit de plantenmodelsoort die het meest wordt gebruikt voor functionele studies. De oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden is een fundamentele stap die nodig is om dit doel te bereiken. Het is dus van het grootste belang om arabidopsis-zaadoppervlaksterilisatiemethoden met hoge doorvoer vast te stellen om tientallen tot honderden monsters (bijv. Transgene lijnen, ecotypen of mutanten) tegelijk te verwerken. Een sterilisatiemethode voor zaadoppervlakken op basis van de efficiënte eliminatie van vloeistof in buizen met een zelfgemaakte zuiginrichting die is opgebouwd uit een gemeenschappelijke vacuümpomp, wordt in deze studie gepresenteerd. Door de arbeidsintensieve hands-on tijd drastisch te verminderen met deze methode is het verwerken van enkele honderden monsters op één dag mogelijk met weinig moeite. Serie-tijdsverloopanalyses wezen verder op een zeer flexibel tijdsbereik van oppervlaktesterilisatie door hoge kiemsnelheden te handhaven. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast voor oppervlaktesterilisatie van andere soorten kleine zaden met eenvoudige aanpassing van het zuigapparaat op basis van de zaadgrootte en de gewenste snelheid om de vloeistof te elimineren.
Inleiding
Arabidopsis is een diploïde plantensoort uit de familie Brassicaceae. De relatief korte levenscyclus (twee maanden per generatie onder lange dag groeiomstandigheden), kleine plantgrootte en zelfbestuiving met de productie van honderden zaden per plant hebben het de eerste fundamentele plantmodelsoortgemaakt 1,2. Bovendien was het genoom volledig gesequenced3,uitgebreide reverse genetica-instrumenten (verzadigd T-DNA, transposon en chemisch gemuteerde populaties) zijn beschikbaar4,5,6,en effectieve Agrobacterium-gemedieerdetransformatie is goed ingeburgerd om voldoende transgene lijnen te verkrijgen voor verder stroomafwaarts werk7 . Zo zijn er in de afgelopen twee decennia grote vorderingen gemaakt met arabidopsis als modelsoort om verschillende aspecten van de plantenbiologie op moleculair niveau te ontleden, waaronder natuurlijke, genetische en fenotypische variatie8,9.
Om genen van belang in Arabidopsis functioneel te karakteriseren, is sterilisatie van het zaadoppervlak om schimmel- en bacteriële verontreinigingen te elimineren de vereiste stap voor veel stroomafwaartse protocollen die axeenculturen vereisen. Genetische transformatie voor de overexpressie10, knock-down (RNA-I11) of knock-out (genoombewerking12,13) van genfunctie, subcellulaire lokalisatie14, promotoractiviteit15,16, eiwit-eiwit17 en eiwit-DNA-interactie18, om alleen de meest voorkomende toepassingen te noemen, vereisen allemaal een sterilisatiestap voor het zaadoppervlak. Ondanks de relatieve eenvoud speelt sterilisatie van het zaadoppervlak dus een fundamentele rol in veel functionele analyses.
Tot nu toe zijn twee belangrijke categorieën sterilisatiemethoden voor zaadoppervlakken ontwikkeld op basis van gas- of vloeistoffasesterilisatie19. Hoewel de doorvoer van gasfase zaadoppervlaksterilisatie gemiddeld tot hoog is, heeft het gebruik van het gevaarlijke reagens chloorgas als oppervlaktesterilisatiemiddel de brede toepassing ervan belemmerd. Methoden op basis van vloeistoffasesterilisatie vertrouwen daarentegen op mildere chemicaliën zoals ethanol en bleekoplossingen voor oppervlaktesterilisatie, en ze worden op grotere schaal gebruikt ondanks dat ze een inherent lagere doorvoer hebben dan chloorontsmetting. Over het algemeen worden vaak twee verschillende methoden gebruikt die vloeibare reagentia gebruiken. Een veel gebruikte methode is gebaseerd op wassen met ethanol en bleekmiddel in verschillende concentraties gedurende verschillende tijdsduur20,21. Een andere methode is gebaseerd op de toepassing van bleekmiddel slechts21,22. Beide methoden worden voornamelijk toegepast voor kleinschalige sterilisatie van zaadoppervlakken. In veel experimenten is het echter noodzakelijk om veel Arabidopsis transgene lijnen afgeleid van één transformatie15,23 te screenen of parallel veel transgene lijnen te screenen die zijn gegenereerd uit verschillende transformaties24,25. Voor zover wij weten, is er geen op vloeistof gebaseerde methode voor sterilisatie van zaadoppervlakken met hoge doorvoer gepubliceerd, wat, hoewel weinig erkend, een belangrijk knelpunt vormt voor functionele genomica-benaderingen. Daarom is het ontwikkelen van veilige, robuuste en high-throughput methoden voor sterilisatie van zaadoppervlakken een noodzakelijke en kritieke stap naar het succes van de functionele karakterisering van veel genen tegelijk.
Hiertoe wordt in de huidige studie een verbeterde methode voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden gepresenteerd. Deze methode is veilig, goedkoop, zeer robuust en met een hoge doorvoer, waardoor 96 onafhankelijke lijnen binnen een uur vanaf het begin van de sterilisatie van het zaadoppervlak tot het einde van het zaaien in petrischalen kunnen worden verwerkt. De gedemonstreerde methode is gebaseerd op algemeen beschikbare, elementaire laboratoriuminstrumenten zoals een vacuümpomp, consumeerbaar glaswerk en plastic waren. Deze verbeterde methode biedt de wetenschappelijke gemeenschap een veilige, eenvoudige en betaalbare aanpak om de sterilisatie van zaadoppervlakken te stroomlijnen met een doorvoer die voldoende is voor moderne functionele genomica-benaderingen in Arabidopsis en andere niet-modelplantensoorten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Reagentia en mediavoorbereiding
- Bereid 70% ethanoloplossing voor: Voeg 737 ml 95% technische ethanol toe aan 263 ml gedestilleerd water. Meng.
OPMERKING: Bereid 70% ethanoloplossing op een niet-steriele werkbank.
LET OP: Ethanol is licht ontvlambaar en kan ernstige irritatie aan de ogen veroorzaken. Uit de buurt van vlammen en warmtebronnen houden. In geval van contact met de ogen, spoel met overvloedig water. - Bereid 5% bleekoplossing voor: Voeg 5 ml huishoudelijk bleekmiddel (met ~ 3,5% natriumhypochloriet, NaClO) toe aan 95 ml steriel gedestilleerd water. Voeg een paar druppels niet-ionisch wasmiddel toe (bijv. Tween 20) en meng grondig.
OPMERKING: Bereid 5% bleekoplossing in de laminaire kap.
LET OP: Natriumhypochloriet, het actieve bestanddeel van bleekmiddel, is zeer irriterend. Het is zeer corrosief en kan ernstige schade aan het maagdarmkanaal veroorzaken. In geval van contact, onmiddellijk spoelen met overvloedig water. In geval van inname, bel het antigifcentrum of een arts voor behandelingsadvies. - Bereid halfsterkte Murashige en Skoog (1/2 MS) medium26.
- Voeg 2,2 g MS medium poeder (inclusief vitaminen) en 10 g sucrose toe aan 800 ml gedestilleerd water. Pas de pH van de oplossing aan met 1 M KOH en breng het volume met gedestilleerd water op 1 L. Aliquot 500 ml in een fles van 1 l en voeg 4 g agar toe om een vast medium te bereiden. Autoclaaf de oplossing.
- Koel het medium na het autoclaveren af tot 50-53 °C in een waterbad en giet het in petrischalen onder de laminaire stromingskap. Om het selectieve medium te bereiden, voegt u 1000 μL / L van 50 mg / ml kanamycine-stamoplossing toe (meng 500 mg kanamycinesulfaatmonohydraat in 10 ml gedestilleerd water, filtersteriliseer en bewaar bij -20 ° C) op het medium (50-53 ° C). Meng goed door te wervelen en giet in petrischaaltjes zoals eerder vermeld.
2. Aspirator instellen
OPMERKING: De opstelling van het instrument is samengevat in figuur 1.
- Sluit de inlaat van de vacuümpomp aan op het ene uiteinde van een polyethyleen (PE) buis van geschikte grootte. Sluit het andere uiteinde van de buis aan op de uitlaat van het tweerichtingsdeksel van de decantatiefles. Wikkel de verbinding van de buis stevig in met eenafdichtingsfolie (Table of Materials)om een luchtdichte verbinding te garanderen.
- Sluit een tweede PE-buis aan op de inlaat (het gat dat aan de binnenkant van de fles uitsteekt) van de schroefdop op de decantatiefles. Plaats de andere kant van de buis op de uitlaat van een aquariumklep. Wikkel indien nodig met een afdichtingsfolie langs de kruising om luchtlekkage te elimineren.
- Plaats vlak voor gebruik een steriele pipetpunt van 200 μL op de inlaat van het aquariumfilter onder de laminaire stroomkap.
Figuur 1: Schematische tekening van de zuiginrichting voor verwijdering van sterilisatievloeistoffen met hoge doorvoer. Voor de duidelijkheid, de afzonderlijke delen zijn niet op schaal getekend. Letter (A) geeft de vacuümpomp aan, (B) de reservoirfles om vloeistoffen (ethanol, bleekmiddel of steriel water) op te vangen), (C) de klep om reflux van de vloeistoffen te voorkomen, (D) de steriele pipetpunt van 200 μL en (E) de microcentrifugebuis van 1,5 ml die zaden en sterilisatievloeistof bevat. Pijlen geven de richting van de luchtstroom aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. High-throughput vloeistof oppervlakte sterilisatie van zaden
OPMERKING: De algemene procedure en minimale tijd die nodig is voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis thaliana (L.) Heynh wild-type (Col-0) (Arabidopsis) zaden met 96 onafhankelijke monsters zijn samengevat in figuur 2.
- Label met een permanente marker twee batches van 48 x 1,5 ml microcentrifugebuizen met progressieve nummers.
- Voeg 100-200 Arabidopsis-zaden toe aan elk van de 96 steriele microcentrifugebuizen van 1,5 ml (ongeveer 1-2 mm boven de bodem van het conische uiteinde van de buis).
- Gebruik ongeveer 1000 μL 70% ethanol in elke buis met behulp van een steriele serologische pipet van 10 ml in de laminaire stroomkap (zaadbatch één, 48 buizen) en sluit de deksels voorzichtig.
OPMERKING: Het doseren van de oplossingen hoeft niet extreem nauwkeurig te zijn, zolang het afgegeven volume meerdere malen hoger is dan het volume zaden. U kunt deze stap ook buiten de laminaire kap uitvoeren (niet-steriele toestand). - Schud de buizen met een oscillatiefrequentie van 8,0 Hz gedurende ten minste 3 minuten in een shaker.
- Haal de adapters uit de shaker en breng ze over in de mand van een benchtop microcentrifuge.
- Draai de zaden snel af met behulp van de pulsfunctie (aanwezig in de meeste benchtop centrifuges) om 1880 x g (~ 15 s) te bereiken.
OPMERKING: Langere tijd of hogere centrifugeerkrachten hebben een negatieve invloed op de kieming van zaden. - Breng de 48 buizen van de adapters over naar één rack en open alle buizen onder de laminaire flowkap. Voorkom verontreinigingen door het deel van de deksels dat in de buizen past niet aan te raken. Als deksels te dicht bij elkaar liggen, verdeel de buizen dan in twee rekken voor eenvoudiger gebruik.
- Plaats een steriele gele punt van 200 μL op de aquariumklepinlaat van de zelfgemaakte aspirator onder de laminaire stroomkap en schakel de pomp in.
- Plaats de gele punt net boven het niveau van de zaden om te voorkomen dat de zaden worden aangeraakt bij het zuigen van de vloeistof. U kunt ook snel de punt aan de onderkant van de buis plaatsen; als een zaadje de zuigkracht van de vloeistof blokkeert, verwijder dan de gele punt en plaats een nieuwe.
- Aliquot in elke buis ongeveer 1000 μL 5% bleekmiddel met behulp van een 10 ml steriele serologische pipet in de laminaire stroomkap.
- Sluit alle deksels goed af en plaats alle buizen terug in de schudadapters. Schud de buizen met een oscillatiefrequentie van 8,0 Hz gedurende ten minste 3 minuten in de shaker.
- Draai de zaden snel af met behulp van de pulsfunctie van de tafelcentrifuge voor de tijd die nodig is om 1880 x g (~ 15 s) te bereiken.
- Plaats een nieuwe steriele gele punt van 200 μL op de aquariumklep die is aangesloten op de vacuümpomp onder de laminaire stroomkap en schakel de pomp in.
- Plaats de gele punt boven het niveau van de zaden om te voorkomen dat de zaden worden aangeraakt bij het zuigen van de bleekoplossing.
- Aliquot in elke buis ongeveer 1000 μL gesteriliseerde H2O met behulp van een 10 ml steriele serologische pipet in de laminaire stromingskap.
OPMERKING: Combineer de twee partijen zaden om de gebruikstijd te minimaliseren. - Plaats een nieuwe steriele gele punt van 200 μL op de aquariumklep die is aangesloten op de vacuümpomp onder de laminaire stroomkap en schakel de pomp in.
- Plaats de gele punt net boven het niveau van de zaden om te voorkomen dat de zaden worden aangeraakt tijdens het zuigen van de H2O.
- Aliquot in elke buis ongeveer 500 μL gesteriliseerde H2O met behulp van een steriele serologische pipet van 10 ml en sluit alle deksels in de laminaire stroomkap. De zaden zijn klaar om gezaaid te worden. Houd de buizen indien nodig maximaal enkele uren op kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
- Vul de reservoirfles die wordt gebruikt om vloeistof te verzamelen met een voldoende hoeveelheid water en autoclaaf het. Gooi de vloeistof daarna weg in een normale gootsteen.
OPMERKING: Autoclaaf de vloeistof om alle zaden in het reservoir te doden.
Figuur 2: Overzicht van de procedure en minimale tijd die nodig is voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden met 96 onafhankelijke monsters. In het gepresenteerde experiment worden 96 onafhankelijke monsters behandeld in twee batches van gelijke grootte. De hele procedure is hetzelfde voor beide batches en ze worden parallel verwerkt, maar batch twee wordt verwerkt met één stap vertraging in vergelijking met batch één. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Plating en score van Arabidopsis op 1/2 MS platen
- Breng de zaden en 300-400 μL steriel H2O over in een petrischaaltje door voorzichtig te pipetteren met een pipet van 1000 μL.
- Na het overbrengen van 10 buizen, giet in elke plaat ongeveer 1,5-2,0 ml gesmolten 1/2 MS-medium zonder antibiotica.
OPMERKING: Smelt van tevoren en bewaar het gesmolten medium van 1/2 MS in een thermostatisch bad op 50-53 °C om stollen te voorkomen. Zorg ervoor dat de temperatuur niet hoger is dan 58 °C om te voorkomen dat de kiemkracht van de zaden afneemt. - Draai de plaat snel om de zaden erin te verdelen. Plak de platen aan weerszijden vast.
- Wikkel de borden in een plastic of aluminiumfolie en plaats ze vervolgens in een koelkast (4 °C) gedurende 3 dagen in het donker om een uniforme kieming te verkrijgen.
- Breng de platen over in een groeikamer van 23 °C onder lange dagomstandigheden (16 uur licht/8 uur donker) met een lichtintensiteit van 100-120 μmol m-2·s-1 en 60% relatieve vochtigheid.
- Na twee dagen scoor je de planten op de aanwezigheid van radicles. Detecteer de radikelopkomst en groene zaadlobbenvorming (volledige opening van de twee zaadlobben) om de kieming van het zaad te evalueren.
5. Statistische analyses
OPMERKING: Hier werd de paarsgewijze test van Tukey gebruikt voor statistische analyses.
- Beschouw de P-waarden onder 0,01 als statistisch significant. Voer alle experimenten ten minste uit met vijf biologische replicaties.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de tijd te beoordelen die nodig is voor de gehele zaadsterilisatieprocedure, werden de tijdsverschillen voor vloeistofbehandeling 96 monsters in het huidige protocol berekend en vergeleken met traditionele pipetteermethoden. Het resultaat geeft aan dat het huidige protocol tijd bespaart, waardoor de vloeistofverwerkingstijd wordt teruggebracht tot een vierde van die met de traditionele protocollen(tabel 1). De tabel benadrukt verder dat de vloeistofverwijderingstijd in het huidige protocol meer tijd b...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Sterilisatie van zaden is de fundamentele stap voor functionele studies in Arabidopsis. Hoewel het vaak voor veel verschillende doeleinden wordt uitgevoerd, zijn er beperkte studies beschikbaar over sterilisatie van zaadoppervlakken met hoge doorvoer in Arabidopsis.
Tot nu toe is een van de methoden met de hoogste doorvoer het gebruik van chloorgas dat wordt gegenereerd door bleekmiddel te mengen met geconcentreerd HCl. Hoewel deze methode beperkte hands-on tijd vereist, gebruikt het een gas d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gefinancierd door de autonome provincie Trento door middel van kernfinanciering van de Ecogenomics-groep van Fondazione E. Mach.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Aquarium klep | Amazon | B074CYC5SD | Kit inclusief 2 kleppen en dunne wandbuizen. De klep voorkomt dat de vloeistoffen terug gaan naar de steriele punt |
| Arabidopsis Col-0 wild-type zaden | Nottingham Arabidopsis Stock Center | N1093 | Wild type zaden (gevoelig voor kanamycine) |
| Arabidopsis transgene lijn AdoIspS-79 zaden | NA | NA | Transgene lijn die een isopreensynthase gen overexpresseert van Arundo donax getransformeerd in de Col-0 achtergrond, resistent tegen kanamycine (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Beschikbaar op aanvraag bij de auteurs |
| Microcentrifuge | Eppendorf | EP022628188 | Bent microcentrifuge gebruikt om de zaden naar beneden te centrifugeren |
| Murashige & Skoog medium inclusief vitaminen | Duchefa | M0222 | Standaard medium voor steriele plantencultuur |
| Pipetcontroller | Brand | 26300 | Gebakken om de serologische pipet te bedienen |
| Polyethyleen buis 1 | Roth | 9591.1 | Buis voor verbinding van vacuümpomp naar decantatiefles (binnendiameter: 7 mm; buitendiameter: 9 mm) |
| Polyethyleen buis 2 | Roth | 9587.1 | Buis voor verbinding van decantatiefles naar de aquariumklep (binnendiameter: 5 mm; buitendiameter: 7 mm) |
| Schroefdop met connectoren | Roth | PY86.1 | 2-weg dispenser schroefdop GL45 in polypropyleen voor decantatiefles |
| Serologische pipet | Brand | 27823 | Gegradueerde glazen (herbruikbare) serologische pipet. Wegwerppipetten kunnen in plaats daarvan worden gebruikt |
| Shakret al. | Qiagen | 85300 | TissueLyser II parelslagmolen normaal gebruikt voor weefsel homogenisatie. Zonder de toevoeging van parels aan de buizen werkt het als shaker. |
| Technisch ethanol | ITW Reagents (Nova Chimica Srl) | 212800 | Ethanol 96% v/v gedeeltelijk gedenatureerde technische graad |
| Tween 20 | Merck Millipore | 655205 | Niet-ionogene detergent die als oppervlakteactieve stof werkt |
| Universele buisverbinders | Roth | Y523.1 | Kan worden gebruikt om buisverbindingen te verbeteren/vereenvoudigen |
| Vacuumpomp | Merck Millipore | WP6222050 | Gebakken voor het maken van de zuigapparaat |
Referenties
- Somerville, C., Koornneef, M. A fortunate choice: The history of Arabidopsis as a model plant. Nature Reviews Genetics. 3 (11), 883-889 (2002).
- Koornneef, M., Meinke, D. The development of Arabidopsis as a model plant. Plant Journal. 61 (6), 909-921 (2010).
- Initiative, T. A. G. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana. Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283-2290 (1999).
- Speulman, E., et al. A two-component enhancer-inhibitor transposon mutagenesis system for functional analysis of the arabidopsis genome. Plant Cell. 11 (10), 1853-1866 (1999).
- Jander, G., et al. Ethylmethanesulfonate saturation mutagenesis in Arabidopsis to determine frequency of herbicide resistance. Plant Physiology. 131 (1), 139-146 (2003).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. -S., Niu, Q. -W., Chua, N. -H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Togninalli, M., et al. AraPheno and the AraGWAS catalog 2020: A major database update including RNA-Seq and knock-out mutation data for Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Research. 48 (1), 1063-1068 (2020).
- Lan, Y., et al. AtMAD: Arabidopsis thaliana multi-omics association database. Nucleic Acids Research. 49 (1), 1445-1451 (2021).
- Xu, J., Trainotti, L., Li, M., Varotto, C. Overexpression of isoprene synthase affects ABA-and drought-related gene expression and enhances tolerance to abiotic stress. International Journal of Molecular Sciences. 21 (12), 1-21 (2020).
- Czarnecki, O., et al. Simultaneous knock-down of six non-family genes using a single synthetic RNAi fragment in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12 (1), 1-11 (2016).
- Yan, L., et al. high-efficiency genome editing in arabidopsis using YAO promoter-driven CRISPR/Cas9 system. Molecular Plant. 8 (12), 1820-1823 (2015).
- Liu, Y., Gao, Y., Gao, Y., Zhang, Q. Targeted deletion of floral development genes in Arabidopsis with CRISPR/Cas9 using the RNA endoribonuclease Csy4 processing system. Horticulture Research. 6 (1), (2019).
- Grefen, C., et al. Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene receptor family members. Molecular Plant. 1 (2), 308-320 (2008).
- Gazzani, S., et al. Evolution of MIR168 paralogs in Brassicaceae. BMC Evolutionary Biology. 9 (1), (2009).
- Lee, S., Korban, S. S. Transcriptional regulation of Arabidopsis thaliana phytochelatin synthase (AtPCS1) by cadmium during early stages of plant development. Planta. 215 (4), 689-693 (2002).
- Long, Y., et al. In vivo FRET-FLIM reveals cell-type-specific protein interactions in Arabidopsis roots. Nature. 548 (7665), 97-102 (2017).
- Freire-Rios, A., et al. Architecture of DNA elements mediating ARF transcription factor binding and auxin-responsive gene expression in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24557-24566 (2020).
- Rivero, L., et al. Handling arabidopsis plants: Growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in Molecular Biology. 1062, 3-25 (2014).
- Chen, J. H., et al. Drought and salt stress tolerance of an arabidopsis glutathione S-transferase U17 knock-out mutant are attributed to the combined effect of glutathione and abscisic acid. Plant Physiology. 158 (1), 340-351 (2012).
- Li, D. Z., et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (49), 19641-19646 (2011).
- Mathur, J., Koncz, C. Establishment and maintenance of cell suspension cultures. Arabidopsis Protocols. Methods in Molecular Biology. 82, Humana Press. 27-30 (1998).
- Li, M., Cappellin, L., Xu, J., Biasioli, F., Varotto, C. High-throughput screening for in planta characterization of VOC biosynthetic genes by PTR-ToF-MS. Journal of Plant Research. 133 (1), 123-131 (2020).
- Li, M., et al. In planta recapitulation of isoprene synthase evolution from ocimene synthases. Molecular Biology and Evolution. 34 (10), 2583-2599 (2017).
- Li, M., et al. Evolution of isoprene emission in Arecaceae (palms). Evolutionary Applications. 14, 902-914 (2020).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 (3), 473-497 (1962).
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods in Molecular Biology. 343, Clifton, N.J. 87-104 (2006).
- Lundberg, D. S., et al. Defining the core Arabidopsis thaliana root microbiome. Nature. 488 (7409), 86-90 (2012).
- Tkacz, A., Cheema, J., Chandra, G., Grant, A., Poole, P. S. Stability and succession of the rhizosphere microbiota depends upon plant type and soil composition. ISME Journal. 9 (11), 2349-2359 (2015).
- Singh, N., Gaddam, S. R., Singh, D., Trivedi, P. K. Regulation of arsenic stress response by ethylene biosynthesis and signaling in Arabidopsis thaliana. Environmental and Experimental Botany. 185, 104408(2021).
- Lindsey, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized method for high-throughput sterilization of Arabidopsis seeds. Journal of Visualized Experiments: JOVE. (128), e56587(2017).
- Acemi, A., Özen, F. Optimization of in vitro asymbiotic seed germination protocol for Serapias vomeracea. The EuroBiotech Journal. 3 (3), 143-151 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
