High-throughput, robuuste en zeer tijdflexibele methode voor oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden

Summary

Een high-throughput protocol voor de oppervlaktesterilisatie van Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) zaden wordt geleverd, waarbij de vloeistofbehandelingsstappen worden geoptimaliseerd met een eenvoudig zuigapparaat dat is gebouwd met een vacuümpomp. Honderden zaadmonsters kunnen op één dag aan de oppervlakte worden gesteriliseerd.

Abstract

Arabidopsis is veruit de plantenmodelsoort die het meest wordt gebruikt voor functionele studies. De oppervlaktesterilisatie van Arabidopsis-zaden is een fundamentele stap die nodig is om dit doel te bereiken. Het is dus van het grootste belang om arabidopsis-zaadoppervlaksterilisatiemethoden met hoge doorvoer vast te stellen om tientallen tot honderden monsters (bijv. Transgene lijnen, ecotypen of mutanten) tegelijk te verwerken. Een sterilisatiemethode voor zaadoppervlakken op basis van de efficiënte eliminatie van vloeistof in buizen met een zelfgemaakte zuiginrichting die is opgebouwd uit een gemeenschappelijke vacuümpomp, wordt in deze studie gepresenteerd. Door de arbeidsintensieve hands-on tijd drastisch te verminderen met deze methode is het verwerken van enkele honderden monsters op één dag mogelijk met weinig moeite. Serie-tijdsverloopanalyses wezen verder op een zeer flexibel tijdsbereik van oppervlaktesterilisatie door hoge kiemsnelheden te handhaven. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast voor oppervlaktesterilisatie van andere soorten kleine zaden met eenvoudige aanpassing van het zuigapparaat op basis van de zaadgrootte en de gewenste snelheid om de vloeistof te elimineren.

Introduction

Arabidopsis is een diploïde plantensoort uit de familie Brassicaceae. De relatief korte levenscyclus (twee maanden per generatie onder lange dag groeiomstandigheden), kleine plantgrootte en zelfbestuiving met de productie van honderden zaden per plant hebben het de eerste fundamentele plantmodelsoort^{gemaakt 1,2}. Bovendien was het genoom volledig gesequenced^3,uitgebreide reverse genetica-instrumenten (verzadigd T-DNA, transposon en chemisch gemuteerde populaties) zijn beschikbaar^4,5,6,en effecti....

Protocol

1. Reagentia en mediavoorbereiding

1. Bereid 70% ethanoloplossing voor: Voeg 737 ml 95% technische ethanol toe aan 263 ml gedestilleerd water. Meng.
   OPMERKING: Bereid 70% ethanoloplossing op een niet-steriele werkbank.
   LET OP: Ethanol is licht ontvlambaar en kan ernstige irritatie aan de ogen veroorzaken. Uit de buurt van vlammen en warmtebronnen houden. In geval van contact met de ogen, spoel met overvloedig water.
2. Bereid 5% bleekoplossing voor: Voeg 5 ml huishoudelijk bleekmiddel (met ~ 3,5% natriumhypochloriet, NaClO) toe aan 95 ml steriel gedestilleerd water. Voeg een paar druppels niet-ionisch wasmiddel toe (bijv. Tween 20) en meng grondig.....

Results

Om de tijd te beoordelen die nodig is voor de gehele zaadsterilisatieprocedure, werden de tijdsverschillen voor vloeistofbehandeling 96 monsters in het huidige protocol berekend en vergeleken met traditionele pipetteermethoden. Het resultaat geeft aan dat het huidige protocol tijd bespaart, waardoor de vloeistofverwerkingstijd wordt teruggebracht tot een vierde van die met de traditionele protocollen(tabel 1). De tabel benadrukt verder dat de vloeistofverwijderingstijd in het huidige protocol meer tijd b.......

Discussion

Sterilisatie van zaden is de fundamentele stap voor functionele studies in Arabidopsis. Hoewel het vaak voor veel verschillende doeleinden wordt uitgevoerd, zijn er beperkte studies beschikbaar over sterilisatie van zaadoppervlakken met hoge doorvoer in Arabidopsis.

Tot nu toe is een van de methoden met de hoogste doorvoer het gebruik van chloorgas dat wordt gegenereerd door bleekmiddel te mengen met geconcentreerd HCl. Hoewel deze methode beperkte hands-on tijd vereist, gebruikt het een gas d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquarium valve	Amazon	B074CYC5SD	Kit including 2 valves and thin-walled tubings. The valve prevents the liquids to go back to the sterile tip
Arabidopsis Col-0 wild-type seeds	Nottingham Arabidopsis Stock Center	N1093	Wild type seeds (sensitive to kanamycin)
Arabidopsis transgenic line AdoIspS-79 seeds	NA	NA	Transgenic line overexpressing an isoprene synthase gene from Arundo donax transformed in the Col-0 background, resistant to kanamycin (Li et al. (2017) Mol. Biol. Evol., 34, 2583–2599). Available on request from the authors
Microcentrifuge	Eppendorf	EP022628188	Benchtop microcentrifuge used for spinning down the seeds
Murashige & Skoog medium including vitamins	Duchefa	M0222	Standard medium for plant sterile culture
Pipette controller	Brand	26300	Used to operate the serological pipette
Polyethylene tube 1	Roth	9591.1	Tube for connection from vacuum pump to decantation bottle (inner diameter: 7 mm; outer diameter: 9 mm)
Polyethylene tube 2	Roth	9587.1	Tube for connection from decantation bottle to the aquarium valve  (inner diameter: 5 mm; outer diameter: 7 mm)
Screw cap with connectors	Roth	PY86.1	2-way dispenser screw cap GL45 in polypropylene for decanting bottle
Serological pipette	Brand	27823	Graduated glass (reusable) serological pipette. Disposable pipettes can be used instead
Shakeret al.	Qiagen	85300	TissueLyser II bead mill used normally for tissue homogenization. Without the addition of beads to the tubes it works as shaker.
Technical ethanol	ITW Reagents (Nova Chimica Srl)	212800	Ethanol 96% v/v partially denatured technical grade
Tween 20	Merck Millipore	655205	Non-ionic detergent acting as surfactant
Universal tubing connectors	Roth	Y523.1	Can be used to improve/simplify tubing connections
Vacuum pump	Merck Millipore	WP6222050	Used for making the suction device