Methodenartikel

Meten van mitochondriale substraatflux in recombinante perfringolysine O-permeabiliseerde cellen

DOI:

10.3791/62902

⸱

13 augustus 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Faculty of Medicine in Hradec Králové, Charles University, 2Department of Pathophysiology, Third Faculty of Medicine, Charles University, 3Department of Internal Medicine, University Hospital Kralovske Vinohrady

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit werk beschrijven we een aangepast protocol om mitochondriale respiratoire substraatflux te testen met behulp van recombinant perfringolysine O in combinatie met respirometrie op basis van microplaten. Met dit protocol laten we zien hoe metformine de mitochondriale ademhaling van twee verschillende tumorcellijnen beïnvloedt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale substraatflux is een onderscheidend kenmerk van elk celtype en veranderingen in de componenten ervan, zoals transporters, kanalen of enzymen, zijn betrokken bij de pathogenese van verschillende ziekten. Mitochondriale substraatflux kan worden bestudeerd met behulp van intacte cellen, gepermeabiliseerde cellen of geïsoleerde mitochondriën. Het onderzoeken van intacte cellen stuit op verschillende problemen als gevolg van gelijktijdige oxidatie van verschillende substraten. Bovendien bevatten verschillende celtypen interne opslagplaatsen van verschillende substraten die de interpretatie van resultaten bemoeilijken. Methoden zoals mitochondriale isolatie of het gebruik van permeabiliseermiddelen zijn niet gemakkelijk reproduceerbaar. Het isoleren van zuivere mitochondriën met intacte membranen in voldoende hoeveelheden uit kleine monsters is problematisch. Het gebruik van niet-selectieve permeabilizers veroorzaakt verschillende gradaties van onvermijdelijke mitochondriale membraanschade. Recombinant perfringolysine O (rPFO) werd aangeboden als een meer geschikte permeabilisator, dankzij het vermogen om selectief het plasmamembraan te permeabiliseren zonder de mitochondriale integriteit te beïnvloeden. Bij gebruik in combinatie met microplaat respirometrie maakt het het mogelijk om de flux van verschillende mitochondriale substraten te testen met voldoende replicaties binnen één experiment terwijl een minimaal aantal cellen wordt gebruikt. In dit werk beschrijft het protocol een methode om mitochondriale substraatflux van twee verschillende cellulaire fenotypes of genotypen te vergelijken en kan worden aangepast om verschillende mitochondriale substraten of remmers te testen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microplate-gebaseerde respirometrie heeft een revolutie teweeggebracht in mitochondriaal onderzoek door de studie van cellulaire ademhaling van een kleine steekproefgrootte mogelijk te maken1. Cellulaire ademhaling wordt over het algemeen beschouwd als een indicator van mitochondriale functie of 'disfunctie', ondanks het feit dat het mitochondriale scala aan functies verder reikt danenergieproductie 2. In aerobe omstandigheden extraheren mitochondriën de energie die is opgeslagen in verschillende substraten door deze substraten af te breken en om te zetten in metabole tussenproducten die de citroenzuurcyclus kunnen voeden3 (Figuur 1). De continue flux van substraten is essentieel voor de stroom van de citroenzuurcyclus om hoogenergetische 'elektronendonoren' te genereren, die elektronen leveren aan de elektronentransportketen die een protongradiënt over het binnenste mitochondriale membraan genereert, waardoor ATP-synthase ADP tot ATP kan fosforyleren4. Daarom moet een experimenteel ontwerp om mitochondriale ademhaling te testen de monsternatuur (intacte cellen, gepermeabiliseerde cellen of geïsoleerde mitochondriën) en mitochondriale substraten omvatten.

Cellen houden een opslag van inheemse substraten5, en mitochondriën oxideren verschillende soorten substraten tegelijkertijd6, wat de interpretatie van resultaten verkregen uit experimenten uitgevoerd op intacte cellen bemoeilijkt. Een veel voorkomende aanpak om mitochondriaal vermogen om een geselecteerd substraat te oxideren te onderzoeken, is om mitochondriën te isoleren of de onderzochte cellen te permeabiliseren5. Hoewel geïsoleerde mitochondriën ideaal zijn voor kwantitatieve studies, is het isolatieproces arbeidsintensief. Het wordt geconfronteerd met technische problemen zoals de noodzaak van een grote steekproefomvang, zuiverheid van de opbrengst en reproduceerbaarheid van de techniek5. Gepermeabiliseerde cellen bieden een oplossing voor de nadelen van mitochondriale isolatie; routinematige permeabiliseermiddelen van detergent aard zijn echter niet specifiek en kunnen mitochondriale membranen beschadigen5.

Recombinant perfringolysine O (rPFO) werd aangeboden als een selectief plasmamembraanpermeabiliserend middel7en werd met succes gebruikt in combinatie met een extracellulaire fluxanalysator in verschillende studies7,8,9,10. We hebben een protocol aangepast met behulp van rPFO om mitochondriale substraatflux te screenen met behulp van XFe96 extracellulaire fluxanalysator. In dit protocol worden vier verschillende substraatoxiderende routes in twee cellulaire fenotypen vergeleken met voldoende replicaties en de juiste controle voor elk getest materiaal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Een dag voor de test

  1. Bereiding van reagentia en substraten.
    1. Mitochondriale assayoplossing (MAS): Bereid stamoplossingen van alle reagentia zoals beschreven in tabel 1. Verwarm de voorraden mannitol en sucrose tot 37 °C om volledig op te lossen. Meng de reagentia om 2x MAS te bereiden en verwarm het mengsel tot 37 °C. Stel de pH met 5N KOH in op 7,4 (~ 7 ml) en voeg vervolgens water toe om het volume op 1 l te brengen. Filter-steriliseer en bewaar de aliquots bij -20 °C tot de meetdag.
    2. Runderserumalbumine (5% BSA): Los 5 g BSA op in 90 ml voorverwarmd steriel water op een magneetroerder en vermijd schudden. Stel de pH in op 7,4 met 5 N KOH en voeg vervolgens water toe om het volume op 100 ml te brengen. Filter-steriliseer en bewaar de aliquots bij -20 °C tot de meetdag.
    3. Mitochondriale substraten: Bereid 1 M stamoplossingen van natriumsuccinaat, natriumpyruvaat en natriumglutamaat in steriel water. Bereid 100 mM bouillonoplossing van natriummalaat in steriel water en gebruik voorverwarmd steriel water om een 10 mM bouillonoplossing van palmitoyl carnitine te bereiden. Stel de pH van elke oplossing in op 7,4 bij 5 N KOH en filtersteriliseer. Bewaar de substraten bij 2-8 °C. Op het moment van gebruik, warm palmitoyl carnitine tot 37 °C om eventuele neerslag op te lossen. Bewaar voor later gebruik aliquots van alle substraten behalve pyruvaat bij -20 °C.
    4. Mitochondriale remmers: Gebruik dimethylsulfoxide (DMSO) om stamoplossingen van 25 mM oligomycine, 50 mM carbonylcyanide 4-(trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP), 20 mM rotenon en 20 mM antimycine A te bereiden.
  2. Zaaien en behandelen van de cellen: Zoals weergegeven in figuur 2, zaai de cellen in de kolommen 2-11. Kolommen 1 en 12 moeten leeg worden gelaten om als achtergrondputten te dienen. In dit werk werden HepG2- en A549-cellen gebruikt.
    1. Zaai de cellen met een dichtheid van 20.000 cellen per put. Gebruik 50-80 μL celkweekmedium voor het zaaien.
    2. Vul de lege putten met een gelijk volume celkweekmedium en incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Laat de cellen zich 3-4 uur hechten en voeg vervolgens 100 μL celkweekmedium toe aan alle putten.
    3. Met die laatste mediumtoevoeging past u de behandeling toe in de kolommen 7-11. In dit werk werd de experimentele groep gedurende 16 uur behandeld met 1 mM metforminehydrochloride en de controlegroep werd behandeld met een gelijk volume steriel gedestilleerd water als voertuigcontrole.
  3. Hydratatie van de sensoren: Pipetteer 200 μL steriel water per put in de nutsplaat en geef de sensorcartridge voorzichtig terug terwijl u de sensoren in water dompelt. Incubeer de patroon in een CO2-vrijeincubator bij 37 °C tot de volgende dag.
  4. De testprotocolsjabloon: Schakel de analyzer (zie Tabel met materialen) en de controllereenheid in. Start de software voor instrumentbesturing en gegevensverzameling en ontwerp het testprotocol zoals beschreven in tabel 2. Maak onder Groepsdefinitiesvier injectiestrategieën waarbij Poort A verschilt afhankelijk van het geïnjecteerde substraat(figuur 3). Noem de strategieën naar de substraten of hun afkortingen.
  5. Wijs aan poort B, C en D respectievelijk de verbindingen oligomycine, FCCP en rotenon/antimycine A toe. Maak acht groepen en geef ze een naam zoals weergegeven in figuur 4. Wijs onder Plaattoewijzing de groepen toe aan de bijbehorende putten en sla het protocol vervolgens op als een kant-en-klare sjabloon. Laat de analysator ingeschakeld om de temperatuur 's nachts te laten stabiliseren. Houd de analyzer op een plaats met een stabiele temperatuur om plotselinge temperatuurveranderingen te voorkomen.

2. De dag van de test

  1. Water vervangen door het kalibrant: Gooi het water van de nutsplaat weg en pipetteer 200 μL voorgewarmd kalibrant per put in de nutsplaat. Breng de patroon terug naar de CO2-vrijeincubator tot het moment van de test. Om snelle verdamping van het kalibrant te voorkomen, handhaaft u een vochtbron in de incubator en schakelt u de ventilatorsnelheid uit of verlaagt u deze tot een minimum.
  2. Voorbereiding van de werkoplossingen: Begin met het verwarmen van 2x MAS, 5% BSA en steriel water tot 37 °C. Laat ondertussen de remmervoorraden op kamertemperatuur komen. Gebruik warm 2x MAS en steriel gedestilleerd water om 5 ml van de werkconcentratie van de substraten en remmers te bereiden zoals beschreven in tabel 3.
  3. Laden van de injectiepoorten: Zoals weergegeven in figuur 3, laad 20 μL van de substraten in poort A. Laad succinaat/rotenonmengsel in poort A van de rijen A en B. Laad pyruvaat/malaatmengsel in poort A van de rijen C en D. Laad glutamaat/malaatmengsel in poort A van de rijen E en F. Laad palmitoyl carnitine/malaatmengsel in poort A van de rijen G en H. Laad voor de hele plaat poort B met 22 μL oligomycinepreparaat, poort C met 25 μL FCCP-preparaat en poort D met 27 μL mengsel rotenon/antimycine A.
  4. De kalibratiestap starten: Klik onder het tabblad Test uitvoeren op Uitvoeren starten om de test te starten. Plaats de geladen sensorcartridge en start de kalibratiestap. Wacht tot de kalibratie is voltooid voordat u doorgaat naar de volgende stap.
  5. Bereiding van het testmedium (MAS-BSA-rPFO): Om 20 ml van het testmedium te bereiden, mengt u 10 ml 2x MAS, 9,2 ml steriel water en 0,8 ml 5% BSA in een buis van 50 ml. Voeg 2 μL van 10 μM rPFO toe om een concentratie van 1 nM te bereiken en resuspend het mengsel met voorzichtig pipetteren. Vermijd schudden en gebruik geen vortexmixer voor het mengen. Incubeer de buis bij 37 °C tot het moment van gebruik.
  6. De cellen wassen: Was de cellen en de lege putjes twee keer met voorverwarmde calcium- en magnesiumvrije fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een meerkanaalspion. Vermijd het hergebruiken van dezelfde tips om het celkweekmedium weg te gooien en PBS toe te voegen. Voer deze stap uit buiten de laminaire stroom om de cellen te beschermen tegen uitdroging door de luchtstroom.
  7. Celpermeabilisatie in assaymedium: Gooi met behulp van een meerkanaalspion de PBS weg en vervang deze door 180 μL van het voorgewarmde assaymedium (MAS-BSA-rPFO).
  8. De meting starten: Vervang onmiddellijk na de permeabilisatie de gebruiksplaat van de gekalibreerde sensorcartridge door de celplaat en start de meting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Begin met het normaliseren van de resultaten naar de tweede meting van de basisademhaling om waarden weer te geven als zuurstofverbruikspercentage (OCR%). De resultaten van de test zijn weergegeven in figuur 5, figuur 6,figuur 7 en figuur 8. Het is belangrijk om de juiste achtergrondputten voor elke groep toe te wijzen en de achtergrondputten van andere groepen te inact...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol is een wijziging van eerder gepubliceerde studies7,8,9,10 en de gebruikershandleiding van het product. In tegenstelling tot het protocol van de fabrikant wordt 2x MAS gebruikt in plaats van 3x MAS, omdat 2× MAS gemakkelijker op te lossen is en geen neerslag vormt na bevriezing. Bevroren 2x MAS aliquots kunnen tot zes maanden worden bewaard en laten consistente resultaten zien. Een ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken de medewerkers van de afdeling Fysiologie van de faculteit Geneeskunde in Hradec Králové en de afdeling Pathofysiologie van de Derde Faculteit Geneeskunde voor de hulp bij de voorbereiding van chemicaliën en monsters. Dit werk werd ondersteund door Charles University subsidieprogramma's PROGRES Q40/02, Tsjechische ministerie van Volksgezondheid subsidie NU21-01-00259, Tsjechische wetenschap stichting subsidie 18-10144 en INOMED project CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 gefinancierd door het ministerie van Onderwijs, Jeugd en Sport van de Tsjechische Republiek en door de Europese Unie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adenosine 5′ -difosfaat monokaliumzout dihydraatMerckA5285bewaar bij -20 °C
Antimycine AMerckA8674bewaar bij -20 °C
Rund serum albumineMerckA3803bewaar bij 2 - 8 °C
Carbonyl cyanide 4-(trifluormethoxy)fenylhydrazonMerckC2920bewaar bij -20 °C
Dimethyl sulfoxideMerckD8418bewaar bij RT
D-MannitolMerck63559bewaar bij RT
Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossingGibco14190-144bewaar bij RT
Ethyleenglycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraazijnzuurMerck03777bewaar bij RT
HEPESMerckH7523bewaar bij RT
L(-)appelzuur dinatriumzoutMerckM9138bewaar bij RT
L-Glutaminzuur natriumzout hydraatMerckG5889bewaar bij RT
Magnesiumchloride hexahydraatMerckM2670bewaar bij RT
OligomycineMerckO4876bewaar bij -20 °C
Palmitoyl-DL-carnitine chlorideMerckP4509bewaar bij -20 °C
KaliumhydroxideMerck484016bewaar bij RT
Kaliumfosfaat monobasischMerckP5655bewaar bij RT
RotenonMerckR8875bewaar bij -20 °C
Seahorse Wave Desktop SoftwareAgilent technologiesDownload van www.agilent.com
Seahorse XFe96 AnalyzerAgilent technologies
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent technologies102416-100XFe96 sensor cartridges en XF96 celkweek microplates
NatriumpyruvaatMerckP2256bewaar bij 2 - 8 °C
Natriumsuccinaat dibasisch hexahydraatMerckS2378bewaar bij RT
SucroseMerckS7903bewaar bij RT
WaterMerckW3500bewaar bij RT
XF calibratieAgilent technologies100840-000bewaar bij RT
XF Plasmamembraan permeabilisatorAgilent technologies102504-100Recombinant perfringolysine O (rPFO) - Verdeel in porties en bewaar bij -20 °C

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  2. Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
  3. Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
  4. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics 3. , Academic press. London. (2002).
  5. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  6. Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101(2020).
  7. Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
  8. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
  9. Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
  10. Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413(2016).
  11. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746(2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Permeabilisatie met perfringolysine OCelpermeabilisatieSeahorse XF analyzerMicroplaat respirometrieMitochondri le respiratieSubstraat ge nduceerde respiratieMetforminebehandelingA549 cellen

Gerelateerde artikelen