Multiplex in situ hybridisatie (ISH) werd gebruikt om tegelijkertijd de transcripten voor twee G-eiwit-gekoppelde receptoren en één transcriptiefactor in het gehele vagale ganglionaire complex van de volwassen muis te visualiseren. Dit protocol kan worden gebruikt om nauwkeurige kaarten van de transcriptionele profielen van vagale afferente neuronen te genereren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van G-eiwit-gekoppelde receptorexpressie in vagale afferente neuronen van muizen met behulp van Multiplex In Situ Hybridisatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze studie beschrijft een protocol voor de multiplex in situ hybridisatie (ISH) van de muis jugulair-nodose ganglia, met een bijzondere nadruk op het detecteren van de expressie van G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's). Formaline-gefixeerde jugulaire-nodose ganglia werden verwerkt met de RNAscope-technologie om tegelijkertijd de expressie van twee representatieve GPCR's (cholecystokinine en ghrelinereceptoren) te detecteren in combinatie met één markergen van nodose (gepaarde homeobox 2b, Phox2b) of jugulaire afferente neuronen (PR-domein zinkvingereiwit 12, Prdm12). Gelabelde ganglia werden afgebeeld met behulp van confocale microscopie om de distributie- en expressiepatronen van de bovengenoemde transcripten te bepalen. Kortom, Phox2b afferente neuronen bleken overvloedig de cholecystokininereceptor (Cck1r) tot expressie te brengen, maar niet de ghrelinereceptor (Ghsr). Een kleine subset van Prdm12 afferente neuronen bleek ook Ghsr en/of Cck1r tot expressie te brengen. Mogelijke technische kanttekeningen bij het ontwerp, de verwerking en de interpretatie van multiplex ISH worden besproken. De aanpak die in dit artikel wordt beschreven, kan wetenschappers helpen bij het genereren van nauwkeurige kaarten van de transcriptionele profielen van vagale afferente neuronen.
Inleiding
De cellichamen van vagale afferente stoffen bevinden zich in de jugulaire, petrosale en nodose ganglia1,2,3. Hun axonen reizen samen via verschillende takken van de nervus vagus naar craniocervicale, thoracale en abdominale territoria4,5,6,7. Vanuit hun viscerale uiteinden kunnen vagale afferente stoffen reageren op een breed scala aan fysiologische en schadelijke stimuli8,9,
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Muizen die in deze studie werden gebruikt, waren wilde mannetjes met een zuivere C57BL / 6J-achtergrond. In totaal werden 4 muizen gebruikt voor multiplex ISH. Alle muizen waren ongeveer 8 weken oud op het moment van offeren. Eén mannelijke muis (ongeveer een jaar oud) werd ook gebruikt om endogene fluorescentie geassocieerd met veroudering aan te tonen. Dieren werden gehuisvest in geventileerde kooien in een barrièrefaciliteit met ad libitum toegang tot voedsel en water. Het UT Southwestern Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee heeft de hieronder beschreven procedures beoordeeld en goedgekeurd. Details over reagentia en gereed....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hoewel RNAScope kan worden toegepast op dieren van elke leeftijd, geslacht of genetische achtergrond, is het raadzaam om met jonge volwassenen (<3 maanden oud) te werken. Dit komt omdat fluorescerende artefacten (bijv. Lipofuscine) veel voorkomende bevindingen zijn in neuronen van oudere dieren41. De formaline-gefixeerde ganglia van oudere muizen bevatten vaak verrassend intense endogene fluorescentie die gemakkelijk kan worden aangezien voor echte kleuring(Figuur 1A,.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De techniek van ISH werd uitgevonden in de late jaren 196042. Het is echter pas in het midden van de jaren 1980 dat het werd toegepast voor de detectie van mRNA's in het centrale en perifere zenuwstelsel43,44. Gezien de heterogeniteit van het zenuwstelsel en terugkerende problemen met antilichamen, blijft het lokaliseren van een bepaald transcript op cellulair niveau een waardevol hulpmiddel. Niettemin zijn traditionele ISH-methoden bewerk.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Neuroanatomy / Histology / Brain Injection Core gefinancierd door NIH-subsidie #5P01DK119130-02. De auteurs willen graag de hulp erkennen van de UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (onder leiding van Dr. Phelps) en zijn personeel (Abhijit Bugde en Marcel Mettlen), gedeeltelijk ondersteund door de NIH Grant #1S10OD021684-01, een gedeelde bron van het Harold C. Simmons Cancer Center, gedeeltelijk ondersteund door een NCI Cancer Center Support Grant, P30 CA142543.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | |
| -80°C vriezer | PHCBI | MDF-DU901VHA-PA | |
| Adobe Photoshop 2021 | Adobe | foto- en ontwerpsoftware | |
| Bakoven | Thermo Scientific | Model:658 | |
| Confocale microscoop | Zeiss | LSM880 Airyscan | |
| Dekglaasje | Brain Research Laboratories | 2460-1.5D | |
| Cryostat | Leica | CM 3050 S | |
| Dumont #5 Forceps | F.S.T. | 11252-20 | |
| Ecomount | Biocare Medical | EM 897L | montagemedium |
| HybEZ oven | hybridisatieoven | ||
| Hydrofobe pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| ImageJ-Fiji | NIH | ||
| Grote schaar | Henry Schein | 100-7561 | |
| Microcentrifugebuisjes | VWR | 20170-333 | |
| Minipomp variabele flow | Fisher Scientific | 13-876-1 | |
| Opal 520 | Akoya biosciences | FP1 1487001KT | Fluorescente biomarker |
| Opal 570 | Akoya biosciences | FP1 1488001KT | Fluorescente biomarker |
| Opal 690 | Akoya biosciences | FP1 1497001KT | Fluorescente biomarker |
| ProLong Gold Antifade Mountant | montagemedium voor fluorescerend gelabelde cellen | ||
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | ACD /Bio-Techne | 323100 | multiplexkit |
| RNAscope sonde Muis Cck1r-C3 | ACD /Bio-Techne | 313751-C3 | |
| RNAscope sonde Muis DapB | ACD /Bio-Techne | 310043 | |
| RNAscope sonde Muis Ghsr | ACD /Bio-Techne | 426141 | |
| RNAscope sonde Muis Phox2b-C2 | ACD /Bio-Techne | 407861-C2 | |
| RNAscope sonde Muis Prdm12-C2 | ACD /Bio-Techne | 524371-C2 | |
| RnaseZap | Sigma | R2020 | Rnase ontsmettingsoplossing |
| Kleine dissectiescharen | Millipore Sigma | Z265977 | |
| Superfrost Plus glazen schuifjes | Fisherbrand | 1255015 | |
| Tissue Tek OCT medium | Sakura | 4583 | |
| Gebruikershandleiding | ACD | 323100 USM | |
| Vannas Spring Scissors | Roboz | RS 5620 | |
| ZEN Imaging Software | Zeiss |
Referenties
- Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
- Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets withi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
