Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Detectie van G-eiwit-gekoppelde receptorexpressie in vagale afferente neuronen van muizen met behulp van Multiplex In Situ Hybridisatie

3.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/62945

⸱

20 september 2021

 , 
1Center for Hypothalamic Research and Department of Internal Medicine, UTSouthwestern Medical Center at Dallas

In dit artikel

Samenvatting

Multiplex in situ hybridisatie (ISH) werd gebruikt om tegelijkertijd de transcripten voor twee G-eiwit-gekoppelde receptoren en één transcriptiefactor in het gehele vagale ganglionaire complex van de volwassen muis te visualiseren. Dit protocol kan worden gebruikt om nauwkeurige kaarten van de transcriptionele profielen van vagale afferente neuronen te genereren.

Samenvatting

Deze studie beschrijft een protocol voor de multiplex in situ hybridisatie (ISH) van de muis jugulair-nodose ganglia, met een bijzondere nadruk op het detecteren van de expressie van G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's). Formaline-gefixeerde jugulaire-nodose ganglia werden verwerkt met de RNAscope-technologie om tegelijkertijd de expressie van twee representatieve GPCR's (cholecystokinine en ghrelinereceptoren) te detecteren in combinatie met één markergen van nodose (gepaarde homeobox 2b, Phox2b) of jugulaire afferente neuronen (PR-domein zinkvingereiwit 12, Prdm12). Gelabelde ganglia werden afgebeeld met behulp van confocale microscopie om de distributie- en expressiepatronen van de bovengenoemde transcripten te bepalen. Kortom, Phox2b afferente neuronen bleken overvloedig de cholecystokininereceptor (Cck1r) tot expressie te brengen, maar niet de ghrelinereceptor (Ghsr). Een kleine subset van Prdm12 afferente neuronen bleek ook Ghsr en/of Cck1r tot expressie te brengen. Mogelijke technische kanttekeningen bij het ontwerp, de verwerking en de interpretatie van multiplex ISH worden besproken. De aanpak die in dit artikel wordt beschreven, kan wetenschappers helpen bij het genereren van nauwkeurige kaarten van de transcriptionele profielen van vagale afferente neuronen.

Inleiding

De cellichamen van vagale afferente stoffen bevinden zich in de jugulaire, petrosale en nodose ganglia1,2,3. Hun axonen reizen samen via verschillende takken van de nervus vagus naar craniocervicale, thoracale en abdominale territoria4,5,6,7. Vanuit hun viscerale uiteinden kunnen vagale afferente stoffen reageren op een breed scala aan fysiologische en schadelijke stimuli8,9,10. De verdeling van signaalmoleculen en receptoren die betrokken zijn bij vagale detectie blijft echter slecht gekarakteriseerd. Dit komt deels omdat de vagale ganglia, ondanks hun kleine omvang, een breed spectrum van receptoren uitdrukken, waaronder een groot aantal GPCR's8,11,12,13. Bovendien zijn vagale afferente neuronen inherent heterogeen en vertonen ze verschillende moleculaire profielen14. Om de zaak te compliceren, worden de jugulaire, petrosale en nodose ganglia in de muis bevestigd, waardoor een enkele ganglionische massa wordt gevormd. Ten slotte is in een subset van dieren het nodose ganglion bevestigd aan het sympathische superieure cervicale ganglion15.

In het verleden hebben onderzoekers zich tot immunohistochemie gewend om de neurochemische samenstelling van vagale afferente neuronen te bestuderen16,17,18. Hoewel immunohistochemie met behulp van gevalideerde antilichamen nuttig is, moeten de resultaten van immunohistochemische studies met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd. Talrijke pogingen om specifieke antilichamen tegen GPCR's te identificeren, zijn bijvoorbeeld mislukt19,20,21,22,23,24,25, waardoor onderzoekers concluderen dat de meerderheid van de antilichamen tegen GPCR's onbetrouwbaar zijn. Om deze problemen te omzeilen, is kwantitatieve PCR (qPCR) op grote schaal gebruikt voor het beoordelen van genexpressie in de vagale ganglionaire massa van knaagdieren26,27,28,29. Het onderzoeken van genexpressie met behulp van qPCR gaat echter ten koste van een verlies van ruimtelijke informatie. In het bijzonder kan niet worden voorspeld hoeveel cellen of welk celtype (s) een bepaald gen van belang uitdrukken (bijv. Nodose vs. jugulaire cellen). Terugkerende problemen omvatten ook de besmetting met aangrenzende weefsels en de opname van variabele lengtes van de nervus vagus, superieure cervicale en jugulaire ganglia tijdens dissectie15. Als gevolg van de bovenstaande moeilijkheden is er controverse rond de expressie en distributie van verschillende GPCR's in vagale afferente neuronen. Een bijzonder raadselachtig voorbeeld heeft betrekking op de ghrelinereceptor (Ghsr). Terwijl sommige studies wijdverspreide expressie van deze receptor hebben gevonden in vagale afferente neuronen30,31,32,hebben anderen vastgesteld dat Ghsr-mRNA bijna niet detecteerbaar is in het nodose ganglion11,14. Gedetailleerde mapping van Ghsr-mRNA in de vagale ganglionaire massa is daarom gerechtvaardigd.

In situ hybridisatie (ISH) is ook gebruikt om genexpressiepatronen in de vagale ganglionaire massa7,11,12,33,34,35te beoordelen. Omdat op RNA gebaseerde technieken onder de meeste omstandigheden betrouwbaarder en specifieker blijven dan op antilichamen gebaseerde technieken36,37, zijn ISH-studies waardevol gebleken voor een beter begrip van de neurochemische codering van vagale afferente neuronen. Toch zijn traditionele ISH-technieken zelf niet zonder kanttekeningen. Radioactieve ISH is gevoelig maar genereert achtergrond en blijft omslachtig38. Niet-radioactieve ISH is minder ingewikkeld maar ook minder gevoelig38. De recent ontwikkelde RNAscope ISH-methode is daarentegen zeer gevoelig en genereert minimale achtergrond39. De huidige studie paste multiplex fluorescerende RNAscope toe op de detectie van GPCR's in vagale afferente neuronen van de muis. We concentreerden ons op het in kaart brengen van de distributie van Ghsr en vergeleken de distributie met die van de cholecystokininereceptor (Cck1r), een andere GPCR waarvan bekend is dat deze tot expressie komt in het nodose ganglion34. Ten slotte werden de twee transcriptiefactoren, gepaard-achtige homeobox 2b (Phox2b) en PR-domein zinkvingereiwit 12 (Prdm12), gebruikt als selectieve markers voor nodose en jugulaire afferente neuronen, respectievelijk14. Zonder Phox2b of Prdm12 te visualiseren, zou het een uitdaging zijn om jugulaire versus nodose afferente stoffen met zekerheid te identificeren. Mogelijke technische valkuilen worden ook in het hele artikel besproken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Muizen die in deze studie werden gebruikt, waren wilde mannetjes met een zuivere C57BL / 6J-achtergrond. In totaal werden 4 muizen gebruikt voor multiplex ISH. Alle muizen waren ongeveer 8 weken oud op het moment van offeren. Eén mannelijke muis (ongeveer een jaar oud) werd ook gebruikt om endogene fluorescentie geassocieerd met veroudering aan te tonen. Dieren werden gehuisvest in geventileerde kooien in een barrièrefaciliteit met ad libitum toegang tot voedsel en water. Het UT Southwestern Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee heeft de hieronder beschreven procedures beoordeeld en goedgekeurd. Details over reagentia en gereedschappen zijn te vinden in de Tabel met materialen.

1. Monsterverzameling

  1. Dien op de dag van het offer een overdosis chloraalhydraat (500 mg / kg, i.p.) toe aan de muizen. Perfuseer de diep verdoofde muizen transcardiaal met behulp van een peristaltische pomp met 5 ml 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) gevolgd door 50 ml 10% formaline bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Dit wordt gedaan in een zuurkast om inademing van formaline te voorkomen.
  2. Omdat de nodose, petrosal en jugulaire ganglia worden samengevoegd tot een enkele ganglionische massa in de muis15,verzamel zorgvuldig de volledige vagale ganglionaire massa van elke kant (links en rechts) met behulp van een ontleedbare scope en fijne veerschaar en tang (zie de tabel met materialen).
  3. Bij het onthoofden van de muis met een grote schaar (zie de tabel met materialen),vermijd het verpletteren van de hersenstam.
  4. Na een dissectiebenadering die eerder bij de rat40is beschreven, verwijdert u de sternohyoïde en omohyoïde spieren lateraal naar de luchtpijp met een kleine tang (Tabel met materialen) om het achterhoofdsbeen bloot te leggen. Maak het hele gebied van spieren, vetweefsel en conjunctief weefsel vrij totdat de halsslagader, nervus vagus, de hypoglossale zenuw en foramen magnum zichtbaar zijn. Knip de gehele hypoglossale zenuw af met een kleine veerschaar(Tabel van Materialen).
  5. Zoek naar het nodose ganglion als een doorschijnende massa dicht bij het foramen magnum15. Breek met behulp van een kleine schaar(Table of Materials)voorzichtig het achterhoofdsbeen om het jugulaire ganglion verder bloot te leggen. Zoek naar zwarte melanocyten aan het oppervlak van de jugular als een visueel oriëntatiepunt.
  6. Knip zenuwaanhechtingen tussen de vagale ganglionische massa en haal de hele ganglionische massa eruit door voorzichtig aan het perifere uiteinde van de nervus vagus te trekken terwijl tegelijkertijd het jugulaire ganglion naar de hersenstam wordt gesneden met een kleine veerschaar (Table of Materials).
  7. Verwijder het bindweefsel en vet dat aan de nervus vagus en ganglionaire massa kleeft zoveel mogelijk.
  8. Omdat het gemakkelijk is om één ganglion te verliezen tijdens de overdracht van de ene buis naar de andere, houdt u ~ 0,5 cm van de nervus vagus om de hantering en lokalisatie van monsters te vergemakkelijken.
  9. Plaats ganglia met behulp van een fijne tang in microcentrifugebuizen van 1,5 ml en incubeer bij 4 °C in formaline gedurende 24 uur en met 30% sucrose gedurende nog eens 24 uur.
  10. Plaats ganglia in een kleine druppel (~ 4 mm Ø) van optimale snijtemperatuur (OCT) medium op een stuk aluminiumfolie. Vries vervolgens het monster in op een bed van droogijs.
  11. Snijd de monsters met een cryostaat bij -20 °C in secties van 14 μm dikte en verzamel op glazen microscoopglaasjes als 3 serie 42 μm uit elkaar.
    OPMERKING: Plaats secties niet dicht bij de randen van de dia. Om reagentia te besparen, houdt u de weefselsecties zo dicht mogelijk verpakt, maar zonder overlapping.
  12. Bewaar de monsters in een vriezer van -80 °C totdat ze nodig zijn voor ISH gedurende ten minste 6 maanden.
    OPMERKING: Raadpleeg figuur 1 voor het oplossen van problemen met endogene fluorescentie.

2. Voorbehandeling en ISH

  1. Vóór de dag van de experimenten moet autoclaaf laboratoriumglaswerk worden gebruikt voor ISH, inclusief vlekken op vaat en wasbufferpotten.
    OPMERKING: Hoewel werken onder RNase-vrije omstandigheden niet van cruciaal belang is, moet u te allen tijde handschoenen dragen. Houd de flessen van de ontsmettingsoplossing van RNase(Materiaaltabel)binnen handbereik in geval van verontreiniging.
  2. Breng de glijbanen op de eerste dag op kamertemperatuur op een bank die speciaal is gewijd aan ISH. Spoel de glaasjes af in 1x PBS en bak ze 30 minuten op 60 °C in een bakoven(Table of Materials).
  3. Bevestig de dia's na 4% formaline gedurende 15 minuten bij 4 °C.
  4. Breng de reagentia in de multiplexkit(Table of Materials)op kamertemperatuur.
  5. Droog de glaasjes uit in 50%, 70% en 100% ethanol gedurende elk 5 minuten. Breng de oplossing H2O2 gedurende 10 minuten aan op de monsters en spoel vervolgens af in dubbel gedestilleerd water (ddH2O).
  6. Behandel de monsters gedurende 5 minuten met het doelrecuperatiereagens, spoel ze in ddH2O gevolgd door 100% ethanol en droog ze aan de lucht. Maak met behulp van een hydrofobe pen een barrière rond de monsters.
    OPMERKING: Breng de hydrofobe barrière niet te dicht bij de weefselsecties aan.
  7. Breng protease gedurende 30 minuten aan bij 40 °C in een hybridisatieoven(Table of Materials).
  8. Verwarm ondertussen de sondes voor op 40 °C en koel ze voor gebruik op kamertemperatuur. Incubeer de dia's met de gewenste combinatie van doelsondes (Cck1r-C3, Ghsr-C1, Phox2b-C2; of Cck1r-C3, Ghsr-C1, Prdm12-C2) gedurende 2 uur bij 40 °C in een hybridisatieoven.
  9. Incubeer negatief controleweefsel met de dihydrodipicolinate reductase (DapB) doel C1 sonde gedurende 2 uur bij 40 °C in een hybridisatieoven.
  10. Spoel de glaasjes af in wasbuffer en bewaar een nacht in 5x zout natriumcitraat (SSC) bij kamertemperatuur. Splits het experiment voor het gemak op in twee dagen. Spoel de volgende dag de dia's af met wasbuffer en incubeer ze met onderstaande versterkingsreagentia (zie de gebruikershandleiding in De tabel met materialen).
  11. Pas AMP1 (30 min bij 40 °C), AMP2 (30 min bij 40 °C) en AMP 3 (15 min bij 40 °C) toe. Spoel af in wasbuffer tussen elke stap.
  12. Los elke opaalkleurstof(materiaaltabel)op in dimethylsulfoxide en bewaar de oplossingen bij 4 °C totdat ze nodig zijn.
  13. Incubeer voor kanaal 1 de dia's met HRP-C1 (15 min bij 40 °C) en Opaal 520 (groene kleur; verdunning 1/1.500; 30 minuten bij 40 °C). Spoel af in wasbuffer tussen elke stap.
  14. Incubeer voor kanaal 2 de dia's met HRP-C2 (15 min bij 40 °C) en Opaal 570 (gele kleur; verdunning 1/1.500; gedurende 30 minuten bij 40 °C). Spoel af in wasbuffer tussen elke stap.
  15. Incubeer voor kanaal 3 de dia's met HRP-C3 (15 min bij 40 °C) en Opal 690 (verre rode kleur; verdunning 1/1.500; gedurende 30 min bij 40 °C). Spoel af in wasbuffer tussen elke stap.
  16. Was de dia's en stel ze gedurende 30 s bloot aan 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI).
  17. Breng onmiddellijk montagemedium aan op elke dia en plaats een afdekplaat over het weefselgedeelte.
  18. Houd de weefsels horizontaal in een diahouder bij 4 °C totdat ze worden afgebeeld.

3. Microscopie en data-analyse

OPMERKING: Multiplex ISH-gegevens kunnen worden afgebeeld met een breed scala aan instrumenten met de juiste filters. Een voorkeursmethode voor beeldvorming is echter confocale microscopie met 20x en 63x (olie) doelstellingen; verwijs naar de discussie voor de redenen. Zie figuur 2 voor de bepaling van de optimale signaal-ruisverhouding.

  1. Gebruik een confocale microscoop uitgerust met 488, 561 en 633 nm laserlijnen. Gebruik de volgende acquisitieparameters (zie tabel 1):Opaal 690 (HeNe 633 nm, detectiebereik 668-696 nm, vermogen 2.0, versterking 724); Opaal 570 (DPSS-laser 561 nm, detectiebereik 579-627 nm,
  2. Om de kwaliteit van de afbeeldingen te verbeteren, verwerft u met een lijngemiddelde van 4 en een pixelgrootte van ten minste 1024 x 1024.
    OPMERKING: De bovenstaande parameters worden alleen als voorbeeld gegeven en wijzigingen worden aanbevolen afhankelijk van één instrument, vergroting (20x of 63x), expressieniveaus en endogene fluorescentieniveaus voor een bepaald weefsel.
  3. Zodra u tevreden bent met de acquisitieparameters, verzamelt u afbeeldingen met dezelfde instellingen. Wijs valse kleuren toe aan elk kanaal om visualisatie te vergemakkelijken.
    OPMERKING: Bijvoorbeeld rood (Phox2b of Prdm12), cyaan (Cck1r), geel (Ghsr) en grijs (DAPI).
  4. Voer celtelling uit met behulp van de digitale afbeeldingen door de omtrek van RNAscope-positieve profielen te identificeren met één kern die licht gekleurd is met DAPI. Bereken het percentage RNAscope-positieve profielen dat elk transcript uitdrukt [Figuur 3A-C].
  5. Om de nauwkeurigheid en nauwkeurigheid van de schattingen te verbeteren, telt u ten minste 2.000 neuronale profielen van ten minste 4 verschillende dieren. Voer het tellen van linker- en rechter ganglia afzonderlijk uit.
  6. Voer de gegevens in een cirkeldiagram in met het totale aantal getelde profielen.
  7. Gebruik beeldbewerkingssoftware om afbeeldingen te verkrijgen en 20x afbeeldingen samen te voegen. Gebruik ImageJ-Fiji en een andere foto- en ontwerpsoftware om de uiteindelijke platen te genereren. Pas aanpassingen voor contrast en lichtheid gelijkmatig toe op alle afbeeldingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hoewel RNAScope kan worden toegepast op dieren van elke leeftijd, geslacht of genetische achtergrond, is het raadzaam om met jonge volwassenen (<3 maanden oud) te werken. Dit komt omdat fluorescerende artefacten (bijv. Lipofuscine) veel voorkomende bevindingen zijn in neuronen van oudere dieren41. De formaline-gefixeerde ganglia van oudere muizen bevatten vaak verrassend intense endogene fluorescentie die gemakkelijk kan worden aangezien voor echte kleuring(Figuur 1A,...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De techniek van ISH werd uitgevonden in de late jaren 196042. Het is echter pas in het midden van de jaren 1980 dat het werd toegepast voor de detectie van mRNA's in het centrale en perifere zenuwstelsel43,44. Gezien de heterogeniteit van het zenuwstelsel en terugkerende problemen met antilichamen, blijft het lokaliseren van een bepaald transcript op cellulair niveau een waardevol hulpmiddel. Niettemin zijn traditionele ISH-methoden bewerk...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Neuroanatomy / Histology / Brain Injection Core gefinancierd door NIH-subsidie #5P01DK119130-02. De auteurs willen graag de hulp erkennen van de UT Southwestern Live Cell Imaging Facility (onder leiding van Dr. Phelps) en zijn personeel (Abhijit Bugde en Marcel Mettlen), gedeeltelijk ondersteund door de NIH Grant #1S10OD021684-01, een gedeelde bron van het Harold C. Simmons Cancer Center, gedeeltelijk ondersteund door een NCI Cancer Center Support Grant, P30 CA142543.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10x PBSFisher ScientificBP399-4
20x SSCInvitrogenAM9763
-80°C vriezerPHCBIMDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021Adobefoto- en ontwerpsoftware
BakovenThermo ScientificModel:658
Confocale microscoopZeissLSM880 Airyscan
DekglaasjeBrain Research Laboratories2460-1.5D
CryostatLeicaCM 3050 S
Dumont #5 ForcepsF.S.T.11252-20
EcomountBiocare MedicalEM 897Lmontagemedium
HybEZ ovenhybridisatieoven
Hydrofobe penVector LaboratoriesH-4000
ImageJ-FijiNIH
Grote schaarHenry Schein100-7561
MicrocentrifugebuisjesVWR20170-333
Minipomp variabele flowFisher Scientific13-876-1
Opal 520Akoya biosciencesFP1 1487001KTFluorescente biomarker
Opal 570Akoya biosciencesFP1 1488001KTFluorescente biomarker
Opal 690Akoya biosciencesFP1 1497001KTFluorescente biomarker
ProLong Gold Antifade Mountantmontagemedium voor fluorescerend gelabelde cellen
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2ACD /Bio-Techne323100multiplexkit
RNAscope sonde Muis Cck1r-C3ACD /Bio-Techne313751-C3
RNAscope sonde Muis DapBACD /Bio-Techne310043
RNAscope sonde Muis GhsrACD /Bio-Techne426141
RNAscope sonde Muis Phox2b-C2ACD /Bio-Techne407861-C2
RNAscope sonde Muis Prdm12-C2ACD /Bio-Techne524371-C2
RnaseZapSigmaR2020Rnase ontsmettingsoplossing
Kleine dissectiescharenMillipore SigmaZ265977
Superfrost Plus glazen schuifjesFisherbrand1255015
Tissue Tek OCT mediumSakura4583
GebruikershandleidingACD323100 USM
Vannas Spring ScissorsRobozRS 5620
ZEN Imaging SoftwareZeiss

Referenties

  1. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  2. Kim, S. H., et al. Mapping of sensory nerve subsets within the vagal ganglia and the brainstem using reporter mice for Pirt, TRPV1, 5-HT3, and Tac1 expression. eNeuro. 7 (2), (2020).
  3. Atsumi, K., et al. Sensory neurons in the human jugular ganglion. Tissue and Cell. 64, 101344(2020).
  4. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiological Reviews. 96 (3), 975-1024 (2016).
  5. Wang, F. B., Powley, T. L. Topographic inventories of vagal afferents in gastrointestinal muscle. Journal of Comparative Neurology. 421 (3), 302-324 (2000).
  6. Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anatomy and Embryology. 181 (2), 101-115 (1990).
  7. Gautron, L., et al. Melanocortin-4 receptor expression in a vago-vagal circuitry involved in postprandial functions. Journal of Comparative Neurology. 518 (1), 6-24 (2010).
  8. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  9. Chuaychoo, B., Hunter, D. D., Myers, A. C., Kollarik, M., Undem, B. J. Allergen-induced substance P synthesis in large-diameter sensory neurons innervating the lungs. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 116 (2), 325-331 (2005).
  10. Page, A. J., O'Donnell, T. A., Blackshaw, L. A. Opioid modulation of ferret vagal afferent mechanosensitivity. American Journal of Physiology and Gastrointestinal Liver Physiology. 294 (4), 963-970 (2008).
  11. Egerod, K. L., et al. Profiling of G protein-coupled receptors in vagal afferents reveals novel gut-to-brain sensing mechanisms. Molecular Metabolism. 12, 62-75 (2018).
  12. Wang, J., et al. Distinct and common expression of receptors for inflammatory mediators in vagal nodose versus jugular capsaicin-sensitive/TRPV1-positive neurons detected by low input RNA sequencing. PLoS One. 12 (10), 0185985(2017).
  13. Bai, L., et al. Genetic identification of vagal sensory neurons that control feeding. Cell. 179 (5), 1129-1143 (2019).
  14. Kupari, J., Haring, M., Agirre, E., Castelo-Branco, G., Ernfors, P. An atlas of vagal sensory neurons and their molecular specialization. Cell Reports. 27 (8), 2508-2523 (2019).
  15. Bookout, A. L., Gautron, L. Characterization of a cell bridge variant connecting the nodose and superior cervical ganglia in the mouse: Prevalence, anatomical features, and practical implications. Journal of Comparative Neurology. 529 (1), 111-128 (2021).
  16. Gautron, L., Lee, C. E., Lee, S., Elmquist, J. K. Melanocortin-4 receptor expression in different classes of spinal and vagal primary afferent neurons in the mouse. Journal of Comparative Neurology. 520 (17), 3933-3948 (2012).
  17. Broberger, C., Holmberg, K., Kuhar, M. J., Hokfelt, T. Cocaine- and amphetamine-regulated transcript in the rat vagus nerve: A putative mediator of cholecystokinin-induced satiety. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (23), 13506-13511 (1999).
  18. Yamamoto, Y., Henrich, M., Snipes, R. L., Kummer, W. Altered production of nitric oxide and reactive oxygen species in rat nodose ganglion neurons during acute hypoxia. Brain Research. 961 (1), 1-9 (2003).
  19. Grimsey, N. L., et al. Specific detection of CB1 receptors; cannabinoid CB1 receptor antibodies are not all created equal. Journal of Neuroscience Methods. 171 (1), 78-86 (2008).
  20. Morozov, Y. M., et al. Antibodies to cannabinoid type 1 receptor co-react with stomatin-like protein 2 in mouse brain mitochondria. European Journal of Neuroscience. 38 (3), 2341-2348 (2013).
  21. Jelsing, J., Larsen, P. J., Vrang, N. Identification of cannabinoid type 1 receptor expressing cocaine amphetamine-regulated transcript neurons in the rat hypothalamus and brainstem using in situ hybridization and immunohistochemistry. Neuroscience. 154 (2), 641-652 (2008).
  22. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 409-412 (2009).
  23. Hamdani, N., vander Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 403-407 (2009).
  24. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 379 (4), 385-388 (2009).
  25. Goodman, S. L. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. Nature Biotechnology. 45, 9-13 (2018).
  26. Liu, C., et al. PPARgamma in vagal neurons regulates high-fat diet induced thermogenesis. Cell Metabolism. 19 (4), 722-730 (2014).
  27. Zeeni, N., et al. A positive change in energy balance modulates TrkB expression in the hypothalamus and nodose ganglia of rats. Brain Research. 1289, 49-55 (2009).
  28. Kentish, S. J., Frisby, C. L., Kennaway, D. J., Wittert, G. A., Page, A. J. Circadian variation in gastric vagal afferent mechanosensitivity. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19238-19242 (2013).
  29. Peiser, C., et al. Dopamine D2 receptor mRNA expression is increased in the jugular-nodose ganglia of rats with nitrogen dioxide-induced chronic bronchitis. Neuroscience Letters. 465 (2), 143-146 (2009).
  30. Date, Y., et al. The role of the gastric afferent vagal nerve in ghrelin-induced feeding and growth hormone secretion in rats. Gastroenterology. 123 (4), 1120-1128 (2002).
  31. Meleine, M., et al. Ghrelin inhibits autonomic response to gastric distension in rats by acting on vagal pathway. Scientific Reports. 10 (1), 9986(2020).
  32. Zhang, W., et al. Functional interaction between Ghrelin and GLP-1 regulates feeding through the vagal afferent system. Scientific Reports. 10 (1), 18415(2020).
  33. Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
  34. Broberger, C., Holmberg, K., Shi, T. J., Dockray, G., Hokfelt, T. Expression and regulation of cholecystokinin and cholecystokinin receptors in rat nodose and dorsal root ganglia. Brain Research. 903 (1-2), 128-140 (2001).
  35. Hondoh, A., et al. Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex. Brain Research. 1319, 60-69 (2010).
  36. Hankin, R. C. In situ hybridization: principles and applications. Laboratory Medicine. 23, 764-770 (1992).
  37. Baker, M. Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies. Nature. 521 (7552), 274-276 (2015).
  38. Dagerlind, A., Friberg, K., Bean, A. J., Hokfelt, T. Sensitive mRNA detection using unfixed tissue: combined radioactive and non-radioactive in situ hybridization histochemistry. Histochemistry. 98 (1), 39-49 (1992).
  39. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostic. 14 (1), 22-29 (2012).
  40. Norgren, R., Smith, G. P. A method for selective section of vagal afferent or efferent axons in the rat. American Journal of Physiology. 267 (4), Pt 2 1136-1141 (1994).
  41. Schnell, S. A., Staines, W. A., Wessendorf, M. W. Reduction of lipofuscin-like autofluorescence in fluorescently labeled tissue. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 47 (6), 719-730 (1999).
  42. Pardue, M. L., Gall, J. G. Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 64 (2), 600-604 (1969).
  43. Villar, M. J., et al. Upregulation of nitric oxide synthase and galanin message-associated peptide in hypothalamic magnocellular neurons after hypophysectomy. Immunohistochemical and in situ hybridization studies. Brain Research. 650 (2), 219-228 (1994).
  44. McAllister, L. B., Scheller, R. H., Kandel, E. R., Axel, R. In situ hybridization to study the origin and fate of identified neurons. Science. 222 (4625), 800-808 (1983).
  45. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  46. Kersigo, J., et al. A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).
  47. D'Autreaux, F., Coppola, E., Hirsch, M. R., Birchmeier, C., Brunet, J. F. Homeoprotein Phox2b commands a somatic-to-visceral switch in cranial sensory pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (50), 20018-20023 (2011).
  48. Staib-Lasarzik, I., et al. Anesthesia for euthanasia influences mRNA expression in healthy mice and after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (19), 1664-1671 (2014).
  49. Avau, B., et al. Ghrelin is involved in the paracrine communication between neurons and glial cells. Neurogastroenterology and Motility. 25 (9), 599-608 (2013).
  50. Settell, M. L., et al. Functional vagotopy in the cervical vagus nerve of the domestic pig: implications for the study of vagus nerve stimulation. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026022(2020).
  51. Nyborg, N. C. B., et al. Cholecystokinin-1 receptor agonist induced pathological findings in the exocrine pancreas of non-human primates. Toxicology and Applied Pharmacology. 399, 115035(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

G prote negekoppelde receptorenmultiplex ISHjugulaire nodose gangliaRNAscope technologieconfocale microscopiecholecystokininereceptorghrelinereceptorPhox2b marker
Detectie van G-eiwit-gekoppelde receptorexpressie in vagale afferente neuronen van muizen met behulp van Multiplex In Situ Hybridisatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.