Faagdisplay gebruiken om ubiquitinevariatoren voor E3-ligases te ontwikkelen

Summary

Ubiquitinatie is een kritisch eiwit posttranslationele modificatie, waarvan ontregeling is betrokken bij tal van menselijke ziekten. Dit protocol beschrijft hoe faagweergave kan worden gebruikt om nieuwe ubiquitinevarianten te isoleren die de activiteit van E3-ligases kunnen binden en moduleren die de specificiteit, efficiëntie en patronen van ubiquitinatie regelen.

Abstract

Ubiquitine is een klein 8,6 kDa-eiwit dat een kerncomponent is van het ubiquitine-proteasoomsysteem. Bijgevolg kan het binden aan een breed scala aan eiwitten met een hoge specificiteit maar een lage affiniteit. Door middel van faagweergave kunnen ubiquitinevarianten (UbV's) zo worden ontworpen dat ze een verbeterde affiniteit vertonen ten opzichte van wildtype ubiquitine en bindingsspecificiteit behouden voor doeleiwitten. Faagweergave maakt gebruik van een faagmid-bibliotheek, waarbij het pIII-coatingeiwit van een filamenteuze M13-bacteriofaag (gekozen omdat het extern op het faagoppervlak wordt weergegeven) wordt gefuseerd met UbV's. Specifieke residuen van menselijk wildtype ubiquitine zijn zacht en gerandomiseerd (d.w.z. er is een voorkeur voor inheemse wildtypesequentie) om UbV's te genereren, zodat schadelijke veranderingen in eiwitconformatie worden vermeden en tegelijkertijd de diversiteit wordt geïntroduceerd die nodig is voor het bevorderen van nieuwe interacties met het doeleiwit. Tijdens het faagweergaveproces worden deze UbV's tot expressie gebracht en weergegeven op faaglaageiwitten en gepaneerd tegen een eiwit van belang. UUBV's die gunstige bindingsinteracties met het doeleiwit vertonen, worden behouden, terwijl slechte bindmiddelen worden weggespoeld en uit de bibliotheekpool worden verwijderd. De bewaarde UbV's, die zijn bevestigd aan het faagdeeltje dat de overeenkomstige faagmide van de UbV bevat, worden geëlueerd, versterkt en geconcentreerd, zodat ze in een andere faagronde tegen hetzelfde doeleiwit kunnen worden gepaneerd. Doorgaans worden maximaal vijf faagrondes uitgevoerd, waarbij een sterke selectiedruk wordt opgelegd aan UbV's die zwak en/of promiscue binden, zodat degenen met hogere affiniteiten geconcentreerd en verrijkt zijn. Uiteindelijk worden UbV's die een hogere specificiteit en /of affiniteit voor het doeleiwit aantonen dan hun wildtype-tegenhangers geïsoleerd en kunnen ze worden gekarakteriseerd door verdere experimenten.

Introduction

Het begrijpen van de moleculaire details van eiwit-eiwitinteracties is van cruciaal belang voor het afbakenen van de signaaltransductiemechanismen van biologische processen, met name die welke bijdragen aan klinisch belangrijke ziekten. In de afgelopen jaren is faagweergave gebruikt als een praktische en toegankelijke methode om eiwitten / peptiden te isoleren met een sterk verbeterde binding aan een gewenst doeleiwit1,2,3,4, dat op zijn beurt kan worden gebruikt als intracellulaire sondes van eiwit-eiwitinteracties.

Ubiquitinatie is een cascade van enzymatische activiteiten (E1 activerend enzym → E2-conjugaterend enzym → E3-ligases) die ubiquitine (Ub) covalent conjugeren aan eiwitsubstraten om ze te richten op afbraak of om celsignaleringsveranderingen te bemiddelen. Bovendien katalyseren deubiquitinasen de verwijdering van ubiquitine uit eiwitten. Daarom zijn er in cellen duizenden Ub-afhankelijke eiwit-eiwitinteracties, waarvan de overgrote meerderheid een gemeenschappelijk oppervlak herkent met een lage affiniteit maar hoge specificiteit om zwakke interacties door grote en diverse oppervlakken mogelijk te maken.

Ernst et al. introduceerden mutaties in bekende bindingsgebieden van Ub om te zien of ze de bindingsaffiniteit voor een interessant eiwit konden verbeteren met behoud van een hoge ^{selectiviteit5}. Een combinatorische bibliotheek van meer dan 10 miljard (7,5 x ¹⁰¹⁰) Ub-varianten (UbV's) met mutaties op posities over het Ub-oppervlak die de bekende Ub-eiwitinteracties bemiddelen, werd ontwikkeld. Deze bibliotheek bestond uit faagmiden die het M13 bacteriofaag pIII-vachteiwit tot expressie brengen, gefuseerd met gediversifieerde UbV's. Daarom kunnen individuele UbV's bij expressie via het vachteiwit op het faagoppervlak worden weergegeven. Tijdens het selectieproces worden fagen met UbV's met aanzienlijke bindingsinteracties met het doeleiwit behouden en verrijkt in volgende faagrondes, terwijl faag met UbV's die slecht binden aan het doeleiwit worden weggespoeld en uit de faagpool worden verwijderd. De vastgehouden faagdeeltjes bevatten het faagmide dat overeenkomt met hun weergegeven UbV, waardoor ze kunnen worden gesequenced en verder kunnen worden gekarakteriseerd zodra ze zijn geïsoleerd.

Met behulp van deze eiwittechnologiestrategie werden UbV-remmers ontwikkeld voor menselijke deubiquitinasen5 en virale proteasen6. Belangrijk is dat we remmende UbV's hebben gegenereerd voor menselijke HECT-familie E3-ligases door de E2-bindingsplaats te kapen en UbV's te activeren die een Ub-bindende exosiet op het HECT-domein ^bezetten7. We kunnen ook monomere RING-familie E3's remmen door ons te richten op de E2-bindingsplaats en UbV-dimerisatie induceren om homodimere RING ^E3s8 te activeren. Voor ring-E3's met meerdere subeenheden kunnen UbV's remming bereiken door zich te richten op de RING-subeenheid (bijvoorbeeld voor APC / ^C-complex9) of complexe vorming te verstoren (bijvoorbeeld voor SCF E3s10). Gezamenlijk kunnen UbV's worden gebruikt om systematisch eiwit-eiwitinteracties in het Ub-proteasoomsysteem (UPS) te ondervragen, zodat we biochemische mechanismen van UPS-enzymen beter kunnen ontcijferen en functionele locaties voor therapeutische interventie kunnen identificeren en valideren.

Het volgende protocol beschrijft hoe een eerder gegenereerde faag weergegeven UbV-bibliotheek kan worden gebruikt om een eiwit van belang te targeten en hoe de UbV-bindmiddelen die interageren met het doeleiwit kunnen worden verrijkt door middel van opeenvolgende faagweergaverondes.

Protocol

1. Reagensvoorbereiding

1. PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing): Meng 50 ml 10x PBS-oplossing met 450 ml ultrapuur _H2O. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C of kamertemperatuur (~ 20-25 °C).
2. 10% BSA (runderserumalbumine): Voeg langzaam 1 g BSA toe aan 7 ml ultrapuur _H2O en meng tot het volledig is opgelost (geen klonten). Vul aan met ultrapuur _H2O totdat het uiteindelijke volume 10 ml is. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C.
3. PB-buffer (PBS aangevuld met 1% BSA): Voeg langzaam 5 g BSA toe aan 400 ml ultrapuur _H2O en 50 ml PBS en meng tot het volledig is opgelost (geen klonten). Vul aan met ultrapuur _H2O totdat het uiteindelijke volume 500 ml is. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C.
4. PBT-buffer (PBS aangevuld met 1% BSA en 0,05% Tween 20): Voeg langzaam 5 g BSA toe aan 400 ml ultrapuur _H2O en 50 ml PBS en meng totdat het volledig is opgelost (geen klonten). Voeg 250 μL Tween 20 toe. Vul aan met ultrapuur _H2O totdat het uiteindelijke volume 500 ml is. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C.
5. PT-buffer (PBS aangevuld met 0,05% Tween 20): Meng 1 ml Tween 20 met 400 ml PBS. Vul aan met ultrapuur _H2O tot het uiteindelijke volume 2 L is. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C of kamertemperatuur (~20-25 °C).
6. 2YT bouillon: Voeg 16 g trypton, 10 g gistextract en 5 g NaCl toe aan 800 ml ultrapuur _H2O en meng tot het volledig is opgelost (geen klonten). Vul aan met ultrapuur _H2O tot het uiteindelijke volume 1 L is. Steriliseer door autoclaveren en bewaar bij kamertemperatuur (~ 20-25 °C).
7. LB/carb-platen: Voeg 12,5 g vooraf gemaakt LB-mengsel en 7,5 g agar toe aan 400 ml _H2O. Vul aan met ultrapuur _H2O tot het uiteindelijke volume 500 ml is en steriliseer door autoclaveren. Zorg ervoor dat agar volledig is opgelost en wacht tot het is afgekoeld tot onder de 60 °C. Voeg 500 μL 100 mg ml carbenicilline toe, meng goed en giet op het bord. Bewaren bij 4 °C.
8. LB/tet-platen: voeg 12,5 g vooraf gemaakt LB-mengsel en 7,5 g agar toe aan 400 ml ultrapuur _H2O. Vul aan met ultrapuur _H2O tot het uiteindelijke volume 500 ml is en steriliseer door autoclaveren. Zorg ervoor dat agar volledig is opgelost en wacht tot het is afgekoeld tot onder de 60 °C. Voeg 500 μL tetracycline van 10 mg ml toe, meng goed en giet op het bord. Bewaren bij 4 °C.
9. 20% PEG (polyethyleenglycol)/2,5 M NaCl: Voeg 50 g PEG-8000 en 36,5 g NaCl toe aan 200 ml ultrapuur _H2O. Meng tot het volledig is opgelost.
   OPMERKING: Dit kan een tijdje duren; verwarming kan helpen. Vul aan met ultrapuur _H2O totdat het uiteindelijke volume 250 ml is. Steriliseren door filtratie of autoclaveren.
10. 0,1 M HCl: Meng 20 ml van 1 M HCl met 180 ml ultrapuur _H2O. Steriliseer door filtratie en bewaar bij kamertemperatuur (~ 20-25 °C).
11. 1 M Tris (pH 11,0): Voeg 6,1 g Tris-basis toe aan 40 ml ultrapuur _H2O. Stel de pH in op 11,0 met HCl en meng tot Tris volledig is opgelost. Vul aan met ultrapuur _H2O totdat het uiteindelijke volume 50 ml is. Steriliseer door filtratie en bewaar bij kamertemperatuur (~ 20-25 °C).
12. 100 mg/ml (1000x) carbenicilline: voeg 2 g van het carbenicilline dinatriumzout toe aan 20 ml ultrapuur _H2O. Meng tot het volledig is opgelost. Steriliseer door filtratie en bewaar bij -20 °C.
13. 50 mg /ml (1000x) kanamycine: Voeg 1 g kanamycinesulfaat toe aan 20 ml ultrapuur _H2O. Meng tot het volledig is opgelost. Steriliseer door filtratie en bewaar bij -20 °C.
14. 10 mg/ml (1000x) tetracycline: voeg 0,2 g tetracyclinehydrochloride toe aan 20 ml 70% ethanol. Meng tot het volledig is opgelost. Steriliseer door filtratie en bewaar bij -20 °C.

2. Eiwitbereiding

1. Bepaal de concentratie van de doeleiwitvoorraad in μM. De handigste manier om de eiwitconcentratie te beoordelen is het meten van de absorptie van de eiwitvoorraad bij 280 nm. Als de concentratie bekend is in mg/ml, zet deze dan om in μM met behulp van het molecuulgewicht van het doeleiwit. Een reeks methoden kan worden gebruikt, afhankelijk van het eiwit van belang; zie het gedeelte Discussie voor meer informatie.
   OPMERKING: Als het eiwit is afgekapt (specifiek eiwitdomein/motief) of is gelabeld, vergeet dan niet om rekening te houden met deze veranderingen in molecuulgewicht bij het omzetten van mg / ml naar μM.
2. Bereid drie microcentrifugebuizen voor met het label "ronde 1", "ronde 2/3" en "ronde 4/5".
   1. Bereken het eiwitvolume dat nodig is om het te verdunnen tot 1 μM in 800 μL PBS en aliquoteer dit volume in de buizen zonder PBS toe te voegen.
      OPMERKING: Als de beschikbare hoeveelheid doeleiwit laag is, kan de concentratie worden verlaagd tot slechts 0,25 μM.

3. Voorbereiding op selectieronde

1. Bereid een zaadcultuur voor voor het kweken van de faaginvoer voor ronde twee van selectie.
   1. Ent 5 ml 2YT/tet met een goed geïsoleerde Escherichia coli-kolonie en incubeer 's nachts bij 37 °C met 200 tpm orbitaal schudden.
2. Coat de plaat voor de eerste selectieronde.
   1. Verdun het doeleiwit in de "ronde 1" buis met de juiste hoeveelheid PBS en aliquot 100 μL in acht putjes van een 96-putbindingsplaat (d.w.z. de doelplaat).
      OPMERKING: Faagweergave kan worden gedaan voor vier verschillende eiwitten tegelijkertijd op een enkele plaat door de putten in de hoeken van de plaat te coaten.
   2. Optionele controle: Als het doeleiwit is gelabeld, zoals met GST of MBP (maltosebindend eiwit), bedekt u acht putjes in een andere 96-putbindingsplaat met 100 μL van een 1 μM-oplossing met het juiste epitooplabel. Dit wordt gebruikt om ongewenste fagen te verwijderen die niet-specifiek aan de tag binden.
   3. Schud plaat(en) 's nachts bij 4 °C met 200 rpm orbitaal schudden.

4. Rond een van de selectie af

1. Bereid de ronde twee input voor.
   1. Ent 30 ml 2YT/tet met 200 μL van de zaadkweek vanaf stap 3.1.
   2. Incubeer bij 37 °C met 200 tpm orbitaal schudden totdat de bacteriën zich in de middenlogfase bevinden (_OD600 0,6 - 0,8). Dit duurt ongeveer drie uur.
2. Blokkeer doelplaat.
   1. Verwijder de coatingoplossing van de plaat, of beide platen als er een controleplaat is gemaakt, door om te keren en te schudden over een gootsteen. Dep droog op keukenpapier.
   2. Voeg 300 μL PB-buffer toe aan elke gecoate put.
   3. Verwijder de PB-buffer zoals in stap 4.2.1 en voeg nog eens 200 μL PB-buffer toe.
   4. Incubeer bij kamertemperatuur (~ 20-25 ° C) gedurende 1 uur met 300 tpm orbitaal schudden.
3. Faagbibliotheek voorbereiden.
   1. Ontdooi de faagbibliotheek op ijs en verdun deze tot 100x de bibliotheekdiversiteit in PBS. Als de bibliotheekdiversiteit bijvoorbeeld 1 x ¹⁰¹⁰ is en de bibliotheekconcentratie 1 x ¹⁰¹³, verdunt u de bibliotheek zodat de concentratie 1 x ¹⁰¹² is. Voor de bibliotheken die hier worden gebruikt, verdunt u ze 10-voudig in PBS door 1 ml van de bibliotheek te combineren met 9 ml PBS.
      OPMERKING: De diversiteit van bibliotheken had tijdens het maken van de bibliotheek moeten worden bepaald en kan niet gemakkelijk anders worden beoordeeld. De bibliotheekconcentratie kan worden bepaald door E. coli-cellen in de mid-logfase (_{OD600 0,6} - 0,8) te enten op LB /carb.
   2. Voeg 1/5 volume PEG/NaCl toe. Voeg bijvoorbeeld voor 10 ml van de eerder verdunde bibliotheek 2 ml PEG/NaCl toe.
   3. Incubeer op ijs gedurende 30 min.
   4. Centrifugeer bij 11.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C, gooi supernatant weg encentrifugeer gedurende 2 minuten om het resterende supernatant naar beneden te trekken.
      OPMERKING: Plaats de buis de tweede keer in dezelfde richting in de rotor als de eerste keer om de pellet op dezelfde plaats te houden, waardoor deze gemakkelijker te zien is.
   5. Resuspend de faagkorrel voorzichtig in 1 ml PBT per eiwit. Voor vier eiwitten, resuspend de pellet in 4 ml PBT.
      OPMERKING: Probeer de pellet niet aan te raken en introduceer geen luchtbellen.
4. Geef faag weer aan de doeleiwit(en).
   1. Optionele controle: Voeg 100 μL faagbibliotheek toe aan elke gecoate put in de controleplaat. Incubeer bij kamertemperatuur (~ 20-25 °C) gedurende 1 uur met 300 tpm orbitaal schudden en breng de bibliotheek over van de bedieningsplaat naar de doelplaat. Sla stap 4.4.2 over.
   2. Verwijder de PB-buffer van de doelplaat zoals in stap 4.2.1 en voeg 100 μL van de faagbibliotheek toe aan elke gecoate put.
   3. Incubeer bij kamertemperatuur (~ 20-25 ° C) gedurende 1 uur met 300 tpm orbitaal schudden.
5. Elute ronde één faag.
   1. Verwijder de faagbibliotheek en was de gecoate putjes vier keer met PT-buffer. Keer de plaat om en tik op een papieren handdoek om de laatste druppels te verwijderen.
      OPMERKING: Als meerdere doeleiwitten op één plaat zijn gecoat, probeer dan de stroom van alle volgende oplossingen tussen de putten te minimaliseren.
   2. Voeg 100 μL van 0,1 M HCl toe aan elke gecoate put en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met 300 rpm orbitaal schudden.
   3. Neutraliseer de pH door 12,5 μL van 1 M Tris-HCl (pH 11) toe te voegen aan elke gecoate put.
   4. Bundel de geëlueerde faag uit alle 8 putten in een enkele microcentrifugebuis van 1,5 ml. Pipetteer op en neer tijdens de overdracht om oplossingen homogeen te maken en alle vloeistof uit de putten op te zuigen.
   5. Voeg 10% BSA toe aan de gepoolde geëlueerde faag tot een eindconcentratie van 1%. Voeg voor een typisch oplossingsvolume van 950 μL 95 μL 10% BSA toe. Bewaren bij 4 °C. Dit is de ronde één uitgang.

5. Voorbereiding op volgende selectierondes

1. Bereid een zaadkweek voor op het kweken van de faaginvoer voor de volgende selectieronde zoals in stap 3.1.
2. Bekleed de plaat voor de derde selectieronde zoals in stap 3.2 met de onderstaande wijzigingen.
   1. Bestrijk slechts vier putjes per eiwit in een 96-putbindingsplaat. Gebruik de helft van de inhoud van de "ronde 2/3" of "ronde 4/5" buizen voor de juiste ronde. Verdun de inhoud van deze buisjes indien nodig om te voorkomen dat eiwitten uit de oplossing bezinken.
3. Bereid de faaginvoer voor op de volgende selectieronde.
   1. Gebruik de helft van de round one-uitgang uit stap 4.5.5 om 3 ml mid-log fasecellen uit stap 4.1 te enten. Voor een typische ronde uitgang, ent u met 500 μL van de uitgang.
   2. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten met 200 rpm orbitaal schudden.
   3. Voeg M13K07 helperfaag toe aan een eindconcentratie van 1 x ¹⁰¹⁰ PFU/ml.
   4. Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur met 200 tpm orbitaal schudden.
   5. Breng de volledige 3 ml cultuur over op 30 ml 2YT /carb / kan. Groei 's nachts bij 37 °C met 200 rpm orbitaal schudden.
   6. Breng de volgende dag de cultuur over in een centrifugebuis van 50 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 11.000 x g om cellen neer te slaan.
   7. Decanteer het supernatant in een nieuwe centrifugebuis van 50 ml en meng met 8 ml PEG/NaCl en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
   8. Centrifugeer bij 11.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en centrifugeer opnieuw gedurende 2 minuten.
      OPMERKING: Plaats de buis de tweede keer in dezelfde richting in de rotor als de eerste keer om de pellet op dezelfde plaats te houden, waardoor deze gemakkelijker te zien is.
   9. Resuspend de faagkorrel in 800 μL PBT zodat deze volledig homogeen is en er geen klonten zichtbaar zijn.
   10. Breng de faagoplossing over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 4 minuten bij 4 °C bij 16.200 x g op pelletresten.
   11. Breng het supernatant over in een nieuwe microcentrifugebuis. Dit is de input voor de volgende selectieronde.
4. Optioneel: Titer de input en output oplossingen.
   1. Gebruik 500 μL van een E. coli-zaadkweek om 5 ml 2YT/tet te enten en incubate bij 37 °C met 200 rpm orbitaal schudden totdat bacteriën zich in de middenlogfase bevinden (_OD600 0,6 - 0,8). Dit duurt ongeveer 1 uur.
   2. Verdun faag input/output oplossingen tot ^10-3 - ^10-5 in PBS en voeg 10 μL van elke verdunning toe aan 90 μL gekweekte cellen.
      OPMERKING: Gebruik verdunde faagoplossingen onmiddellijk omdat faag na verloop van tijd aan de buis zal adsorberen en transformaties vals negatieven kunnen produceren.
   3. Incubeer bij 37 °C gedurende 20 minuten met 200 tpm orbitaal schudden.
   4. Plaat 5 μL op aparte LB/carb platen.
      OPMERKING: De hoeveelheid is variabel, afhankelijk van eerdere resultaten/persoonlijke voorkeur.

6. Volgende selectierondes

1. Voer alle volgende rondes uit samen met de voorbereiding zoals gedaan in respectievelijk stap 3 en 4, met onderstaande verschillen.
   1. Gebruik de input die in de vorige ronde is geproduceerd als faagbron in plaats van een bibliotheek. Bestrijk 4 putjes per doeleiwit met 100 μL van de faaginput verkregen uit de vorige ronde. Bewaar de resterende faagingangen bij 4 °C.
   2. Maak de wasstap in 4.5.1 strenger bij elke selectieronde. Ronde één vereist 4 keer wassen, ronde twee vereist 6 keer, ronde drie vereist 8 keer en ronde vier en vijf vereisen beide 10 keer wassen.
   3. Verminder sommige volumes in vergelijking met die in ronde één, omdat volgende rondes slechts vier putten bedekken in plaats van acht. In stap 4.5.5 wordt bijvoorbeeld slechts 45 μL van 10% BSA aan de faaguitgang toegevoegd en in stap 5.3.1 wordt slechts 250 μL van de faaguitgang gebruikt om cellen te enten.

7. Naselectieverwerking en faagisolatie

1. Titer de input- en outputoplossingen voor ronde vier en vijf.
   1. Als dit nog niet is gedaan in stap 5.4, volgt u dezelfde stappen om rondes vier en vijf faaguitgangen te titeren, idealiter produceert u een bereik van 30-300 kolonies over een paar platen.
2. Kweek en isoleer faag.
   1. Aliquot 450 μL 2YT/carb/M13K07 in elke buis van een 96 mini tube kweekdoos.
   2. Kies goed geïsoleerde kolonies van een van de platen uit stap 7.1 om elke buis te inenten.
      OPMERKING: Gebruik de bovenste helft van de doos voor ronde vier uitgangen en de onderste helft voor ronde vijf uitgangen.
   3. Incubeer 's nachts bij 37 °C met 200 tpm orbitaal schudden.
   4. Centrifugeer bij 1.200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
   5. Breng zoveel mogelijk supernatant over naar een nieuwe 96 mini tube kweekdoos zonder de celkorrel te storen en gooi de oude weg. Bewaren bij 4 °C.
   6. Breng vanuit de nieuwe doos 100 μL van elke buis over naar een 96 put niet-bindende plaat met 100 μL 50% glycerol in alle putten. Meng goed en bewaar bij -80 °C als reservevoorraad.

Results

Bindmiddelen geproduceerd uit faagweergave kunnen op vele manieren worden geverifieerd en geanalyseerd. Het wordt aanbevolen om eerst over te gaan tot het sequencen van de faag met primers die de gediversifieerde insert in de faagmidbibliotheek flankeren. Een ideaal faagweergave-experiment zal een duidelijke voorkeur voor verschillende sequenties laten zien (figuur 1). Andere sequenties zullen ook aanwezig zijn, maar met een lagere telling, die meer als achtergrondgeluid verschijnen. In het ...

Discussion

Zoals vermeld in stap 2.1 (eiwitpreparaat), kunnen verschillende methoden worden gebruikt om de eiwitconcentratie te beoordelen, en elk zal unieke voor- en nadelen hebben op basis van het specifieke doeleiwit dat wordt gebruikt voor faagweergave. Een bron van gedetailleerde beschrijvingen en protocollen voor populaire methoden is eerder ^verstrekt11.

Het gebruik van de faag die door een vorige faagronde wordt vastgehouden als input voor een volgende ronde verrijkt de goe...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterieel, 96/Rak, 10 Rakken/verpakking)	Fisher Scientific	14-222-198	Cultiveren van faagoutputs na faagdisplay.
BD Difco Gedehydrateerd Cultuurmedium: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Scientific	DF0446-17-3	Platen voor titering voorbereiden.
Bovine Serum Albumine (BSA), Fractie V	BioShop Canada	ALB001	Buffercomponent.
Carbenicilline dinatriumzout 89,0-100,5% watervrij	Millipore-Sigma	C1389-5G	Cultiveren van faagmid-geïnfecteerde cellen.
Compacte Digitale Microplaat Shaker	Fisher Scientific	11-676-337	Platen schudden tijdens incubatie met de fagenbibliotheek.
Corning Microplaat Aluminium Sealing Tape	Fisher Scientific	07-200-684	Fagenglycerolstokjes afdichten.
Gedehydrateerd Agar	Fisher Scientific	DF0140-01-0	Platen voor titering voorbereiden.
DS-11 Spectrofotometer/Fluorometer	DeNovix	DS-11 FX+	Eiwitconcentratiemeting.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Niet-Behandeld, U-Vormige Bodem Microplaat	Fisher Scientific	7000133	Opslaan van phagenglycerolstokjes.
Zoutzuur	Fisher Scientific	A144-500	Faagelutie.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemisch Competent E. coli	Fisher Scientific	C854003	Bacterieënstam voor faage-infectie.
Kanamycine Sulfaat	Fisher Scientific	AAJ1792406	Cultiveren van M13K07 helper-fagen geïnfecteerde cellen.
M13KO7 Helper Phaag	New England Biolabs	N0315S	Faagmid-verpakking en secretie toestaan.
MaxQ 4000 Tafelmodel Orbitale Shaker	Fisher Scientific	11-676-076	Bacterieëll cultuur.
Nunc MaxiSorp 96 wel microplaat, platte bodem	Life Technologies	44-2404-21	Eiwitten immobiliseren.
Fosfaat Gebufferde Saline (PBS) 10X Oplossing	Fisher Scientific	BP3994	Buffercomponent/phage resuspenderingsmedium.
Polyester Films voor ELISA en Incubatie	VWR	60941-120	Microplates bedekken tijdens incubatie.
Polyethyleen Glycol 8000 (PEG)	Fisher Scientific	BP233-1	Faageprecipitatie.
Natriumchloride	Millipore-Sigma	S3014	Faageprecipitatie.
Steriele Plastic Cultuurbuizen: Doorschijnende Polypropyleen	Fisher Scientific	14-956-1D	Cultiveren van phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride	Fisher Scientific	BP912-100	Cultiveren van E. coli OmniMax cellen.
Tris Base	Fisher Scientific	BP1525	Geëluteerde phageoplossing neutraliseren.
Trypton Poeder	Fisher Scientific	BP1421-2	Celgroei media component.
Tween 20	Fisher Scientific	BP337500	Buffercomponent.
Gist Extract	Fisher Scientific	BP1422-2	Celgroei media component.