Omgekeerde genetische benadering om regulatoren van pigmentatie te identificeren met behulp van zebravissen

Babita Sharma; Yogaspoorthi J. Subramaniam; Desingu Ayyappa Raja; Ayush Aggarwal; Sridhar Sivasubbu; Vivek T. Natarajan

doi:10.3791/62955

Methodenartikel

Omgekeerde genetische benadering om regulatoren van pigmentatie te identificeren met behulp van zebravissen

DOI:

10.3791/62955

⸱

1 maart 2022

Babita Sharma^*¹^,² , Yogaspoorthi J. Subramaniam^*¹^,² , Desingu Ayyappa Raja¹^,²^,³ , Ayush Aggarwal¹^,² , Sridhar Sivasubbu¹ , Vivek T. Natarajan¹^,²

¹CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, ²Academy of Scientific and Innovative Research, ³Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regulatoren van melanocytenfuncties regelen zichtbare verschillen in de pigmentatie-uitkomst. Het ontcijferen van de moleculaire functie van het kandidaat-pigmentatiegen vormt een uitdaging. Hierin demonstreren we het gebruik van een zebravismodelsysteem om kandidaten te identificeren en in te delen in regulatoren van melaninegehalte en melanocytenaantal.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Melanocyten zijn gespecialiseerde neurale top-afgeleide cellen die aanwezig zijn in de epidermale huid. Deze cellen synthetiseren melaninepigment dat het genoom beschermt tegen schadelijke ultraviolette straling. Verstoringen in het functioneren van melanocyten leiden tot pigmentstoornissen zoals piebaldisme, albinisme, vitiligo, melasma en melanoom. Zebravis is een uitstekend modelsysteem om melanocytenfuncties te begrijpen. De aanwezigheid van opvallende gepigmenteerde melanocyten, het gemak van genetische manipulatie en de beschikbaarheid van transgene fluorescerende lijnen vergemakkelijken de studie van pigmentatie. Deze studie maakt gebruik van wild-type en transgene zebravislijnen die groene fluorescerende eiwit (GFP) expressie aandrijven onder mitfa- en tyrp1-promotors die verschillende stadia van melanocyten markeren.

Morpholino-gebaseerde uitschakeling van kandidaatgenen wordt bereikt om de fenotypische uitkomst op larvale pigmentatie te evalueren en is van toepassing op screening op regulatoren van pigmentatie. Dit protocol demonstreert de methode van micro-injectie tot beeldvorming en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) -gebaseerde dissectie van fenotypes met behulp van twee kandidaatgenen, koolzuuranhydrase 14 (Ca14) en een histonvariant (H2afv), om de pigmentatie-uitkomst uitgebreid te beoordelen. Verder toont dit protocol het scheiden van kandidaatgenen in melanocytenspecificeerders en differentiatoren die respectievelijk selectief het melanocytenaantal en het melaninegehalte per cel veranderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel het gebruik van melanine voor fotoprotectie verschillende keren in het dierenrijk is geëvolueerd, hebben gewervelde dieren het proces schijnbaar geperfectioneerd. Speciale pigmentproducerende cellen met een uitgebreide machinerie om melanine te synthetiseren en te bevatten, worden bewaard van vis tot mens¹. Het resultaat van pigmentatie is echter dramatisch gevarieerd, variërend in de kleur tot recipience en presenteert zich als levendige patronen op integumenten, de huid en het haar². Ondanks de diversiteit is het repertoire van genen die betrokken zijn bij pigmentatierespons opvallend bewaard gebleven. De kernco....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebravisexperimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de institutionele goedkeuring van dierethiek (IAEC) van het CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology (IGIB), India (voorstel nr. 45a). Alles werd in het werk gesteld om dierenleed tot een minimum te beperken.

1. Morpholino injecteren in zebravisembryo's

Teken met behulp van een standaard naaldtrekker zeer scherpe en gesloten pipetten.
Laad de oplossing met morfolino in de micropipetten met behulp van een microloaderpunt en steek deze in het micro-injectorapparaat. Draai de schroef goed vast om de micropipet te vergrendelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De workflow beschreven in figuur 1 werd gebruikt om op morfolino gebaseerde genetische verstoring uit te voeren in het eencellige stadium van de zebravis. Pigmentatieanalyse werd uitgevoerd met behulp van verschillende methoden, zoals hieronder vermeld. Om de representatieve resultaten te illustreren, werden gestandaardiseerde volumes antisense morpholino gericht op h2afv - en ca14-genen geïnjecteerd in het dooier- of eencellige stadium van het zebravisembryo. De initiële f.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pigmentatiefenotype manifesteert zich vaak als veranderingen in het gehalte aan melanine of het aantal pigmentdragende melanocyten. De hierin beschreven methode maakt de ontleding van deze dichotomie mogelijk en maakt zowel kwalitatieve als kwantitatieve beoordeling van het melaninegehalte en het aantal melanoforen per embryo mogelijk, ongeacht het melaninegehalte. De hoge vruchtbaarheid van zebravissen, de zichtbare aard van gepigmenteerde melanocyten en het gebrek aan melanosoomoverdracht maken de dissectie van melanoc.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen de financiële steun van de Council for Scientific and Industrial Research vide project MLP2008 en het Department of Science and Technology voor het project GAP165 voor het ondersteunen van het werk dat in dit manuscript wordt gepresenteerd. We bedanken Jeyashri Rengaraju en Chetan Mishra voor hun hulp bij experimenten.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL Microtubes	Axygen	MCT-150-A	Voor het bereiden van MO-oplossing
2 mL Microtubes	Axygen	MCT-200-C	Voor wasstappen in FACS-protocol
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9539-500G	Voor micro-injectie
BD FACSAria II	BD Biosciences	NA	Voor celsorteer
Capillaire buis	Drummond	1-000-0010
Corning celzeef	Corning	CLS431751	Voor het maken van een enkele celsuspensie
DMEM High Glucose Media	Sigma-Aldrich	D5648	FACS-protocol
Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521-50G	Om ZF te immobiliseren voor beeldvorming
Ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134	Voor koude lysis buffer
FACS buizen	BD-Biosciences	342065	FACS-protocol
Fetaal bovien serum (FBS)	Invitrogen	10270	FACS-protocol
Graphpad prism Software	Graphstats Technologies	NA	Voor gegevensweergave
ImageJ Software	National Institute of health	NA	Voor beeldanalyse
Insuline spuiten (1 mL)	DispoVan	NA	Voor handmatige dechorionatie
Melanine, Synthetisch	Sigma-Aldrich	M8631	Voor melaninegehalte-assay
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7027-250G	Om ZF te immobiliseren voor beeldvorming
Microloader tips	Eppendorf	5242956003	Voor micro-injectie
Morpholino	Gene-tools	NA	Voor knock-down experimenten
N-fenylthioureum (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	Om melaninevorming te remmen
Naaldtrekker	Sutter Instrument	P-97	Voor micro-injectie
Nunc 15 mL Conische Sterile Polypropyleen Centrifugeerbuizen	Thermo Fisher Scientific	339650	FACS-protocol
Petrischaal (60 mm)	Tarsons	460090	Voor embryoplaten
Fenylmethylsulfonylfluoride	Sigma-Aldrich	10837091001	Voor koude lysis buffer
Fosfaat bufferoplossing (PBS)	HiMedia	TL1099-500mL	Voor het wassen van cellen
Pronase	Sigma-Aldrich	53702	Voor dechorionatie
Protease-remmercocktail	Sigma-Aldrich	P8340	Voor koude lysis buffer
Sheath vloeistof	BD FACSFlow^TM	342003	FACS-protocol
Natriumfosfaat	Merck	7558-79-4	Koude lysis buffer
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	Voor koude lysis buffer
TrypLE	Gibco	1677119	Voor trypsinisatie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kelsh, R. N. Genetics and evolution of pigment patterns in fish. Pigment Cell Research. 17 (4), 326-336 (2004).
Jablonski, N. G. The evolution of human skin and skin color. Annual Review of Anthropology. 33, 585-623 (2004).
Hoekstra, H.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Reverse Genetics Zebrafish Pigmentation Melanocyte Biology Morpholino Silencing Fluorescence Imaging Flow Cytometry Melanin Quantification Transgenic Zebrafish Melanophore Stripes CRISPR Technology

Omgekeerde genetische benadering om regulatoren van pigmentatie te identificeren met behulp van zebravissen

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Inleiding

Protocol

Resultaten

Discussie

Openbaarmakingen

Dankbetuigingen

Materialen

Referenties

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Gerelateerde artikelen