Tumorinhoud verbeteren door tumormacrodissectie

Samenvatting

Dit protocol presenteert een methode om het percentage tumorgehalte van formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde weefselmonsters te verhogen.

Samenvatting

De aanwezigheid van contaminerende niet-tumorweefsels in formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) weefsels kan genomische studies sterk ondermijnen. Hierin beschrijven we macrodissectie, een methode die is ontworpen om het percentage tumorgehalte van een weefselmonster te vergroten door ongewenst weefsel te verwijderen en te elimineren voorafgaand aan het uitvoeren van downstream nucleïnezuurextracties. FFPE-weefselblokken werden doorsneden om 4-5 μm op dia's gemonteerde weefselsecties te produceren. Een representatieve sectie werd ingediend voor hematoxyline en eosine (H &E) kleuring en vervolgens beoordeeld door een board-gecertificeerde patholoog. Tijdens de beoordeling identificeerde en markeerde de patholoog de regio's van tumorweefsel in de H &E. Eenmaal voltooid, werd de gemarkeerde H &E gebruikt om resectie van de seriële niet-gekleurde secties van hetzelfde weefselblok te begeleiden. Om de effecten van macrodissectie aan te tonen, werd RNA geëxtraheerd uit gematchte macrodissected en niet-ontleed diffuse grote B-cellymfomen (DLBCL) uitgevoerd op een digitale genexpressietest die in staat is om het DLBCL-subtype en de BCL2-translocatiestatus te bepalen. De resultaten toonden aan dat macrodissectie het subtype of BCL2-translocatiestatusaanroepen in 60% van de onderzochte monsters veranderde. Kortom, macrodissectie is een eenvoudige en effectieve methode voor het uitvoeren van tumorverrijking voorafgaand aan nucleïnezuurextracties, waarvan het product vervolgens met vertrouwen kan worden gebruikt in downstream genomische studies.

Inleiding

Formaline-fixed paraffine-embedded (FFPE) weefsels, verzameld als onderdeel van het normale klinische diagnostische proces en bewaard in klinische weefselrepository's, vormen een enorme bron voor menselijk onderzoek, waaronder kankeronderzoek¹. Naarmate ons begrip van menselijke ziekten zich verdiept, wordt het steeds duidelijker dat ziekten, waarvan eerder werd gedacht dat ze afzonderlijke entiteiten waren op basis van morfologische en immunofenotypische kenmerken, in feite bestaan uit verschillende moleculaire subtypen die moleculaire subtyperingstests vereisen. Bijgevolg zijn hoogsensitieve genomische assays die in staat zijn om deze subtypen te onderscheiden steeds belangrijker geworden². Hoewel FFPE-weefsels bekend staan als slecht compatibel met genomische technieken als gevolg van fixatiegerelateerde problemen, worden deze technieken naarmate de technologie en protocollen evolueren steeds meer compatibel met dit klinisch alomtegenwoordige weefselformaat ^3,4,5. FFPE-weefsels zijn echter vaak mengsels van tumor- en niet-tumorweefselmaterialen, waarbij de aanwezigheid van niet-tumormateriaal vaak ongewenst is en, indien aanwezig in een hoog percentage, de resultaten van genomische analyses aanzienlijk kan ondermijnen en beïnvloeden⁶. Inderdaad, een minimum tumorgehalte van 60% wordt vaak gebruikt voor dergelijke analyses, waarbij weefsels die onder deze drempel vallen, kunnen worden uitgesloten, ondanks dat ze anderszins aan de onderzoekscriteria voldoen⁷. Dit kan met name problematisch zijn in instellingen voor zeldzame ziekten, waar patiëntweefsels kostbaar en moeilijk in grote aantallen te verzamelen zijn.

Macrodissectie is een methode die de effecten van een laag tumorgehalte minimaliseert door de hoeveelheid normaal weefsel te verminderen³. De verwijdering van dergelijk verstorend niet-tumormateriaal voorafgaand aan nucleïnezuurextractie kan het tumorpercentagegehalte en dus de tumorzuiverheid van de geëxtraheerde nucleïnezuren aanzienlijk vergroten. Weefselresectie is kritisch afhankelijk van deskundige pathologische beoordeling, waarbij het tumorgebied wordt geïdentificeerd en omcirkeld op een vers gegenereerde hematoxyline en eosine (H &E) gekleurde weefselsectie door een door de raad gecertificeerde patholoog⁸. De omcirkelde H &E wordt vervolgens gebruikt om de verwijdering en verzameling van ongewenste en doelweefsels te begeleiden. Dit protocol beschrijft de stappen van macrodissectie van pathologische beoordeling tot weefseloogst zoals uitgevoerd in het AIDS and Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory in de Mayo Clinic.

Protocol

Alle monsters werden verzameld en gebruikt in overeenstemming met goedgekeurde Mayo Clinic IRB-protocollen (PR16-000507 en PR2207-02).

1. Monstervoorbereiding

1. Schakel het weefsel floatation waterbad in. Stel de temperatuur in op 39 °C en laat het water op temperatuur komen. Week houten opvangstokken in het waterbad.
2. Identificeer en haal de te snijden FFPE-weefselblokken op.
3. Pre-label microscoopglaasjes met behulp van een permanente marker van histologiekwaliteit die bestand is tegen oplosmiddelwassingen.
4. Gebruik een microtoom om de FFPE-blokken door te snijden. Snijd ten minste 2 full-face secties met een dikte van 4-5 μm per sectie voor elk blok (figuur 1A).
5. Breng het vers doorgeknipte lint van weefselsecties over naar het voorverwarmde weefselzwembad voor schuifmontage (figuur 1B, C).
   OPMERKING: Het warme water helpt om de rimpels in de secties te "gladstrijken" (figuur 1C).
6. Gebruik elke sectie achtereenvolgens en gebruik een tang om een enkele sectie van het lint af te breken (figuur 1D).
7. Verzamel de enkele sectie op een vooraf gelabeld microscoopglaasje.
   1. Dompel de microscoopglaas onder een hoek onder de sectie en plaats de dia zo dat de rand van het weefselgedeelte de dia raakt (figuur 1E).
   2. Eenmaal in contact met het weefselgedeelte, trekt u de glijbaan langzaam uit het drijfbad om het weefselgedeelte recht te laten trekken tegen de glijbaan als deze uit het water komt (figuur 1F).
8. Monteer 1 weefselsectie per dia en herhaal dit totdat alle secties zijn verzameld.
9. Laat de op de schuif gemonteerde weefselsecties grondig drogen bij kamertemperatuur (RT).

2. Pathologische beoordeling

1. Voer H &E-kleuring uit op één representatieve weefselsectie voor elk blok⁹.
2. Dien de vers bevlekte H &E's in voor pathologische beoordeling door een door de raad gecertificeerde patholoog.
   OPMERKING: Tijdens de beoordeling bepaalt en registreert de patholoog het percentage tumorgehalte in elk weefsel en cirkelt het tumorgebied op elke H &E-dia (zie figuur 2 en figuur 3, rij 1). Tabel 1 schetst het percentage tumorgehalte door cellulariteit bepaald tijdens de pathologische beoordeling van de H&E's voor monsters A-E weergegeven in figuur 3, rij 1. Secties met <60% tumorgehalte vereisen macrodissectie⁷. Het aantal secties dat nodig is voor nucleïnezuurextractie hangt af van de grootte van het omcirkelde tumorgebied. Als er in paragraaf 1 van het protocol onvoldoende secties zijn gesneden en verdere bezuinigingen mogelijk zijn, dan moeten er mogelijk extra secties worden gesneden.

3. Deparaffinisatie

1. Vul in een zuurkast twee glasvlekkenschalen voor met onverdunde histologiekwaliteit d-Limoneen of een oplosmiddel op basis van d-Limoneen en 1 glasvlekschaal met onverdunde 200-proof moleculaire ethanol.
   LET OP: Vermijd d-Limoneen contact met huid en ogen, vermijd inademing van damp of nevel en blijf uit de buurt van ontstekingsbronnen. Houd ethanol uit de buurt van hitte, vonken en open vuur, vermijd morsen en contact met de huid of ogen, ventileer goed en vermijd het inademen van dampen.
   OPMERKING: Vul de gerechten voldoende om de rekdia's onder te dompelen (figuur 4A); Er is 250 ml nodig om de getoonde 20-dia-kleuringsschalen te vullen. Vervang de d-Limoneen en ethanol wasbeurten na elke 40 dia's. D-Limoneen (C₁₀H₁₆) is een alternatief, even effectief en minder toxisch ontwasmiddel voor xyleen dat steeds gebruikelijker wordt in histologische methodologieën en na extractie nucleïnezuur van goede kwaliteit oplevert 10,11,12,13,14. Hoewel dit protocol kan worden uitgevoerd met behulp van meer biovriendelijke alternatieven¹⁵, moeten hun effecten, indien aanwezig, op de kwaliteit van geëxtraheerd nucleïnezuur nog worden bepaald.
2. Rek het niet-gebeitste FFPE-weefsel gemonteerde glijden in de glazen Coplin-schuifrekken (figuur 4A, inzet).
3. Dompel de rekgplaten onder in d-Limoneen wash 1 gedurende 2 min; voorzichtig roeren gedurende de eerste 20 s.
   OPMERKING: Om overdracht tussen wasbeurten te minimaliseren, moet u bij het verwijderen van het rek met dia's van een wasbeurt het rek kort laten uitlekken voordat u de bodem van het rek voorzichtig op tissuepapier dept om overtollige was te verwijderen.
4. Dompel de getrekte dia's onder in onverdunde D-Limoneen wash 2 gedurende 2 min; voorzichtig roeren gedurende de eerste 20 s. Verwijder, giet af en dep het rek opnieuw.
5. Dompel de rekglaasjes gedurende 2 minuten onder in de ethanolwas; voorzichtig roeren gedurende de eerste 20 s. Verwijder het rek en plaats het op een absorberend weefsel om af te tappen. Laat de dia's minstens 10 minuten aan de lucht drogen, maar niet langer dan 2 uur.

3. Macrodissectie

1. Vul op de bank een Coplin glazen pot voor met 50 ml 3% glycerol in DNase / RNase-vrij water
   OPMERKING: Vervang de glycerolwas na elke 40 dia's.
2. Pre-label en vul 1,5 ml microbuisjes voor met 160 μL weefselverteringsbuffer per microbuis.
   OPMERKING: Nucleïnezuurextracties uitgevoerd na macrodissectie gebruikten een DNA / RNA FFPE-extractiekit (tabel met materialen). De weefselverteringsbuffer die in dit protocol werd gebruikt, bestond dus uit 10 μL proteïnase K en 150 μL PKD-buffer.
3. Traceer de pathologische markeringen op de H &E op de achterkant van de gedeparaffineerde weefselglaasjes.
   OPMERKING: In vergelijking met niet-gedeparaffiniseerde weefsels (figuur 3, rij 2 en figuur 4B) zijn gedeparaffiniseerde weefsels wit en zeer zichtbaar (figuur 3, rij 3 en figuur 4C). Het is deze verhoogde zichtbaarheid en waarneembaarheid van gedeparaffineerde weefselkenmerken die macrodissectie mogelijk maken. Plaats de H&E met het gezicht naar beneden op de bank en plaats de voorkant van de gedeparaffineerde glijbaan tegen de achterkant van de gematchte patholoog beoordeeld H &E (figuur 4D). Lijn het gedeparaffineerde weefsel uit met het H&E-weefsel (figuur 4E). Het traceren van de markeringen van de patholoog is een cruciale stap in het macrodissectieproces en er moet voor worden gezorgd dat deze markeringen zo nauwkeurig mogelijk worden gereproduceerd. Dit kan met name een uitdaging zijn voor kleine en of losgekoppelde weefsels zoals monsters B, D en E (figuur 3, figuur 4E en figuur 4E inzet i). Om het traceren te vergemakkelijken, moet men een inktvlekijne of ultrafijne nibbed marker (figuur 4E, inzet ii) gebruiken om de door de patholoog getekende markeringen te traceren. Ethanoldoekjes kunnen nuttig zijn om fouten te verwijderen en indien nodig retracing mogelijk te maken.
4. Draai het nu gemarkeerde gedeparaffineerde diaweefsel met de voorkant naar boven en volg de lijn van de marker met de hoek van een schoon scheermesje om de randen van het tumorgebied vooraf te snijden.
5. Behandel elke dia sequentieel en dompel de gedeparaffineerde dia's in de 3% glyceroloplossing. Zorg ervoor dat het weefsel volledig ondergedompeld is voordat u de dia langzaam verwijdert (figuur 4F).
   OPMERKING: Het doel van de glyceroldip is om het weefsel te dempen om de weefselverzameling te bevorderen, maar ook om de opbouw van statische lading te verminderen die afstoting kan veroorzaken tussen het weefsel en de plastic microbuis waarin het verzamelde weefsel moet worden geplaatst.
6. Veeg voorzichtig de achterkant van de dia af met een tissue om de overtollige glyceroloplossing te verwijderen en leg de glijbaan op de bank, met de zijkant naar beneden afgeveegd. Laat weefsels kort luchten gedurende 1-2 minuten.
   OPMERKING: Overdracht van overtollige glycerol in het extractieproces kan de opbrengst en kwaliteit van nucleïnezuurextracties negatief beïnvloeden. Weefsels moeten licht vochtig zijn, maar niet zichtbaar nat wanneer ze worden verzameld.
7. Afhankelijk van waar het tumorgebied van belang zich op de dia bevindt, gebruikt u de platte rand van het scheermesje om (a) het tumorweefsel rechtstreeks te verzamelen, het scheermes te gebruiken om het interessante weefsel van de dia te schrapen / verzamelen, of (b) eerst niet-tumorweefsel te verwijderen en weg te gooien voordat het tumorweefsel van belang wordt verzameld (figuur 3).
   OPMERKING: Verzameld weefsel heeft de neiging zich te verzamelen of op te rollen aan de onderkant van het blad (figuur 4G)
8. Gebruik een houten stok om het verzamelde weefsel van het mes te verwijderen (figuur 4H en inzet) en breng het over naar de juiste voorgelabelde en voorgevulde microbuis (figuur 4I).
   OPMERKING: De digestiebuffer dient om het weefsel van de houten pik in de vloeistof te "trekken".
9. Ga verder met nucleïnezuurextractie.
   OPMERKING: Nucleïnezuurextracties werden voltooid met behulp van de DNA / RNA FFPE-extractiekit volgens de instructies van de fabrikant en de resulterende nucleïnezuren werden gekwantificeerd met behulp van een UV-vis-spectrofotometer. Het resulterende RNA werd uitgevoerd op de op digitale genexpressieprofilering gebaseerde DLBCL90-test¹⁶.

Resultaten

Een totaal van 5 Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL) FFPE-weefselblokken werden doorsneden en de resulterende secties werden macrodisseceerd of niet voorafgaand aan nucleïnezuurextractie. Het geëxtraheerde RNA werd uitgevoerd op de DLBCL90-test¹⁶. Macrodissected monsters werden tweemaal uitgevoerd, eenmaal met 5 μL RNA-voorraadconcentratie, maar niet meer dan 300 ng van de totale RNA-input en eenmaal met 5 μL RNA-voorraad verdund om overeen te komen met de RNA-inputs van hun respectieve niet-ontleedde tegenhangers. De resultaten van DLBCL90 zijn weergegeven in tabel 2.

DLBCL bestaat uit 3 verschillende cel van oorsprong (COO) subtypes met verschillende therapeutische responsiviteit, namelijk GCB, ABC en een tussengroep die bekend staat als unclassified of UNC^17,18. Translocaties met MYC, BCL2 en of BCL6 alleen of in combinatie (dubbele of driedubbele treffer) worden ook vaak waargenomen in DLBCL, met name in het GCB-subtype¹⁹. De DLBCL90-test is een uitbreiding van zijn voorganger, de Lymph2Cx klinische test, en is dus in staat tot DLBCL COO-subtypebepaling, maar werd voornamelijk ontwikkeld om monsters te identificeren die double hit (DH) translocaties met BCL2 bevatten met behulp van digitale genexpressie als alternatief voor fluorescentie in-situ hybridisatie (FISH)^16,20. De resultaten in tabel 2 laten zien dat macrodissectie de COO of de DHITsig-status heeft veranderd voor 60% (3/5) van de onderzochte monsters.

Macrodissectie van steekproef A had geen effect op de COO-oproep, maar veranderde de DHITsig-aanroep van NEG naar UNCLASS, en deze verandering werd waargenomen ongeacht de macrodissected sample RNA-input en met vergelijkbare waarschijnlijkheidsscores (0,224, 0,254). Macrodissectie van steekproef C had daarentegen geen effect op de DHITsig-oproep, maar veranderde de COO-oproep van GCB in UNC. Nogmaals, deze verandering werd waargenomen ongeacht de macrodissected sample RNA-input. Bij 0,117 lag de COO-callkans echter dichter bij de calldrempel van 0,1 voor het macrodissected sample met verminderde RNA-input. Net als bij steekproef A had macrodissectie van monster E geen effect op de COO-aanroep, maar veranderde de DHITsig-aanroep. Voor monster E veranderde de oproep echter van UNCLASS in NEG en deed dit ongeacht de macrodissected sample RNA-ingang met redelijk vergelijkbare waarschijnlijkheidsaanroepen (0,849, 0,833). Met name deze oproepwijziging naar DHITsig NEG is biologisch zinvol, aangezien monster E werd gevonden voor ABC-DLBCL, en dubbele hittranslocaties met BCL2 zijn gemeld uitsluitend te worden waargenomen in GCB-DLBCL¹⁹.

Figuur 1: Het genereren van op dia's gemonteerde weefselsecties met behulp van een microtoom. (A) FFPE-weefselblok dat op zijn plaats wordt gehouden door de microtoomhouder en wordt gesneden om een lint van sequentiële FFPE-weefselsecties te produceren. (B) Met behulp van voorgeweekte houten stokken wordt het lint verzameld uit de microtoom en overgebracht naar een warmwaterbad. (C) De warmte van het water helpt om de plooien in het weefsellint glad te strijken. (D) Afzonderlijke FFPE-weefselsecties worden van het weefsellint verwijderd door een gesloten tang op de kruising van twee secties te plaatsen en de tang voorzichtig te openen, waardoor secties van elkaar worden gescheiden. (E) Secties worden uit het water verzameld door een glazen glijbaan onder een hoek onder te dompelen en de zijkant voorzichtig naar het weefselgedeelte te bewegen totdat de rand van de sectie de glazen schuif raakt. (F) Zodra de glijbaan en het gedeelte elkaar raken, verwijdert u de glijbaan langzaam uit het water, zodat het weefselgedeelte vlak tegen de glijbaan kan vallen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Pathologie en histologisch onderzoek van een hematoxyline en eosine (H&E) gekleurde secties. (A,B) De H&E-weefselsectie wordt onderworpen aan microscopische beoordeling door een door de raad gecertificeerde patholoog. (C,D) Zodra de patholoog het hele weefsel heeft bekeken en heeft vastgesteld dat het niet 100% tumorweefsel is, zal de patholoog een marker gebruiken om het tumorgebied van het weefsel te omringen. (E,F) Het vasthouden van de gemarkeerde H &E tegen het oorspronkelijke FFPE-weefselblok laat zien dat niet al het weefsel tumormateriaal is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Weefselmonsters. Deze afbeelding toont de pathologisch beoordeelde en tumor gemarkeerde H&E's (rij 1), onbewerkte op dia's gemonteerde FFPE-weefselsecties (rij 2), gedeparaffiniseerde op dia's gemonteerde FFPE-weefselsecties (rij 3), gedeparaffiniseerde op dia's gemonteerde FFPE-weefselsecties met pathologiemarkeringen getraceerd op de achterkant van de dia (rij 4), gedeparaffineerde en macrogedisseceerde dia-gemonteerde FFPE-weefselsecties (rij 5) voor de 5 monsters (A-E) die zijn gebruikt om dit protocol te demonstreren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Deparaffinisatie en macrodissectie van FFPE-weefselsecties: (A) In een zuurkast worden FFPE-weefsels die in een schuifrek zijn gemonteerd, gewassen in twee d-limoneenwassingen en één ethanolwassing. (B,C) Na het wassen is alle paraffine verwijderd en alleen het weefsel blijft achter op de dia, die nu wit en zeer zichtbaar is in vergelijking met zijn voorgewassen tegenhanger. (D) Het gedeparaffiniseerde op een dia gemonteerde weefselsectie wordt met de voorkant naar beneden geplaatst op de achterkant van de bijpassende gemarkeerde H &E. (E) De markeringen van het tumorgebied op de H &E worden vervolgens op de achterkant van de gedeparaffineerde dia getraceerd met behulp van een fijne of ultrafijne geknipte permanente marker (F) Het gemarkeerde gedeparaffiniseerde op dia's gemonteerde weefselgedeelte wordt vervolgens ondergedompeld in een glycerolwas om het weefselgedeelte te dempen voor verzameling. De dia wordt langzaam uit de glycerol verwijderd en de achterkant van de dia wordt afgeveegd met een tissue om overtollige glycerol te verwijderen voordat het glijdweefsel met de voorkant naar boven op de bank wordt gelegd. (G) Met behulp van de platte kant van een schoon scheermesje wordt het weefsel macro-ontleed en wordt het ongewenste weefsel buiten de patholoogmarkeringen weggegooid voordat het interessante weefsel wordt verzameld, dat zich langs de rand van het mes verzamelt. (H) Een houten stok wordt gebruikt om het verzamelde weefsel van de rand van het mes te verwijderen. (I) Het weefsel wordt vervolgens overgebracht naar een vooraf gelabelde microbuis voorgevulde weefselverteringsbuffer en is klaar voor nucleïnezuurextractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voorbeeld-ID	Hele weefsels (a)		Omcirkeld deel van het weefsel (b)		Totale tumorinhoud van het hele weefsel (c)	Vouwtoename van het tumorgehalte door macrodissectie (d)	Niet macrogedisseceerd (e)		Macrodissected (v)
	% Levensvatbare tumor	% andere	% Levensvatbare tumor	% andere			Aantal 5 μm dia's geëxtraheerd	RNA conc (ng/μL)	Aantal 5 μm dia's geëxtraheerd	RNA conc (ng/μL)
Voorbeeld A	60	40	75	25	45	1.7	2	19.0	4	58.3
Voorbeeld B	60	40	65	35	39	1.7	1	34.0	2	60.0
Voorbeeld C	40	60	65	35	26	2.5	1	13.7	2	46.2
Voorbeeld D	35	65	90	10	32	2.9	1	57.3	2	60.0
Voorbeeld E	20	80	30	70	6	5.0	3	25.2	3	44.6

Tabel 1: Pathologie review data. De tabel toont (a) het percentage levensvatbare tumor in het hele weefselgedeelte per gebied, (b) het percentage levensvatbare tumor in het gebied dat door de patholoog tijdens de beoordeling door cellulariteit is omcirkeld / gemarkeerd, (c) de geschatte totale tumorcellulaliteit van het hele weefsel (a x b), (d) de geschatte vouwtoename van tumorcellulaliteit bereikt met macrodissectie, e en f) het aantal niet-gekleurde FFPE-op dia's gemonteerde weefselsecties van 5 μm geëxtraheerd en de resulterende RNA-concentraties voor gematchte niet-macrodissected en macrodissected monsters. % Andere verwijst naar alle andere weefsels die aanwezig zijn in een bepaald monster dat geen tumorweefsel is en bindweefsel, stromale fibroblasten, bloedvaten en andere inherente stromale elementen kan omvatten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Voorbeeld-ID		RNA-ingang (ng)	DLBCL90 COO-oproep	DLBCL90 oproepkans	DHITsig bellen	DHITsig pos waarschijnlijkheid	DHITsig neg waarschijnlijkheid
Niet macrodissected	Voorbeeld A	95.0	Gcb	0.000	Neg	0.135	0.865
	Voorbeeld B	170.0	Gcb	0.000	Neg	0.032	0.968
	Voorbeeld C	68.5	Gcb	0.028	Neg	0.033	0.967
	Voorbeeld D	286.5	ABC	0.998	Neg	0.002	0.998
	Voorbeeld E	126.0	ABC	0.989	UNCLASS	0.212	0.788
Macroontsected	Voorbeeld A_M	291.7	Gcb	0.000	UNCLASS	0.224	0.776
	Voorbeeld B_M	300.0	Gcb	0.000	Neg	0.016	0.984
	Voorbeeld C_M	231.2	UNCLASS	0.210	Neg	0.015	0.985
	Voorbeeld D_M	300.0	ABC	0.999	Neg	0.002	0.998
	Voorbeeld E_M	223.2	ABC	0.987	Neg	0.151	0.849
Macrodissected & RNA verdund	Voorbeeld A_M	95.0	Gcb	0.000	UNCLASS	0.254	0.746
	Voorbeeld B_M	170.0	Gcb	0.000	Neg	0.023	0.977
	Voorbeeld C_M	68.5	UNCLASS	0.117	Neg	0.027	0.973
	Voorbeeld D_M	286.5	ABC	0.999	Neg	0.002	0.998
	Voorbeeld E_M	126.0	ABC	0.995	Neg	0.167	0.833

Tabel 2: DLBCL90 digitale genexpressie testresultaten. Vijf monsters (A-E) werden niet macro-gedisseceerd of macro-ontleed voordat nucleïnezuurextracties werden uitgevoerd. Het resulterende RNA werd uitgevoerd op de DLBCL90-test, waarvoor het maximale RNA-ingangsvolume 5 μL is. Niet-macrodissected monsters werden uitgevoerd met 5 μL stock-RNA. Elk macrodissected monster werd tweemaal uitgevoerd met (a) 5 μL stock-RNA, tenzij aliquots van 60 ng/μL mogelijk waren en (b) 5 μL stock-RNA verdund om overeen te komen met de concentraties/input van hun niet-macrodissected tegenhangers. Het achtervoegsel _M geeft aan dat dat voorbeeld macrodisseceerd is. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

FFPE-weefsels zijn vaak heterogene mengsels van tumor- en niet-tumorweefsels. Hoogsensitieve genomische tests komen steeds vaker voor in zowel klinische als onderzoeksomgevingen, maar kunnen worden verward door de aanwezigheid van besmettend niet-tumorweefsel. Inderdaad, een minimaal tumorgehalte van 60% wordt vaak aanbevolen voor genomische studies. Percentage tumor kan worden bepaald door het gebied van weefsel bezet door het tumormateriaal of door het aandeel van tumorcellen in het weefsel. Hoewel tumor per gebied een veelgebruikte metriek is voor tumorzuiverheid, geeft het niet altijd een nauwkeurige beschrijving van het weefsel weer. Overweeg twee weefsels, beide met 1000 cellen, waarvan 500 tumorcellen. In weefsel A zijn de 500 niet-tumorcellen stromale cellen met vergelijkbare volumes als die van de tumorcel. In dit weefsel kan het percentage tumor als 50% worden beschouwd door zowel de cellulariteit als het gebied. In weefsel B zijn de 500 niet-tumorcellen vetcellen met volumes die 4x die van de tumorcel zijn. In dit weefsel is het percentage tumor nog steeds 50% door cellulariteit, maar 20% door oppervlakte. Een derde weefsel, weefsel C, bestaat uit 500 tumorcellen plus 400 vetcellen en 800 stromale cellen met volumes die respectievelijk 4x en 0,5x die van de tumorcellen zijn. Gegeven 100 vetcellen is gelijk aan het volume van 800 stromale cellen, het percentage tumor van weefsel C is 29% door cellulariteit (500/1700) maar nog steeds 20% per gebied. Weefsel D bestaat ook uit de tumor-, vet- en stromale cellen met volumeverhoudingen van 1x, 4x en 0,1x. Het aantal cellen is echter respectievelijk 400, 10 en 720. Het percentage tumor van weefsel D is dus 35% door cellulariteit (400/1130), maar 78% door oppervlakte. Deze voorbeelden zijn te simplistisch en weerspiegelen geen weefselsamenstellingen uit de echte wereld, maar geven duidelijk het belang van weefselsamenstelling en het verschil tussen tumorinhoud per gebied en per cellulariteit weer. Belangrijk is dat als het gaat om het verrijken van tumorinhoud voor downstream nucleïnezuurextractie, tumorcellulaliteit het belangrijkste kenmerk is vanwege het verhoogde verstorende potentieel van het extraheren van genomisch materiaal uit meer niet-tumorcellen dan tumorcellen. Dit onderstreept niet alleen de noodzaak om het tumorgehalte van weefsels te beoordelen in termen van procentuele cellulariteit, maar ook de noodzaak om ongewenst weefsel te verwijderen om mogelijke negatieve effecten van het niet-tumorweefsel te minimaliseren. Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor weefselverrijking, met als belangrijkste macrodissectie en microdissectie.

Macrodissectie, de methode die in dit protocol wordt beschreven, is relatief snel, eenvoudig en vereist geen dure of gespecialiseerde apparatuur. Hoewel macrodissectie het tumorgehalte sterk kan verbeteren, is het belangrijk om te begrijpen dat het niet-tumormateriaal niet volledig elimineert. Het doel van macrodissectie is om het weefsel van belang voldoende te verrijken door de uitsluiting van ongewenst weefsel om de "ruis" afkomstig van ongewenst weefsel te verminderen, wat op zijn beurt het signaal van interesse van het weefsel van belang kan verbeteren. Macrodissectie gemedieerde tumorverrijking is dus een manier om de signaal-ruisverhouding te verbeteren om markers van belang beter te detecteren, met name tumorspecifieke moleculaire markers met een lage abundantie of slechte expressie. Macrodissectie heeft echter beperkingen vanwege het gebrek aan precisie dat wordt geboden door grove hulpmiddelen zoals scheermesjes en is gevoelig voor precisieproblemen die voortvloeien uit de lijndikte van de marker van de patholoog, evenals mogelijke fouten bij het traceren van de H &E-afbakeningen van de pathologen. Zoals hierboven vermeld, is het niet mogelijk om 100% tumorzuiverheid te bereiken vanwege de aanwezigheid van inherente en tumor-inducerende stromale elementen (d.w.z. bindweefsel, stromale fibroblasten, bloedvaten, goedaardige reactieve lymfocyten, macrofagen) ingebed in de tumor zelf. Inderdaad, veel invasieve of diffuus infiltratieve maligniteiten induceren een robuuste desmoplastische stromale respons, wat resulteert in clusters van tumorcellen die intiem worden vermengd met stromale fibroblasten en andere niet-neoplastische celtypen; waar tumoren geassocieerd met dit stromale reactiepatroon, zoals^{pancreaskankerweefsels 21}, meer baat kunnen hebben bij digitaal geleide microdissectie in plaats van handmatige macrodissectie.

Handmatige microdissectie wordt uitgevoerd onder een microscoop om identificatie, dissectie en isolatie van weefselspecifieke cellen of populaties te helpen met behulp van een naald of scalpel en heeft het voordeel van verhoogde precisie ten opzichte van macrodissectie²². Handmatige microdissectie is echter een moeizaam proces dat de finesse mist die nodig is voor complexe weefsels met een laag tumorgehalte of ingewikkelde kenmerken die niet compatibel zijn met handmatige dissectie. Dergelijke weefsels kunnen worden ontleed met behulp van zeer nauwkeurige geautomatiseerde methoden zoals laser capture microdissectie. Het is inderdaad aangetoond dat digitaal geleide microdissectie een hoger percentage tumorinhoud oplevert in vergelijking met handmatige macrodissectie in pancreaskankerweefsels²³. De nadelen van deze geautomatiseerde methoden met hoge precisie, zoals de behoefte aan gespecialiseerde, dure apparatuur en hoogopgeleide personen, hebben de integratie ervan in workflows echter belemmerd. Een studie van de Bruin et al. waarin de effecten van macrodissectie en laser capture microdissection (LCM) op genexpressieprofilering werden vergeleken, wees uit dat LCM-monsters lage totale RNA-opbrengsten hadden (30 ng gemiddeld) en twee rondes van mRNA-amplificatie nodig hadden om de cDNA-bibliotheekvoorbereidingsdrempel²⁴ te bereiken. De auteurs ontdekten dat de resulterende LCM-genexpressieprofielen meer werden beïnvloed door de rondes van mRNA-amplificatie dan macrodissected profielen werden beïnvloed door niet-tumorstromale bijdragen en concludeerden dat macrodissectie adequaat kon worden gebruikt om betrouwbare genexpressiegegevens te genereren²⁴.

Een belangrijk voordeel van NanoString digitale genexpressieprofilering, met name bij het werken met sterk afgebroken FFPE-afgeleid RNA, is dat het geen enzymatische afhankelijke processen vereist, zoals RNA-amplificatie of voorbereiding van cDNA-bibliotheken. Assays zijn echter meestal geoptimaliseerd voor inputs tussen 50-300 ng van totaal RNA^25,26, die, op basis van de bevindingen van de Bruin et ^al.24, mogelijk niet compatibel zijn met microdissected weefsels zonder de weefselinvoer te verhogen; een ongunstige vraag in een tijdperk waarin weefselmonsters steeds vaker worden verzameld als kleine biopsieën in plaats van chirurgische resecties. De RNA-inputs die werden gebruikt voor de DLBCL90-test varieerden van 68,5-300 ng voor zowel de macro-ontleedde als niet-ontlede weefsels. De resultaten tonen aan dat macrodissectie resulteerde in callveranderingen in 60% van de onderzochte monsters en dat deze veranderingen werden waargenomen ongeacht de RNA-input van de macrodissected monsters. De COO-waarschijnlijkheid voor de lage RNA-input heeft echter de COO GCB / UNC-waarschijnlijkheidsoproepdrempel overschreden, waarbij de drempels 0 tot <0,1 zijn voor GCB, 0,1-0,9 voor UNC en >0,9 tot 1,0 voor ABC-oproepen²⁰. De belangrijkste DLBCL COO-subtypen zijn GCB en ABC, die 41% en 44% van alle DLBCL-gevallen uitmaken, waarbij UNC een tussengroep van de twee vertegenwoordigt en ABC de meest agressieve^20,27. Dus, terwijl de COO-oproepverandering bij macrodissectie van monster C geen duidelijke verandering in COO-subtype van GCB naar ABC veroorzaakte, kan de verandering van GCB naar UNC een verschuiving naar een agressievere ziekte suggereren. Bovendien geven recente studies aan dat het UNC-subtype niet alleen een tussenliggend subtype is en dat het mogelijk subtypespecifieke therapeutisch exploiteerbare eigenschappen kan bezitten²⁸. Evenzo veroorzaakte macrodissectie van monsters A en E geen duidelijke veranderingen in DHITsig-oproepen van DH-negatief naar DH-positief, of omgekeerd. De bewegingen van een GCB-monster (monster A) van NEG naar UNCLASS en een ABC-monster (monster E) van UNCLASS naar NEG bij macrodissectie zijn echter biologisch geschikt, aangezien double hit-translocaties met BCL2 naar verluidt een uitsluitend GCB-fenomeen zijn¹⁹. Hoewel translocaties traditioneel en alomtegenwoordig worden gedetecteerd door FISH in klinische omgevingen, is er een groeiend momentum om een alternatieve, minder betrokken en tijdrovende methode voor hun detectie te identificeren. De DLBCL90-test is een belangrijk hulpmiddel dat aan deze behoefte voldoet, waarbij de reden voor het gebruik ervan wordt versterkt door de bevinding dat deze test in staat is om translocaties te detecteren die cryptisch zijn voor FISH-sondes die worden gebruikt in klinische diagnostiek²⁹.

Het hierboven beschreven macrodissectieprotocol schetst een eenvoudige methode waarmee onderzoekers het tumorgehalte van weefselmonsters kunnen verhogen die normaal gesproken onder de gebruikelijke drempelwaarden voor studie-inclusiecriteria zouden vallen. Het opnemen van macrodissectie in een studieworkflow stelt onderzoekers in staat om slecht tumordichte weefsels te redden van studie-uitsluiting door hun tumorgehalte te verhogen. Dit zorgt op zijn beurt voor meer vertrouwen dat het resulterende RNA en DNA-eluaten de tumor vertegenwoordigen die genomisch wordt onderzocht. Hoewel er andere, meer precieze methoden voor weefseldissectie bestaan, is macrodissectie voor tumoren die op een meer expansieve, niet-infiltratieve, bladachtige of solide manier groeien, waarschijnlijk voldoende. De hier gepresenteerde resultaten benadrukken het belang van tumorzuiverheid in genomische assays en macrodissectie als een betrouwbaar hulpmiddel om dit te bereiken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
200-proof ethanol	Decon	2701
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit	Qiagen	80234	DNA/RNA FFPE extractiekit
Coplin potten	Verschillende	x
DLBCL90 sondes	NanoString	diversen	Digitaal genexpressieprofiel op basis van de DLBCL90-test
d-Limonene	VWR	89376-092
Pincetten	Verschillende	x
Glasmijcroscoopglaasjes	FisherBrand	12-550-15
Glycerol	VWR	0854-1L
Master kits	NanoString	diversen
Microtoom	Leica	RM2265
Microtubes	Ambion	AM12400
NanoDrop One	Thermo Scientific	ND-ONE-W	Spectrofotometer voor DNA-, RNA- en eiwitkwantificering
nCounter	NanoString	x	Digitaal genexpressieprofielplatform dat wordt gebruikt om de DLBCL90-test uit te voeren
Permanente stift	Electrib Microscope Sciences	72109-12
Dispenser voor scheermesjes	Electrib Microscope Sciences	71985-10
Scheermesjes	Electrib Microscope Sciences	71985-23
Weefselverteringsbuffer	Qiagen	80234
Ultrazuiver water	VWR	SH30538.02
Waterbad	Triangle Biomedical Sciences	TFB-120
Houtstokje	FisherBrand	22363158