Plaquing is een routinemethode die wordt gebruikt om levende virussen in een populatie te kwantificeren. Hoewel plaquing vaak wordt onderwezen in verschillende microbiologische curricula met bacteriën en bacteriofagen, is het plaquenten van zoogdiervirussen complexer en tijdrovender. Dit protocol beschrijft de procedures die betrouwbaar functioneren voor regelmatig werk met herpes simplex-virussen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Plaquing van Herpes Simplex Virussen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Er zijn tal van gepubliceerde protocollen voor het plaquen van virussen, inclusief verwijzingen in de primaire literatuur voor methodologie. Het paaien van virussen kan echter moeilijk uit te voeren zijn, waardoor de nadruk moet worden gelegd op de specificaties en verfijning ervan. Het is een ongelooflijk uitdagende methode voor nieuwe studenten om onder de knie te krijgen, vooral omdat het nauwgezette aandacht vereist voor de meest minuscule details. Deze demonstratie van het plaquen van herpes simplex-virussen zou degenen moeten helpen die in de loop der jaren hebben geworsteld met het visualiseren van de methode, vooral de nuances ervan. Hoewel dit manuscript is gebaseerd op dezelfde principes van de standaard plaquing-methodologie, verschilt het in die zin dat het een gedetailleerde beschrijving bevat van (1) hoe gastheercellen het beste kunnen worden behandeld om verstoring tijdens het proces te voorkomen, (2) een nuttiger viskeus medium dan agarose om de diffusie van virionen te beperken, en (3) een eenvoudige fixatie- en kleuringsprocedure die betrouwbaar reproduceerbare resultaten oplevert. Bovendien helpt de bijbehorende video de fijnere onderscheidingen in het proces te demonstreren, die vaak worden gemist bij het instrueren van anderen over het uitvoeren van plaque-assays.
Inleiding
Het begin van virus plaque assays gaan terug tot de eerste ontdekkingen van virussen in de jaren 18901. Tabaksmozaïekvirus werd voor het eerst geïsoleerd en doorgegeven op tabaksbladeren, waar individuele infectieplekken konden worden herkend en gekwantificeerd als afkomstig van een enkele, levende virusentiteit2, later geïdentificeerd als een virion2. Latere baanbrekende studies met bacteriën en bacteriofagen perfectioneerden de technieken die werden gebruikt om deze virussen te plaqueren, waaronder bacteriën in de mid-log fase van groei, seriële verdunning van bacteriofaagmonsters en top agar me....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures met de Vero-cellen en levende herpesvirussen zijn goedgekeurd door het Towson University Institutional Biosafety Committee. Een algemeen schema van deze procedures is weergegeven in figuur 1.
1. Zaaien van de Vero-cellen
- De dag voordat de plaquetest wordt gestart, trypsiniseren Vero-cellen en resuspenderen ze in reguliere Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) en supplement volgens de standaard celkweekmethodologie19. Resuspend de trypsinized cellen in 10 ml DMEM per T-75 kolf van de confluent Vero-cellen (~ 107 cellen).
OPMERKIN....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Tabel 1 toont een experiment dat optimale resultaten heeft. Alle 10-voudige verdunningen volgen op een ongeveer 10-voudige afname van het aantal plaques. Dit soort gegevens zijn ook te zien in figuur 2, een werkelijke plaquetest waarbij het telbare aantal plaques in het bereik van 10-4 viel voor alle drie de replicaties. Hetzelfde is te zien in figuur 3, de bovenste rij, waar het telbare aantal plaques zich in de 10-3 verdunning<.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel plaque-assays bijna net zo oud zijn als zoogdiercelkweek zelf, lijkt het erop dat elk laboratorium zijn eigen set protocollen heeft om deze basistest uit te voeren5,6,10,11,12,13,14,15,16,20
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.
Dankbetuigingen
We bedanken talloze studenten in onze laboratoria (PJD en BJM) die in de loop der jaren met ons hebben samengewerkt om deze methoden te verfijnen. Een speciale dank aan Stan Person, onder wiens voogdij deze methodologie voor het eerst werd ontwikkeld. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support fund en NIGMS Bridges to the Baccalaureate grant 5R25GM058264. Deze inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 12-wells platen | Corning | 3512 | |
| 6-wells platen | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibioticum/antimyoticum | Gibco | 15240096 | |
| Kristal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (geen Mg++ of Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Foetaal runder serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Kwartair middel (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypaanblauw | Corning | 25900CI | |
| Trypsine | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cellen | ATCC | CCL-81 |
Referenties
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. Introduction to Moden Virology. 6th end. , Wiley-Blackwell. (2007).
- Mahy, B., Collier, L. Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, Arnold. (1998).
- Anderson, B., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
