Dit protocol presenteert twee technieken om de subcellulaire compartimenten van muizenstaaffotoreceptoren te isoleren voor eiwitanalyse. De eerste methode maakt gebruik van levend retinae en cellulosefilterpapier om de buitenste segmenten van de staaf te scheiden, terwijl de tweede gebruik maakt van gelyofiliseerd netvlies en plakband om de binnenste en buitenste segmentlagen van de staaf weg te pellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Twee peelingmethoden voor de isolatie van fotoreceptorcelcompartimenten in het netvlies van de muis voor eiwitanalyse
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Staaffotoreceptoren zijn sterk gepolariseerde sensorische neuronen met verschillende compartimenten. Muizenstaafjes zijn lang (~ 80 μm) en dun (~ 2 μm) en zijn zijdelings verpakt in de buitenste laag van het netvlies, de fotoreceptorlaag, wat resulteert in uitlijning van analoge subcellulaire compartimenten. Traditioneel is tangentiële sectie van het bevroren plat gemonteerde netvlies gebruikt om de beweging en lokalisatie van eiwitten binnen verschillende staafcompartimenten te bestuderen. De hoge kromming van het staaf-dominante muizennet maakt tangentiële sectie echter een uitdaging. Gemotiveerd door de studie van eiwittransport tussen compartimenten, ontwikkelden we twee peelingmethoden die het staafbuitensegment (ROS) en andere subcellulaire compartimenten voor western blots betrouwbaar isoleren. Onze relatief snelle en eenvoudige technieken leveren verrijkte en subcellulair-specifieke fracties om de verdeling en herverdeling van belangrijke fotoreceptoreiwitten in normale staafjes kwantitatief te meten. Bovendien kunnen deze isolatietechnieken ook gemakkelijk worden aangepast om de eiwitsamenstelling van andere cellulaire lagen in zowel gezond als degenererend netvlies te isoleren en kwantitatief te onderzoeken.
Inleiding
Staaffotoreceptorcellen, strak verpakt in de buitenste laag van het neurale netvlies, zijn een integraal onderdeel van het zicht op zwak licht. Om te functioneren als getrouwe fotonentellers, gebruiken staafjes een op G-eiwit gebaseerde signaalroute, fototransductie genaamd, om snelle, versterkte en reproduceerbare reacties op het vastleggen van enkele fotonen te genereren. Deze reactie op licht veroorzaakt uiteindelijk een verandering in de stroom bij het plasmamembraan en wordt vervolgens gesignaleerd aan de rest van het visuele systeem1. Zoals hun naam al aangeeft, heeft elke staafcel een verschillende staafachtige vorm en vertoont een sterk....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de lokale institutionele richtlijnen van de commissie voor dierverzorging van de University of Southern California (USC).
1. Live cell retinal peeling methode
- Bereiding van Ames' buffers, schilpapier en dissectieschotel
- Knip met een irisschaar met stompe punt (of een gelijkwaardig schaartype) het cellulosefilterpapier (grade 413) in rechthoeken van ongeveer 5 mm x 2,5 mm. Bewaar de stekken voor toekomstig gebruik.
- Bereid 1 l HEPES-buffer van Ames door één fles Ames' Medium, 2,38 g HEPES en 0,877 g NaCl te combineren. Los de reagentia op in een steriele....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De huidige strategieën zijn ontwikkeld om relatief snelle en eenvoudige methoden te bieden om eiwitten te isoleren en te analyseren tussen specifieke staafsubcellulaire compartimenten voor western blot-analyse. We pasten twee sequentiële peelingtechnieken toe (figuur 1 en figuur 2), gevolgd door immunoblotting om aan te tonen dat deze methoden betrouwbaar kunnen worden gebruikt om de bekende verdeling van staaftransducine (GNAT1) en arrestine (ARR1) bij zowel do.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Veel retinale ziekten beïnvloeden staaffotoreceptorcellen, wat leidt tot staafdood en uiteindelijk volledig verlies van het gezichtsvermogen37. Een aanzienlijk deel van de genetische en mechanistische oorsprong van menselijke retinale degeneratie is in de loop der jaren met succes samengevat in tal van muismodellen. In die context zou het vermogen om gemakkelijk en selectief individuele staafsubcellulaire compartimenten van het kleine muizennet te scheiden ons begrip van de gelokaliseerde biochemi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NIH Grant EY12155, EY027193 en EY027387 aan JC. We zijn Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, USA) en Natalie Chen (USC, Los Angeles, USA) dankbaar voor het proeflezen van het manuscript. We willen ook Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, VS) en Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, VS) bedanken voor het leveren van de benodigde apparatuur om de door de auteur verstrekte beelden te verzamelen. Materiaal van: Kasey Rose et al, Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis, Molecular Neurodegeneration, published [2017], [Springer Nature].
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 100 mL laboratorium- of mediafles voorzien van een adapter voor slangaansluiting | N/A | N/A | |
| 100% O2 tank | N/A | N/A | |
| 1000mL fles topfilter, PES filtermateriaal, 0.22 μm | Genesee Scientific | 25-235 | |
| 4X SDS sample buffer | Millipore Sigma | 70607-3 | |
| 50 mL Falcon buis | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 95% O2 en 5% CO2 tank | N/A | N/A | |
| Ames’ Medium met L-glutamine, zonder bicarbonaat | Sigma-Aldrich | A1420 | |
| CaCl2 (99%, dihydraat) | Sigma | C-3881 | |
| Drierite (Watervrij calciumsulfaat, >98% CaSO4, >2% CoCl2) | WA Hammond Drierite Co LTD | 21005 | |
| Falcon Easy-Grip Petri-schaal (polystyreen, 35 x 10 mm) | Falcon-Corning | 08-757-100A | |
| Falcon Easy-Grip weefselkweekschaal (60 x 15 mm) | Falcon-Corning | 08-772F | |
| Feather scalpel (Nr. 10, 40 mm) | VWR | 100499-578 | |
| Feather scalpel (Nr. 11, 40 mm) | VWT | 100499-580 | |
| KCl (99%) | Sigma | P-4504 | |
| Kimble Kontes pellet stamper | Sigma | z359971 | |
| Labconco Fast-Freeze flessen | Labconco | N/A | |
| LN2 (vloeibare stikstof) + Dewar-fles of vergelijkbare vacuümfles | N/A | N/A | |
| MgCl2 | Sigma | M-9272 | |
| Milli-Q/de-ioniseerde water | EMD Millipore | N/A | |
| Na2HPO4 (poeder) | J.T. Baker | 4062-01 | |
| NaCl (kristal) | EMD Millipore | Sx0420-3 | |
| NaHCO3 | Amresco | 0865 | |
| OmniPur EDTA | EMD | 4005 | |
| OmniPur HEPES, vrij zuur | EMD | 5320 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Reynolds Wrap aluminiumfolie | Reynolds Brands | N/A | |
| Scotch Magic Tape (12,7 mm x 32,9 m) | Scotch-3M | N/A | |
| Natrium deoxycholaat | Sigma-Aldrich | D67501 | |
| Spectrafuge mini centrifuge | Labnet International, Inc | C1301 | |
| Weefsel incubatiekamer (gekocht of op maat gemaakt) | N/A | N/A | |
| Tris-HCl | J.T.Baker | 4103-02 | |
| Triton X-100 | Signma-Aldrich | T8787 | |
| VirTis Benchtop 2K lyofilisator of gelijkwaardige machine | SP Scientific | N/A | |
| VWR Grade 413 Filterpapier (diameter 5,5 cm, poriegrootte 5 μm) | VWR | 28310-015 | |
| Whatman Grade 1 Kwalitatief Filterpapier (diameter 9 cm, poriegrootte 11 μm) | Whatman/GE Healthcare | 1001-090 | |
| Breed buis transferpijpje, Global Scientific | VWR | 76285-362 |
Referenties
- Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Koch, K. W., Dell'Orco, D.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
