Methodenartikel

Flowcytometrische analyse voor identificatie van de aangeboren en adaptieve immuuncellen van muizenlong

DOI:

10.3791/62985

⸱

16 november 2021

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology-Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 3Harvard College

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie presenteren we een effectief en reproduceerbaar protocol om de immuunpopulaties van het muriene ademhalingssysteem te isoleren. We bieden ook een methode voor de identificatie van alle aangeboren en adaptieve immuuncellen die zich in de longen van gezonde muizen bevinden, met behulp van een op 9 kleuren gebaseerd flowcytometriepaneel.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De luchtwegen staan in direct contact met de externe omgeving en vereisen een nauwkeurig gereguleerd immuunsysteem om bescherming te bieden en tegelijkertijd ongewenste reacties op omgevingsantigenen te onderdrukken. Longen herbergen verschillende populaties van aangeboren en adaptieve immuuncellen die immuunsurveillance bieden, maar ook beschermende immuunresponsen bemiddelen. Deze cellen, die het gezonde pulmonale immuunsysteem in balans houden, nemen ook deel aan verschillende pathologische aandoeningen zoals astma, infecties, auto-immuunziekten en kanker. Selectieve expressie van oppervlakte- en intracellulaire eiwitten biedt unieke immunofenotypische eigenschappen aan de immuuncellen van de long. Bijgevolg speelt flowcytometrie een instrumentele rol bij de identificatie van dergelijke celpopulaties tijdens steady-state en pathologische omstandigheden. Dit artikel presenteert een protocol dat een consistente en reproduceerbare methode beschrijft om de immuuncellen te identificeren die zich in de longen van gezonde muizen bevinden onder steady-state omstandigheden. Dit protocol kan echter ook worden gebruikt om veranderingen in deze celpopulaties in verschillende ziektemodellen te identificeren om ziektespecifieke veranderingen in het longimmuunlandschap te helpen identificeren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De muizenweg bevat een uniek immuunsysteem dat verantwoordelijk is voor het bestrijden van ziekteverwekkers en het handhaven van immuunhomeostase. Het pulmonale immuunsysteem bestaat uit cellulaire populaties met een significante heterogeniteit in hun fenotype, functie, oorsprong en locatie. Residente alveolaire macrofagen (AM's), voornamelijk afkomstig van foetale monocyten, bevinden zich in het alveolaire lumen1, terwijl van beenmerg afgeleide interstitiële macrofagen (IM's) zich in het longparenchym bevinden2. IM's kunnen verder worden gesubclassificeerd door de expressie van CD206. CD206+ IM's bevolken het peribronchiale en perivasculaire gebied, terwijl CD206-IM's zich bevinden op het alveolaire interstitium3. Onlangs zijn enkele subclassificaties van im's voorgesteld3,4,5,6. Hoewel IM's minder worden bestudeerd dan AM's, ondersteunt recent bewijs hun cruciale rol in de regulatie van het immuunsysteem van de long7. Daarnaast wordt CD206 ook uitgedrukt in alternatief geactiveerde AMs8.

Pulmonale dendritische cellen (DC's) zijn een andere heterogene groep longimmuuncellen met betrekking tot hun functionele eigenschappen, locatie en oorsprong. Vier subcategorieën van DC's zijn beschreven in de longen: conventionele CD103 + DC's (ook bekend als cDC1), conventionele CD11b + DC's (ook bekend als cDC2), monocyt-afgeleide DC's (MoDC's) en plasmacytoïde DC's9,10,11,12,13. De eerste drie subklassen kunnen worden gedefinieerd als major histocompatibility complex (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Plasmacytoïde DC's drukken MHC II uit en zijn gemiddeld positief voor CD11c, maar drukken hoge niveaus van B220 en PDCA-19,13,16 uit. In naïeve muizenlongen bevinden CD103 DC's en CD11b DC's zich in het luchtweginterstitium, terwijl plasmacytoïde DC's zich in het alveolaire interstitium17 bevinden.

Twee belangrijke populaties van monocyten verblijven in de longen tijdens steady state: klassieke monocyten en niet-klassieke monocyten. Klassieke monocyten zijn Ly6C+ en zijn van cruciaal belang voor de initiële ontstekingsreactie. Daarentegen zijn niet-klassieke monocyten Ly6C- en worden ze algemeen beschouwd als ontstekingsremmende cellen3,16,18. Onlangs werd een extra populatie cd64+cd16,2+ monocyten beschreven, die afkomstig zijn van Ly6C-monocyten en aanleiding geven tot CD206+ IM's3.

Eosinofielen verschijnen voornamelijk in de longen tijdens worminfectie of allergische aandoeningen. Er is echter een klein aantal eosinofielen in het pulmonale parenchym tijdens steady state, bekend als resident eosinofielen. In tegenstelling tot de resident eosinofielen worden inflammatoire eosinofielen gevonden in het longinterstitium en bronchoalveolaire lavage (BAL). In muismodellen van huisstofmijt (HDM) worden inflammatoire eosinofielen in de longen gerekruteerd na antigeen-gemedieerde stimulatie. Er is voorgesteld dat resident eosinofielen een regulerende rol kunnen spelen bij allergie door T-helper 2 (Th2) sensibilisatie voor HDM19 te remmen.

In tegenstelling tot de rest van de myeloïde longcellen, drukken neutrofielen Ly6G uit, maar niet CD68 en worden gekenmerkt door een signatuur van het CD68-Ly6G+ immunofenotype16,20,21. Visualisatiestudies hebben aangetoond dat tijdens steady state de longen een pool van neutrofielen in het intravasculaire compartiment reserves en een aanzienlijk aantal extravasculaire neutrofielen host22. Net als eosinofielen worden neutrofielen niet gevonden in BAL bij steady state; verschillende vormen van immuunstimulatie, zoals LPS-uitdaging, astma of longontsteking, drijven neutrofielen echter in het alveolaire lumen, wat resulteert in hun aanwezigheid in BAL21,22,23.

Een aanzienlijk aantal CD45+ cellen van de long vertegenwoordigen natural killer (NK), T-cellen en B-cellen en zijn negatief voor de meeste myeloïde markers24. In de longen van naïeve muizen kunnen deze drie celtypen worden geïdentificeerd op basis van de expressie van CD11b en MHC II18. Ongeveer 25% van de pulmonale CD45+ cellen zijn B-cellen, terwijl het percentage NK-cellen hoger is in de longen dan andere lymfoïde en niet-lymfoïde weefsels24,25,26. Onder pulmonale T-cellen is een aanzienlijk deel CD4-CD8- en speelt een belangrijke rol bij luchtweginfecties26.

Omdat de long een zeer complex en uniek immuunsysteem herbergt, zijn verschillende gatingstrategieën voor de identificatie van longimmuuncellen ontwikkeld en gerapporteerd16,18,20,27. De hierin beschreven gating-strategie biedt een uitgebreide en reproduceerbare manier om tot 12 verschillende pulmonale myeloïde en niet-myeloïde immuunpopulaties te identificeren met behulp van 9 markers. Extra markers zijn gebruikt om de resultaten te valideren. Bovendien wordt een gedetailleerde methode geboden voor de bereiding van een eencellige suspensie die celdood minimaliseert en de identificatie van het meest complete profiel van het immuuncelcompartiment van de long mogelijk maakt. Opgemerkt moet worden dat de identificatie van niet-immuuncellen van de long, zoals epitheelcellen (CD45-CD326 + CD31-), endotheelcellen (CD45-CD326-CD31 +), en fibroblasten een andere aanpak vereist28,29. Identificatie van dergelijke populaties is niet opgenomen in het protocol en de methode die hier worden beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle studies en experimenten beschreven in dit protocol werden uitgevoerd volgens richtlijnen volgens de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Beth Israel Deaconess Medical Center. Zes tot tien weken oude C57BL/6 muizen van beide geslachten werden gebruikt om dit protocol te ontwikkelen.

1. Chirurgische excisie en weefselvoorbereiding

  1. Euthanaseer de muis door intraperitoneaal 1 ml tribroomethanol te injecteren (bereid volgens het standaardprotocol; Tabel met materialen).
    OPMERKING: CO2-verstikking moet worden vermeden in longstudies omdat dit longletsel kan veroorzaken en de kenmerken en eigenschappen van longimmuuncellen kan veranderen. Cervicale dislocatie moet ook worden vermeden, omdat dit mechanisch letsel van de longen kan veroorzaken.
  2. Breng de muis over naar een schoon en speciaal gebied voor chirurgische ingrepen.
  3. Stabiliseer de dorsale zijde naar beneden met behulp van naalden of tape op de vier ledematen. Gebruik 70% ethanol om de huid van het ventrale gebied te ontsmetten.
  4. Voer een incisie uit in de huid, van de nek tot de buik. Verwijder de huid voorzichtig uit het thoracale gebied.
  5. Verwijder voorzichtig het borstbeen en de ribben.
  6. Spoel de longen door 10 ml koude PBS rechtstreeks in de rechter ventrikel te injecteren, met behulp van een naald van 18-21 G, totdat de longen volledig wit worden.
  7. Verwijder voorzichtig de thymus en het hart zonder de longen aan te raken.
  8. Maak de longen voorzichtig los van de omliggende weefsels en breng ze over naar een buis met koude BSA-buffer (tabel 1).
    OPMERKING: Er moet moeite worden gedaan om al het aangrenzende vet uit de longen te verwijderen voordat de eencellige suspensie verder wordt voorbereid, omdat dit de uitlezingen zou kunnen vertekenen.

2. Bereiding van eencellige suspensie

  1. Breng de longen over in een lege petrischaal en hak ze fijn met twee fijne scalpels. Breng alle stukjes van de gehakte long over in een nieuwe conische buis van 50 ml. Gebruik 5 ml verteringsbuffer om de plaat te wassen en voeg deze toe aan de buis van 50 ml met de gehakte long (tabel 1).
    OPMERKING: De digestiebuffer moet onmiddellijk voor gebruik worden voorbereid. Gebruik 5 mg /ml collagenase28. Het combineren van 1 of 5 mg collagenase met BSA-buffer of eiwitvrije PBS verbeterde de resultaten niet (aanvullende figuur S1).
  2. Bevestig het deksel van de buis en verteer de long gedurende 30 minuten op een orbitale shaker met een snelheid van 150 tpm bij 37 °C. Stop de reactie door 10 ml koude BSA-buffer toe te voegen.
  3. Gebruik na de vertering een naald van 18 G om de longstukken te mengen en op te lossen. Plaats een filterzeef van 70 μm aan de bovenkant van een nieuwe conische buis van 50 ml.
    OPMERKING: Het gebruik van een kleiner micronfilter kan leiden tot het verlies van grote myeloïde populaties.
  4. Breng het verteerde longmengsel langzaam rechtstreeks op de zeef over. Gebruik de rubberen kant van een zuiger van een spuit van 10 ml om de resterende longstukken op het filter te breken. Was het verwerkte materiaal op het filter met BSA-buffer.
  5. Centrifugeer de eencellige suspensie bij 350 × g gedurende 8 minuten bij 4 °C.
  6. Gooi het supernatant voorzichtig weg en resuspend de cellen in 1 ml ACK-lysisbuffer. Meng goed met een pipet van 1 ml en incubeer gedurende 90 s bij kamertemperatuur.
  7. Voeg 10 ml koude BSA-buffer toe om de reactie te stoppen en centrifugeer bij 350 × g gedurende 7 minuten bij 4 °C.Gooi het supernatant voorzichtig weg en suspend de pellet in Kleurbuffer om de cellen te tellen met behulp van een hemocytometer.
  8. Resuspend de cellen in een concentratie van 5 × 106 cellen/ml en gebruik ze voor oppervlaktekleuring (zie rubriek 3).
    OPMERKING: Voor dit doel, plaat de cellen in een 96-well ronde-bodemplaat gevolgd door antilichaam kleuring en wasbeurten. Als er geen plaatcentrifuge beschikbaar is, gebruik dan stromingsbuizen in plaats van platen. Met dit protocol kunnen ~15-20 × 106 cellen per long worden verkregen van een 6-10 weken oude C57BL/6 muis van gemiddelde grootte.

3. Kleuring van antilichamen aan het oppervlak

  1. Breng 1 × 106 cellen in 200 μL per put over in een plaat met 96 putten. Centrifugeer de plaat bij 350 × g gedurende 7 minuten bij 4 °C. Bereid in de tussentijd de Fc-blokoplossing door anti-16/32 antilichaam (1:100) in kleuringsbuffer te verdunnen (tabel 1).
  2. Resuspend de cellen in 50 μL van de vooraf bereide Fc-blokkerende oplossing (Materiaaltafel) en incubeer gedurende 15-20 minuten bij 4 °C of op ijs.
  3. Voeg 150 μL kleurbuffer toe en centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 350 × g . Bereid ondertussen de oppervlakte-antilichaamcocktail voor door oppervlakte-antilichamen te verdunnen (1:100; Tabel 2) in kleuringsbuffer.
    OPMERKING: (i) Anti-16/32 antilichaam voor Fc-blocking kan worden gebruikt met de oppervlakteantistoffen in hetzelfde mengsel. ii) Als fixeerbare levensvatbaarheidskleurstof wordt gebruikt, voeg deze dan toe aan de antilichaamcocktail aan het oppervlak met een verdunning van 1:1.000.
  4. Resuspend de cellen in 50 μL van de vooraf bereide oppervlakte-antilichaamcocktail en incubeer gedurende 30-40 minuten bij 4 °C in het donker. Was de cellen twee keer met vlekkenbuffer.
    OPMERKING: Als er geen intracellulaire kleuring nodig is, resuspendeert u de cellen in 200 μL kleuringsbuffer en gaat u direct verder met het verzamelen van gegevens op de flowcytometer. Als alternatief kunnen cellen worden gefixeerd en opgeslagen bij 4 °C voor later verwerving. We raden aan om de cellen te gebruiken voor flowcytometrie binnen 24 uur.

4. Celfixatie en intracellulaire kleuring

  1. Bereid de fixatie-/permeabilisatiebuffer (Fix/Perm-buffer) voor door drie delen fixatie-/permeabilisatieconcentraat en 1 deel fixatie-/permeabilisatieverdunningsmiddel van de FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set te mengen (tabel 1).
  2. Resuspend de cellen in 50 μL van de vooraf bereide Fix/Perm Buffer per put van de 96-well plaat, waar de cellen werden verguld zoals beschreven in sectie 3, en incubaleer ze gedurende 20-25 min bij 4 °C in het donker.
  3. Verdun de 10x permeabilisatiebuffer als 1: 10 in gezuiverd gedeïoniseerd water om 1x permeabilisatiebuffer te bereiden.
  4. Was de cellen eenmaal met 1x permeabilisatiebuffer. Bereid ondertussen de intracellulaire antilichaamcocktail door intracellulaire antilichamen (1:100) te verdunnen in 1 ml permeabilisatiebuffer.
  5. Resuspend de cellen met behulp van 50 μL van de vooraf bereide oppervlakte-antilichaamcocktail per cel van de 96-well plaat en incubeer gedurende 40 minuten bij 4 °C in het donker.
  6. Was de cellen één keer met permeabilisatiebuffer en één keer met kleuringsbuffer. Na de laatste wasbeurt resuspendeert u de cellen in 200 μL kleuringsbuffer.
    OPMERKING: Als er geen flowcytometer met plaatlezer beschikbaar is, breng de cellen dan over in flowcytometriebuizen.
  7. Verkrijg minimaal 1,5 × 106 cellen per monster op de flowcytometer.
    OPMERKING: Voor enkele kleuren en niet-gekleurde controlemonsters is 0,5-1 × 106 cellen per monster voldoende. Het wordt aanbevolen om de individuele antilichamen te titeren die worden gebruikt om optimale kleuring te bereiken en de kosten te verlagen. Het huidige protocol is geoptimaliseerd met behulp van Fix/Perm Buffer bereid met behulp van de FoxP3 kleuring buffer set. Omdat CD68 een cytoplasmatisch is en geen nucleaire marker, kunnen andere permeabilisatieoplossingen zoals een lage concentratie paraformaldehyde of cytofix/ cytoperm kits van verschillende leveranciers voldoende zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gating strategie
De eerste stap van onze gatingstrategie is het uitsluiten van het puin en de doubletten (figuur 1A). Zorgvuldige uitsluiting van doubletten is van cruciaal belang om vals-positieve populaties te voorkomen (aanvullende figuur S2). Vervolgens worden immuuncellen geïdentificeerd met behulp van CD45+, een marker voor hematopoëtische cellen (figuur 1B). De levend-dode vlek kan worden toegevoegd om dode ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identificatie van pulmonale immuuncellen kan een uitdaging zijn vanwege de meerdere immuunceltypen die zich in de longen bevinden en hun unieke immunofenotypische kenmerken in vergelijking met hun tegenhangers die in andere weefsels verblijven. Bij verschillende pathologische aandoeningen verschijnen cellen met verschillende fenotypische kenmerken in de longen. Bleomycine-geïnduceerde longbeschadiging resulteert bijvoorbeeld in de rekrutering van circulerende monocyt-afgeleide macrofagen in de alveolaire ruimte, waar ze ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

V.A.B. heeft patenten op de PD-1 pathway onder licentie van Bristol-Myers Squibb, Roche, Merck, EMD-Serono, Boehringer Ingelheim, AstraZeneca, Novartis en Dako. De auteurs verklaren geen andere concurrerende financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01CA238263 en R01CA229784 (VAB).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 mL spuit plunjerEXELINT26265
18 G naaldenBD Precision Glide Needle305165
21 G naaldenBD Precision Glide Needle305195
50 mL conische buizenFalcon3520
70 μm cel zeefThermoFisher22363548
96-well platenFalcon/corning3799
ACK Lysing BufferThermoFisherA10492-01
anti-muis CD11bBiolegend101215Voor details zie Tabel 2
anti-muis CD11cBiolegend117339 / 117337Voor details zie Tabel 2
anti-muis CD45Biolegend103115Voor details zie Tabel 2
anti-muis CD64Biolegend139319Voor details zie Tabel 2
anti-muis CD68Biolegend137009Voor details zie Tabel 2
anti-muis GR-1Biolegend108433Voor details zie Tabel 2
anti-muis Siglec FBiolegend155503Voor details zie Tabel 2
AVERTINSigma-Aldrich240486
B220Biolegend103228Voor details zie Tabel 2
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma-Aldrich9048-46-8
CD103Biolegend121405 / 121419Voor details zie Tabel 2
CD24Biolegend138503Voor details zie Tabel 2
CD3Biolegend100205Voor details zie Tabel 2
Centrifuge
Collageenase Type 1Worthington Biochemical CorpLS004196
CX3CR1Biolegend149005Voor details zie Tabel 2
DNase IMillipore Sigma10104159001
Ethanol
F4/80Biolegend123133Voor details zie Tabel 2
FcBlock (CD16/32)Biolegend101301Voor details zie Tabel 2
Fetaal bovien serumR&D Systems
Fijne getande pincetRoboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcriptie Factor Kleuring Buffer SetThermoFisher00-5523-00
Futura VeiligheidsmesMerit Medical SystemsSMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Kleuring KitThermoFisherL34973Voor details zie Tabel 2
MERTKBiolegend151505Voor details zie Tabel 2
MHC-IIBiolegend107621Voor details zie Tabel 2
NK1.1Biolegend108705Voor details zie Tabel 2
Orbitale shakerVWRModel 200
PetrischaalFalcon351029
Gekoelde tafelcentrifugeSORVAL ST 16R
Kleine gebogen schaarRoboz Surgical Instrument Co

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
  2. Tan, S. Y., Krasnow, M. A. Developmental origin of lung macrophage diversity. Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).
  3. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964(2019).
  4. Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
  5. Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756(2020).
  6. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
  7. Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
  8. Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
  9. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
  10. Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
  11. Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
  12. Cook, P. C., MacDonald, A. S. Dendritic cells in lung immunopathology. Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).
  13. Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
  14. Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
  15. Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
  16. Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
  17. Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046(2018).
  18. Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).
  19. Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
  20. Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
  21. Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024(2019).
  22. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  23. Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
  24. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
  25. Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
  26. Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
  27. Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. Alper, S., Janssen, W. 1809, Humana Press. New York, NY. (2018).
  28. Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
  29. Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21(2020).
  30. Cong, J., Wei, H. Natural killer cells in the lungs. Frontiers in Immunology. 10, 1416(2019).
  31. Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
  32. Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879(2018).
  33. Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
  34. Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
  35. Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794(2018).
  36. Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
  37. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  38. Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
  39. Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
  40. Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
  41. Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Flowcytometrieimmuuncellen in de longidentificatie van immuuncellenaangeboren immuuncellenenkelcellensuspensiegating strategieoppervlaktemarkerspulmonaal immuunsysteem

Gerelateerde artikelen