Aggregaatkwantificering automatiseren bij Caenorhabditis elegans

Samenvatting

Het volgende protocol beschrijft de ontwikkeling en optimalisatie van een high-throughput workflow voor het kweken van wormen, fluorescentie beeldvorming en geautomatiseerde beeldverwerking om polyglutamine aggregaten te kwantificeren als een beoordeling van veranderingen in proteostase.

Samenvatting

Een toename van de prevalentie van neurodegeneratieve eiwitconformatieziekten (PCD's) heeft in de loop der jaren een grote interesse in dit onderwerp aangewakkerd. Deze toegenomen aandacht heeft opgeroepen tot de diversificatie en verbetering van diermodellen die in staat zijn om ziektefenotypen te reproduceren die zijn waargenomen bij mensen met PCD's. Hoewel muizenmodellen van onschatbare waarde zijn gebleken, zijn ze duur en worden ze geassocieerd met bewerkelijke methoden met een lage doorvoer. Het gebruik van het Caenorhabditis elegans nematodemodel om PCD's te bestuderen, wordt gerechtvaardigd door het relatieve onderhoudsgemak, de lage kosten en de snelle generatietijd, die toepassingen met een hoge doorvoer mogelijk maken. Bovendien maakt een hoge conservering tussen de C. elegans en menselijke genomen dit model een waardevol ontdekkingsinstrument. Nematoden die fluorescerend gelabelde weefselspecifieke polyglutamine (polyQ) kanalen uitdrukken, vertonen leeftijds- en polyQ-lengteafhankelijke aggregatie die wordt gekenmerkt door fluorescerende foci. Dergelijke verslaggevers worden vaak gebruikt als proxy's om veranderingen in proteostase in weefsels te volgen. Handmatige geaggregeerde kwantificering is tijdrovend en beperkt de experimentele doorvoer. Bovendien kan handmatige foci-kwantificering vertekening introduceren, omdat geaggregeerde identificatie zeer subjectief kan zijn. Hierin werd een protocol bestaande uit wormenkweek, beeldacquisitie en gegevensverwerking gestandaardiseerd om aggregatenkwantificering met hoge doorvoer te ondersteunen met behulp van C. elegans die darmspecifieke polyQ tot expressie brengen. Door een op C. elegans gebaseerde beeldverwerkingspijplijn te implementeren met CellProfiler, een beeldanalysesoftware, is deze methode geoptimaliseerd om individuele wormen te scheiden en te identificeren en hun respectieve aggregaten op te sommen. Hoewel het concept van automatisering niet helemaal uniek is, is de noodzaak om dergelijke procedures voor reproduceerbaarheid te standaardiseren, vertekening door handmatig tellen te elimineren en de doorvoer te verhogen hoog. Verwacht wordt dat deze methoden het screeningproces van grote bacteriële, genomische of medicijnbibliotheken drastisch kunnen vereenvoudigen met behulp van het C. elegans-model .

Inleiding

Leeftijdsafhankelijke neurodegeneratieve eiwitconformatieziekten (PCD's) zoals de ziekte van Alzheimer, Parkinson en Huntington, of amyotrofische laterale sclerose, worden gekenmerkt door eiwitmisvouwing die leidt tot aggregatie, celdood en weefseldegeneratie¹. Hoewel eiwitmisvouwen wordt erkend als de boosdoener, is de etiologie van deze ziekten niet duidelijk. Als zodanig is de ontwikkeling van effectieve therapieën belemmerd door het gebrek aan kennis over de factoren en aandoeningen die bijdragen aan het begin en de progressie van de ziekte. Recente studies suggereren dat veranderingen in het microbioom het begin, de progressie en de ernst van PCD's beïnvloeden ^2,3,4. De complexiteit van het menselijke, of zelfs murine, microbioom maakt het echter moeilijk om studies uit te voeren die de exacte invloed van microben op hun gastheer zouden onthullen. Daarom worden eenvoudiger organismen, zoals Caenorhabditis elegans, vaak gebruikt als ontdekkingsmiddel 5,6,7,8. Recente studies hebben C. elegans gebruikt om het effect van bacteriën op de proteostase van de gastheer en ziektepathogenese te onderzoeken ^9,10. Bacteriële kolonisatie, hormese en genomische veranderingen behoren tot de voorbeeldaandoeningen die de aggregatie van polyglutamine (polyQ) -kanalen beïnvloeden ^9,11,12. Bovendien vertonen deze verkeerd gevouwen eiwitclusters polyQ-lengte- en leeftijdsafhankelijke accumulatie in de gastheer en zijn ze geassocieerd met verminderde beweeglijkheid ^9,13. De relatief eenvoudige benadering van het kwantificeren van fluorescerend gelabelde puncta kan belangrijke gegevens genereren over aandoeningen, factoren of geneesmiddelen die van invloed zijn op het vouwen en aggregeren van eiwitten.

Hoewel kwantificering van fluorescerende puncta een betrouwbare en relatief eenvoudige procedure is gebleken, blijft de uitdaging om een protocol te ontwikkelen dat grootschalige screening van verbindingen, bacteriën of aandoeningen die van invloed zijn op eiwitaggregatie zou vergemakkelijken. Het concept van geautomatiseerde C. elegans beeldverwerking en puncta kwantificering is niet helemaal nieuw, aangezien er een aantal praktische ondersteuningstools zijn ontwikkeld^14,15. De integratie van culturing, beeldacquisitie en een verwerkingspijplijn zijn echter essentieel om variabiliteit in resultaten te elimineren en schermen met een hogere doorvoer mogelijk te maken.

Als zodanig is de bedoeling van dit manuscript om de procedure te standaardiseren die wordt gebruikt om polyQ-aggregatie in C. elegans te kwantificeren als een proxy om veranderingen in proteostase te detecteren. Deze taak werd volbracht door Gebruik te maken van CellProfiler, een open-source beeldanalysesoftware¹⁶ die in staat is tot geautomatiseerde worm- en aggregaatidentificatie, en is geïntegreerd in een groter protocol voor het kweken van wormen, het verkrijgen van afbeeldingen en het verwerken van gegevens.

Protocol

Alle procedures volgden de veiligheidsrichtlijnen die werden beoordeeld en goedgekeurd door het Institutional Biosafety Committee van de Universiteit van Florida. Er werden passende bioveiligheidsmaatregelen genomen om het risico van blootstelling aan bacteriën van biologische veiligheidsniveau 2 te beperken.

OPMERKING: Voor alle experimenten moeten C. elegans worden vermeerderd en onderhouden op nematodengroeimedia (NGM) platen bezaaid met Escherichia coli OP50.

1. Bereiding van 10 cm NGM platen

1. Meng 3 g NaCl, 2,5 g trypticase-pepton en 17 g agar in een kolf van 2 L en vul tot 1 L met dubbel gedestilleerd water (ddH₂O). Voeg magnetische roerstaaf toe voordat u gaat autoclaveren.
2. Autoclaaf het mengsel gedurende 45 minuten bij 121 °C en een druk van 21 psi. Laat het mengsel afkoelen tot 50 °C in een waterbad.
3. Voeg met behulp van aseptische technieken de volgende steriele oplossingen toe: 1 ml van 1 M CaCl_2· 2H₂O, 1 ml van 1 M MgSO_4· 7H₂O, 1 ml 5 mg / ml cholesterol opgelost in 100% ethanol (opgewarmd tot kamertemperatuur) en 25 ml 1 M KH₂PO₄ (pH = 6,0). Meng met behulp van een magnetische roerplaat. Het mengen kan gedurende 1 minuut bij 700 RPM worden uitgevoerd.
4. Giet tot het mengsel de hele plaat van 10 cm vult. U kunt ook een gegradueerde serologische pipet gebruiken om ongeveer 20 ml mengsel per plaat toe te voegen.
5. Laat de platen 24 uur drogen bij kamertemperatuur voordat ze met bacteriën worden ingezaaid of bewaar de gewone platen na het drogen bij 4 °C.
   OPMERKING: Alle mediacomponenten worden behandeld met behulp van aseptische technieken. Stappen 1.3-1.4 moeten worden uitgevoerd in een laminaire stromingskap.

2. Bereiding van NGM-agar met FUDR in 24-well platen

1. Volg de stappen 1.1-1.3.
2. Vul NGM aan met 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) en meng om een eindconcentratie van 100 μg/ml te bereiken.
   OPMERKING: FUDR remt DNA-replicatie en blokkeert als gevolg daarvan de reproductie van C. elegans door zich te richten op kiembaan en embryogenese, wat uiteindelijk de levensduur beïnvloedt. Daarom is het belangrijk om wormen volledig te laten ontwikkelen tot jonge volwassenen voordat ze overgaan op FUDR-bevattende platen.
   LET OP: FUDR is giftig en moet worden behandeld volgens het veiligheidsinformatieblad van de fabrikant.
3. Gebruik een pipetpistool om 1 ml NGM-FUDR in elke put te doseren.
   OPMERKING: Dit proces kan worden vergemakkelijkt door het gebruik van een geautomatiseerd plaatgietenssysteem.
4. Laat de plaat 24 uur drogen bij kamertemperatuur voordat u gaat zaaien met bacteriën of gewone platen bij 4 °C bewaart.

3. Zaaien van platen: OP50 en aanvullende testbacteriën

1. Om een nachtelijke E. coli OP50-cultuur te bereiden, voegt u 200 μL bacteriële aliquot uit een bevroren bouillon toe aan een Erlenmeyer van 500 ml met 250 ml verse, steriele Luria-bouillon (LB).
   OPMERKING: Het volume van de media is afhankelijk van het aantal platen dat moet worden gezaaid. Om andere bacterieculturen te bereiden, ent u een kweekbuis van 16 ml met 5 ml groeimedium met bacteriën uit bevroren bouillon met behulp van een steriele micropipettepunt.
2. Incubeer 's nachts in een incubator van 37 °C, schuddend bij 220 RPM (rotaties per minuut).
   OPMERKING: Gebruik gesteriliseerde kolven met ten minste tweemaal het werkvolume van media en sluit af met geautoclaveerde aluminiumfolie. Voer de inentingsstap en bacteriële afgifte uit met behulp van aseptische technieken.
3. Doseer 1-2 ml van de nachtelijke E. coli OP50-cultuur op het midden van elke 10 cm NGM-plaat. Deze cultuur hoeft niet verspreid te worden over de NGM plaat.
4. Laat de platen drogen bij kamertemperatuur voor gebruik/opslag.
   OPMERKING: Gezaaide platen met deksels op kunnen in een kap met luchtstroom worden geplaatst om het drogen te vergemakkelijken.

4. Kweken en zaaien van platen: 24-well platen

1. Bereid een nachtelijke kweek van gewenste bacteriestammen voor, waarbij u zich houdt aan de kweekinstructies in stap 3.1-3.2.
2. Breng 200 μL van elke bacteriecultuur over in elke put van een 24-well plaat met NGM-agar. Een volume van 200 μL bacteriën zal het hele agar-gebied bedekken, waardoor de hoeveelheid voedsel wordt gemaximaliseerd om ervoor te zorgen dat wormen het bacteriële gazon niet zullen vermijden.
3. Laat de platen openbarsten in een biologische veiligheidskast (BSC) om het drogen te vergemakkelijken. Controleer de platen regelmatig om overmatige uitdroging te voorkomen en verander de oriëntatie van de plaat om een gelijkmatige luchtstroom en droging te bevorderen. De platen moeten binnen 5 uur drogen.
   OPMERKING: Elk werk met bacteriën van biologisch veiligheidsniveau 2 moet worden uitgevoerd in gecertificeerde BSC's en goedgekeurd door het Institutional Biosafety Committee.

5. Leeftijdssynchronisatie

OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd met behulp van de juiste aseptische technieken (d.w.z. dicht bij een vlam of in een BSC werken).

1. Was gravid hermafrodieten van 10 cm OP50 platen met behulp van filter-gesteriliseerde M9 oplossing (5,8 g Na₂HPO_4· 7H₂O, 3,0 g KH₂PO₄, 5 g NaCl, 0,25 g MgSO₄·7H₂O, in 1 L ddH₂O).
   1. Pipetteer M9-oplossing meerdere keren op de plaat met behulp van een steriele glazen of plastic serologische pipet om wormen uit het bacteriële gazon te tillen.
   2. Verzamel de wormsuspensie en breng de oplossing over in een 15 ml polystyreen conische buis.
2. Centrifugeer bij 270 x g, kamertemperatuur (RT, ~23 °C), gedurende 2 min.
3. Aspirateer met behulp van een vacuümvalkolf en gooi het supernatant weg, waarbij de wormkorrel ongestoord blijft.
   1. Resuspendeer de pellet in 5-10 ml M9 om de wormen te wassen en herhaal stap 5.2-5.3 tweemaal.
4. Voeg 5 ml 20% bleekoplossing (8,25 ml ddH₂O, 3,75 ml 1M NaOH, 3,0 ml niet-kiemdodend bleekmiddel) toe aan de buis en keer continu om om de wormen op te lossen. Wormen zijn klaar om te centrifugeren zodra ze bijna volledig zijn opgelost.
   OPMERKING: Bleektijden en volume van de bleekoplossing zijn afhankelijk van de grootte van het monster. Over- en onderbleek zijn veel voorkomende fouten. Als zodanig vereist dit proces over het algemeen optimalisatie om te bepalen wanneer het monster klaar is voor centrifugatie.
5. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 423 x g en gooi het supernatant weg.
6. Voeg 10 ml steriele M9 toe om de eikorrel te resuspeneren.
   1. Centrifugeer de buis gedurende 2 minuten bij 423 x g om de eieren te pelleteren. Verwijder het supernatant met een aspiratorkolf.
   2. Herhaal stap 5.6-5.6.1.
7. Resuspendeer de eikorrel in 5 ml steriele M9 en plaats deze een nacht op een nutator op de gewenste temperatuur.
   OPMERKING: Leeftijdsgesynchroniseerde L1-larven zijn klaar om de volgende dag naar platen te worden overgebracht.

6. Wormvoorbereiding na leeftijdssynchronisatie

1. Centrifugeer de leeftijdsgesynchroniseerde wormen bij 270 x g gedurende 3 minuten bij RT (~23 °C).
2. Adem het supernatant aan in een schone omgeving, zoals een stromingskap of naast een Bunsenbrander. Laat ongeveer 200 μL van het supernatant staan en resuspendeer de wormen.
3. Breng met behulp van een micropipette de geconcentreerde wormsuspensie over naar 10 cm NGM-platen die eerder met OP50 zijn bezaaid.
   OPMERKING: Elke plaat kan 1.500 wormen ondersteunen zonder dat het voedsel opraakt; deze concentratie kan echter aanpassing vereisen, afhankelijk van de dichtheid van het bacteriële gazon en de groeitemperatuur. Het wordt aanbevolen om meerdere platen te gebruiken om te voorkomen dat wormen verhongeren. Het is belangrijk op te merken dat deze platen geen FUDR mogen bevatten.
4. Laat de platen drogen; vervolgens omkeren en gedurende 48 uur bewaren bij 25 °C.
   OPMERKING: Afhankelijk van de toestand van het scherm kunnen wormen uit stap 6.1 rechtstreeks op testplaten worden geplaatst (die bacteriën, geneesmiddelen of teststoffen bevatten). Als de gewenste testconditie de ontwikkeling beïnvloedt, moeten wormen worden gekweekt op NGM met OP50 tot jonge volwassenen (~ 48 uur) voordat ze worden blootgesteld aan testomstandigheden.
5. Was na de incubatie van 48 uur de wormen van de platen met steriele M9-oplossing en plaats ze in conische buizen.
   OPMERKING: Volwassen wormen zinken naar de bodem van de buis. De exacte tijd zal variëren afhankelijk van het aantal wormen dat wordt teruggevonden op platen van 10 cm. Onder deze omstandigheden bezinken de wormen binnen 10 minuten.
6. Voer visuele inspectie uit om de duur van de bezinkingstijd te bepalen, zodat eventuele resterende eieren of uitgekomen larven worden verwijderd.
7. Voeg een extra 10 ml M9 toe om de resterende bacteriën uit wormlichamen te spoelen.
   1. Centrifugeer de wormen gedurende 2-3 min bij 270 x g bij 23 °C.
   2. Voer de wasstap nog eens 3 keer uit. Voor het beste resultaat laat u na de laatste wasbeurt ongeveer 1-1,5 ml M9-oplossing in de buis.
   3. Breng 10 μL van de wormsuspensie over op een glazen schuif en tel het aantal wormen.
   4. Stel de wormdichtheid in op ongeveer 150 wormen per 10 μL M9. De concentratie van wormen in suspensie kan worden aangepast door M9-oplossing na centrifugatie te verwijderen of toe te voegen.
   5. Bevestig dat de gewenste concentratie is vastgesteld door het gemiddelde van tellingen van verschillende druppels. Het wordt aanbevolen om gemiddeld te tellen van ten minste drie druppels.
8. Breng met behulp van aseptische technieken 10 μL van de wormsuspensie met ongeveer 150 wormen over in elk putje van de testplaat.
9. Inspecteer de putten onder een microscoop om ervoor te zorgen dat elk een voldoende aantal wormen heeft. Extra wormen kunnen worden toegevoegd voorafgaand aan incubatie.
10. Laat de platen ongeveer 10 minuten drogen; en vervolgens omkeren en overbrengen naar een incubator van 25 °C gedurende 72 uur.
    OPMERKING: De laatste incubatietijd kan worden aangepast aan de behoeften van het experiment. De incubatietijd van 72 uur is voldoende om de groei van 150 dieren te ondersteunen die zich voeden met 200 μL bacteriën in een 24-well plate bij 25 °C.

7. Wormen voorbereiden voor beeldvorming

1. Om een effectievere bezinking te vergemakkelijken en monsterverlies te minimaliseren, immobiliseert u de wormen voorafgaand aan het wassen om zwemmen te voorkomen.
   OPMERKING: Als u met weinig monsters werkt, kan dit worden bereikt door blootstelling aan levamisol (100 μM). Als u echter met een groot aantal monsters werkt, kunnen wormen worden geïmmobiliseerd door invriezen. Bovendien zal langdurig invriezen (18-24 uur) de verdere ontwikkeling van polyQ-aggregaten tijdens de bereiding voorkomen.
   1. Plaats multi-well platen op -20 °C gedurende 15-20 min of totdat wormen niet meer bewegen.
   2. Haal de monsters uit de vriezer en laat ze 5 min staan.
2. Voeg met behulp van een micropipette 1 ml M9, gekoeld tot 4 °C, toe aan een bron van belang, druk herhaaldelijk op de zuiger 4-6 keer om de wormen in elke put te wassen.
   OPMERKING: Soms kunnen wormen zich hechten aan micropipettetips. Als zodanig moeten verschillende tips tussen elke put worden gebruikt om het mengen van wormen te voorkomen.
3. Breng de wormsuspensie over in een microcentrifugebuis en laat de wormen naar de bodem zinken.
4. Aspirateer en gooi het supernatant weg. Was het monster in totaal drie keer.
5. Nadat wormen zich tijdens de laatste wasbeurt op de bodem hebben gevestigd, zuigt u 500 μL supernatant op, waardoor 500 μL overblijft om wormen te resuspenderen.
6. Breng de resterende wormensuspensie over op een nieuwe platbodemplaat met 24 putten en plaats deze gedurende 48 uur in een vriezer van -20 °C.
   OPMERKING: Het invriezen van wormen vermindert de fluorescentie op de achtergrond en maakt een betere visualisatie van aggregaten mogelijk.

8. Beeldvorming

1. Haal de platen uit de vriezer en laat ontdooien, veeg overtollige condens weg en verwijder het deksel voordat u het in beeld brengt.
   OPMERKING: De details van het vastleggen van afbeeldingen variëren afhankelijk van de gebruikte apparatuur en software. Protocollen voor deze sectie mogen alleen als leidraad dienen en er zijn wijzigingen te verwachten. Het is ook vereist om afbeeldingen vast te leggen in het tiff-bestandsformaat.
2. Gebruik tijdens het vastleggen van de afbeelding de volgende microscoopinstellingen: Belichtingstijd, 500 ms; 40x vergroting met 0,63x camera-adapter (25,2x), GFP-intensiteit ingesteld op 100%.
   OPMERKING: Verschillende microscoopconfiguraties en -systemen kunnen andere beelden verkrijgen dan die in de resultatensectie. Om een meer universele beschrijving van de vereiste afbeeldingen te bereiken, worden meer objectieve details met betrekking tot afbeeldingen verstrekt. Aggregaten moeten tussen 1,0-10,0 pixels in diameter zijn met een fluorescerende intensiteit van 0,10-1,0 (willekeurige eenheden, schaal 0-1) om correct te worden geïdentificeerd door de CellProfiler. De fluorescerende achtergrond voor deze geaggregeerde beelden ligt over het algemeen onder de drempel van 0,10. Voor brightfield-afbeeldingen varieert de wormintensiteit van 0,7-1,0 met een achtergrondintensiteit van 0,1-0,2. De gemiddelde lengte van wormen in brightfield-afbeeldingen varieert van 250 pixels tot 350 pixels in lengte van kop tot staart.
3. Pas de doorgelaten lichtregeling aan totdat de wormen helder verlicht lijken in vergelijking met de donkere achtergrond. Vermijd overbelichting; het zal de wormgrootte vergroten.
4. Het kan nodig zijn om de posities van wormen in de put te veranderen om overmatig klonteren te voorkomen. Verspreid samengeklonterde wormen met behulp van een pipetpunt.
5. Stel het kanaal in op GFP om een brandpuntsvlak voor beide afbeeldingen vast te stellen.
   OPMERKING: Het is essentieel dat het brandpuntsvlak wordt bepaald in het GFP-kanaal. Elke verandering in focus die wordt aangebracht tijdens het vastleggen van brightfield-afbeeldingen zal resulteren in de verkeerde uitlijning van aggregaten en wormen tijdens de beeldanalyse.
6. Leg een brightfield-beeld vast en neem onmiddellijk het bijbehorende fluorescerende beeld zonder de plaat te storen.
7. Voer testafbeeldingen uit door de pijplijn om intensiteits- en groottewaarden voor objecten in de afbeelding te bepalen volgens de "OPMERKING" na stap 8.2.
   OPMERKING: CellProfiler kan voorafgaand aan de analyse alle benodigde informatie verstrekken over de intensiteit en lengte van objecten.
8. Om afbeeldingen te beoordelen, download eerst CellProfiler¹⁷. Open de software en sleep interessante afbeeldingen naar het vak Afbeeldingen.
9. Klik op de afbeeldingen in de bestandslijst om ze te openen.
10. In de linkerbovenhoek van het scherm staan verschillende pictogrammen; gebruik ze om de grootte van de objecten te meten of een specifiek gebied te vergroten. Selecteer het vergrootglas om een interessant gebied te markeren.
11. Selecteer het pijlpictogram om de lengte van zowel wormen als aggregaten te meten.
12. Plaats de muisaanwijzer op het gewenste object om de intensiteitswaarde te bepalen die te zien is op het onderste gedeelte van het scherm.
    OPMERKING: Aangezien alle afbeeldingen in grijswaarden zijn gemaakt, zijn alle rode, blauwe en groene pixelwaarden identiek.

9. Beeldanalyse

1. Als u de CellProfiler-pijplijn voor beeldanalyse wilt gebruiken, geeft u de afbeeldingsparen een juiste naam. Gebruik de volgende indeling: P1_A01_S1_C1, waarbij P1 verwijst naar de specifieke plaat en de respectieve numerieke aanduiding; "A", verwijst naar de rij en "01" naar de kolom; "S" verwijst naar een specifiek beeldpaar voor een enkele put; "C" verwijst naar het kanaal, waar "1" wordt gebruikt om brightfield-afbeeldingen aan te duiden en "2" voor fluorescerende beelden.
2. Download CellProfiler (versie 4.1.3 of hoger) van de officiële website¹⁷.
3. Download de pijplijn (aanvullend bestand 1). Upload de pijplijn (Pipeline) naar CellProfiler door Bestand > > Pipeline importeren uit Bestand te selecteren.
   OPMERKING: Modules 2 en 3 zijn uitgeschakeld omdat ze onnodig werden geacht. Hun functie kan worden hersteld als beeldanalyse geen bevredigende scheiding en identificatie van wormen oplevert; aanpassing van de pijpleiding is echter vereist.
4. Als u deze modules wilt opnemen, selecteert u de selectievakjes links van elke module. Hernoem de binaire invoerafbeelding voor de module "UntangleWorms" naar de uitvoerafbeelding van de module "convertobjectstoimage".
5. Tijdens het eerste gebruik kan een foutbericht verschijnen met betrekking tot module 2. Als dit gebeurt, gaat u verder met de analyse.
6. Upload een trainingsset die wordt gebruikt om wormen te identificeren naar de module "Ontwarrenwormen". Deze trainingsset is te vinden in Aanvullend Dossier 2.
   1. Selecteer de module Ontwarren wormen om de instellingen te openen.
   2. Identificeer de bestandsnaam van trainingsset en selecteer het pictogram van het uploadbestand.
   3. Upload aanvullend bestand 2 (trainingsset).
7. Upload afbeeldingen door de module Afbeeldingen in de linkerbovenhoek te selecteren. Sleep afbeeldingen met de juiste naam zoals beschreven in stap 9.1.
8. Voordat u afbeeldingen analyseert, selecteert u de gewenste uitvoermap die wordt gebruikt om de resultaten op te slaan.
   1. Klik op de knop Uitvoerinstellingen in de linkerbenedenhoek van het programma.
   2. Selecteer het mappictogram rechts van Standaarduitvoer om de gewenste uitvoerlocatie te kiezen.
9. Selecteer het pictogram Afbeeldingen analyseren om de afbeeldingsanalyse te starten.
10. Als de analyse te lang duurt om te voltooien en vastzit aan het verwerken van een enkele afbeelding, is dit waarschijnlijk te wijten aan problemen met beeldacquisitie. Als dit gebeurt, onderbreekt u de uitvoering af en gaat u verder met het identificeren van de onbewerkte afbeelding(en) door de uitvoermap te sorteren en op te merken welke afbeeldingsnamen niet worden gevonden.
    OPMERKING: De afbeeldingen vereisen mogelijk extra verwerking om grote of intens verlichte artefacten te verwijderen die niet door de pijplijn kunnen worden verwerkt. In sommige gevallen moeten dergelijke afbeeldingen mogelijk worden uitgesloten van de analyse.
11. Na volledige analyse organiseert de software de resultaten in een Excel-spreadsheet met individuele wormen (kolom N) en hun respectieve aantal aggregaten (kolom K).
    OPMERKING: Een succesvolle run levert een Excel-spreadsheet op met het aantal aggregaten per geïdentificeerde worm voor elke put. Deze gegevens kunnen worden gemanipuleerd op een manier die door de experimentator wordt bepaald.
12. Download metadata organizer (Graphical User Interface) van Supplemental File 3 (Windows) of Supplemental File 4 (Mac) om gemakkelijk gegevens uit het csv-uitvoerbestand van CellProfiler te ordenen.
    OPMERKING: Deze software heeft geen officiële licentie en wordt niet automatisch geopend na het downloaden.
13. Volg de stappen 9.14-9.17 als u Windows OS 64-bits gebruikt. De software werkt niet op Windows 32-bit. Volg de stappen 9.18-9.20 als u Mac OS gebruikt. Stappen 9.21-9.22 zijn hetzelfde voor beide besturingssystemen.
14. Zoek voor Windows OS het gedownloade bestand en pak het uit naar de gewenste locatie.
15. Zoek en open de uitgepakte map met de naam gui_windowsOS_64x en start de applicatie door op het "gui" applicatiepictogram te klikken.
16. Er kan een prompt worden geopend waarin toestemming wordt gevraagd om uit te voeren. Selecteer Meer informatie en klik vervolgens op Toch vertrouwen.
17. De metadata organizer is klaar om CellProfiler output CSV-bestanden te slepen en neer te zetten. Ga verder met stap 9.21.
18. Zoek voor Mac OS het gedownloade bestand en open gui_macOS_64x.zip. Deze stap zou automatisch alle bestanden moeten uitpakken.
19. Open de uitgepakte map in "Downloads".
20. Klik met de rechtermuisknop op de applicatie "gui" en selecteer Openen. Er verschijnt een prompt waarin om toestemming wordt gevraagd om te openen vanwege het ontbreken van een officiële licentie. Selecteer Openen en ga verder met stap 9.21.
21. Klik op Upload Your Files Here of sleep de gewenste CellProfiler CSV-bestanden.
22. Klik op de knop Organiseren , waarmee de gebruiker naar een nieuw scherm wordt gebracht met de knop Bestanden downloaden. Klik op de knop en selecteer de gewenste locatie om het uitvoerbestand op te slaan. Het uitvoerbestand wordt weergegeven als de oorspronkelijke bestandsnaam met de extensie "_organized" toegevoegd aan de bestandsnaam.

Resultaten

Hierin wordt een C. elegans-workflow beschreven die kweek-, beeldacquisitie- en verwerkingsprotocollen omvat die beoordeling van polyQ-aggregatie in aanwezigheid van verschillende bacteriën mogelijk maken met behulp van een 24-well plaatformaat als het kweek- en beeldvormingsplatform (figuur 1). Dit protocol kan worden aangepast om het effect van bacteriën, specifieke aandoeningen, kleine moleculen, medicijnen of genomische manipulaties op de proteostase van de gastheer te bestuderen. De beschreven methode is geoptimaliseerd met behulp van wormen die constitutief darmpolyQ tot expressie brengen, gefuseerd tot een geel fluorescerend eiwit (vha6p::p olyQ44::YFP); andere modellen die rapporteren over proteostase in spieren of neuronen kunnen echter ook worden gebruikt met verdere optimalisatie. Voorlopige experimenten tonen bijvoorbeeld de toepassing van deze methoden aan bij de kwantificering van eiwitaggregaten in andere weefsels zoals spierpolyQ (aanvullende figuur 1). Er is echter een aanpassing aan de pijplijn nodig om de totale grootte en helderheid op de juiste manier aan te passen, zoals vermeld in sectie 8 OPMERKING.

Figuur 1: Visuele weergave van de workflow. De belangrijkste stappen van het protocol omvatten vijf verschillende stadia: wormvoorbereiding en leeftijdssynchronisatie (stappen 1-5), intestinale kolonisatie / wormbehandeling (stap 6), monstervoorbereiding voor beeldvorming (stap 7), beeldacquisitie (stap 8) en beeldverwerking (stap 9). De "Secties" van het protocol worden in de afbeelding "Stappen" genoemd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De eerste optimalisatie-experimenten onthulden verschillende problemen in verband met overbevolking als gevolg van een groot aantal nakomelingen, wat resulteerde in een snellere voedseluitputting. De suppletie van FUDR in NGM-platen beschreven in sectie 2 loste dit probleem op (figuur 2). Bovendien hadden wormen die verschillende bacteriën kregen in aanwezigheid van FUDR een consistentere lichaamsgrootte, waardoor een meer uniforme en nauwkeurige wormdetectie mogelijk was.

Figuur 2: Het gebruik van FUDR verbetert de beeldkwaliteit door nageslacht te verminderen. FUDR-aangevulde platen elimineren C. elegans nakomelingen in vergelijking met wormen gekweekt op niet-FUDR controle NGM platen bezaaid met E. coli OP50. Beelden werden verkregen met een vergroting van 25,2x (40x vergroting met een 0,63x cameraadapter). Schaalbalken = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Achtergrondfluorescentie droeg bij aan vals-positieve detectie van polyQ-aggregaten. Om een dergelijk fluorescentiesignaal in het darmkanaal te verminderen en de geautomatiseerde detectie van aggregaten te verbeteren, was het noodzakelijk om wormen in te vriezen voorafgaand aan beeldvorming. Het invriezen van wormen bij -20 °C gedurende 18-48 uur verbeterde de detectie van polyQ-aggregaten aanzienlijk door achtergrondfluorescentie te elimineren (figuur 3A). Het menselijk oog is in staat om onderscheid te maken tussen aggregaten en achtergrondfluorescentie; vandaar dat de handmatige telling voor en na de bevriezing hetzelfde is (figuur 3B). Geautomatiseerd tellen is echter niet zo nauwkeurig, maar het invriezen verbeterde het aantal geautomatiseerde tellingen aanzienlijk met een nauwkeurigheid die vergelijkbaar is met handmatig tellen (figuur 3B).

Figuur 3: Bevriezing verbetert de aggregaatdetectie. (A) Fluorescerende beelden van C. elegans die darmpoly uitdrukkenQ44::YFP voor en na bevriezing. Inserts vertegenwoordigen close-upafbeeldingen van het geselecteerde gebied. Schaalstaven = 500 μm. (B) Gemiddeld aantal aggregaten per darm in wormen gekoloniseerd met P. aeruginosa MPAO1 voor en na bevriezing met behulp van handmatige of geautomatiseerde (pijplijn) aggregaatkwantificering. De gegevens vertegenwoordigen twee biologische replicaties (n = 60-109). Statistische significantie werd berekend met behulp van student t-test (**** p < 0,0001). Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van het gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Omgekeerde brightfield-verlichting werd gebruikt om de hele C. elegans (figuur 4A) en het GFP-kanaal te detecteren om polyQ44::YFP-aggregaten in beeld te brengen (figuur 4B). Wormdetectie, ontwarring en geaggregeerde kwantificering voor elke worm werden gedaan door een geoptimaliseerde CellProfiler-beeldverwerkingspijplijn (Supplemental File 1) toe te passen, waarmee het aantal aggregaten per individuele worm kan worden verkregen (figuur 4C-D). Om de haalbaarheid van deze aanpak en de nauwkeurigheid van de geautomatiseerde aggregaatdetectie en kwantificering te testen, werden wormen die darmspecifieke polyQ44::YFP tot expressie brachten, gekweekt en voorbereid voor beeldvorming volgens de vastgestelde protocollen (secties 1-7). Het aantal aggregaten per worm werd beoordeeld met behulp van de geautomatiseerde pijplijn (secties 8-9) of handmatig tellen. Elk experiment werd uitgevoerd in drie onafhankelijke onderzoeken met 90-571 wormen per aandoening. Hoewel het gemiddelde aantal aggregaten per darm verkregen met twee onderzoeken geen significant verschil had, hadden wormen in de derde studie significant minder aggregaten wanneer ze werden gekwantificeerd met behulp van de geautomatiseerde aanpak (figuur 5A). Het gemiddelde aantal aggregaten uit de drie onderzoeken resulteerde in iets, maar significant minder aggregaten wanneer de kwantificering werd uitgevoerd met behulp van de CellProfiler-pijplijn (secties 8-9) (figuur 5B). Niettemin was het verschil tussen de twee benaderingen minimaal, wat aangeeft dat de geautomatiseerde methode kan worden toegepast op grootschalige schermen.

Figuur 4: Geaggregeerde detectie met behulp van CellProfiler. (A) Brightfield-afbeelding die wordt gebruikt om wormlichamen te identificeren. (B) Origineel fluorescerend beeld verkregen met behulp van GFP-kanaal en gebruikt om een totaal aantal intestinale polyQ44::YFP-aggregaten te identificeren en te kwantificeren. (C) Aggregaten geïdentificeerd met CellProfiler. (D) Een totaal aantal geïdentificeerde aggregaten over de oorspronkelijke fluorescerende afbeelding met worm- en aggregaatcontouren. Het vastleggen en verwerken van afbeeldingen werd uitgevoerd met behulp van de instellingen die worden beschreven in secties 8-9. Panelen E-H vertegenwoordigen close-upbeelden van de overeenkomstige geschetste gebieden in afbeeldingen A-D. Beelden werden verkregen met een vergroting van 25,2x (40x vergroting met een 0,63x cameraadapter). Schaalbalken = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5: Effectiviteit van geautomatiseerde geaggregeerde kwantificering. (A) Gemiddeld geaggregeerd aantal per darm in wormen gekoloniseerd met controle E. coli OP50 met behulp van handmatige telling (handmatig) en geautomatiseerde cellprofiler-gebaseerde kwantificering (pijplijn). De resultaten vertegenwoordigen gegevens die zijn geanalyseerd in drie afzonderlijke onderzoeken (T1-T3) (n = 90-571). (B) Het gemiddelde aantal aggregaten per darm werd verkregen met behulp van handmatige of geautomatiseerde (Pipeline) geaggregeerde kwantificering. Statistische significantie werd berekend met behulp van student t-test (* p < 0,05, ** p < 0,01). Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Om de reproduceerbaarheid van resultaten tussen verschillende experimentatoren te evalueren, werden beelden van een plaat met zes putten van wormen die pseudomonas aeruginosa MPAO1 of Escherichia coli OP50 kregen, verkregen door drie individuen, van wie er twee geen eerdere ervaring hadden met het in beeld brengen van wormen met behulp van deze protocollen. Afbeeldingen verzameld uit elke put bevatten ergens tussen de 30-115 gedetecteerde wormen. Een niet-significant verschil in aggregatie werd gedetecteerd in wormen uit dezelfde putten die door de drie experimentatoren in beeld werden gebracht. Hoewel het gemiddelde aantal aggregaten per darm zeer consistent bleef tussen de drie experimentatoren voor wormen die MPAO1 en OP50 kregen, waren er enkele statistisch significante verschillen in het gemiddelde aantal aggregaten, maar alleen in wormen gekoloniseerd door MPAO1 (aanvullende figuur 2). Deze resultaten benadrukken de reproduceerbaarheid van de resultaten, zelfs tussen onervaren experimentatoren.

Om ervoor te zorgen dat de reproduceerbaarheid van aggregaatkwantificering niet significant wordt beïnvloed door de positie van de worm, werd een set van 15 wormen geselecteerd en 15 afzonderlijke keren in beeld gebracht na agitatie tussen elke beeldopname met behulp van een pipetpunt. Beelden van aggregaten in wormen gevoed met E. coli OP50 en P. aeruginosa MPAO1 werden verzameld en geanalyseerd met CellProfiler. Het gemiddelde aantal aggregaten van elk van deze verschillende sets afbeeldingen was enigszins maar niet significant verschillend, wat de reproduceerbaarheid van deze benadering verder ondersteunde (aanvullende figuur 3).

Kolonisatie van de C. elegans-darm met gramnegatieve enterische pathogenen heeft aangetoond dat het de proteostase in weefsels verstoort, waarbij P. aeruginosa een van de krachtigste inductoren van polyQ-aggregatie^{is 9}. Om te bepalen of deze geoptimaliseerde protocollen met succes P. aeruginosa-gemedieerde verbetering van aggregatie zullen detecteren en kwantificeren, werden wormen die intestinale polyQ tot expressie brachten gekoloniseerd met E. coli OP50 (controlebacteriën) en P. aeruginosa MPAO1, secties 1-8 werden uitgevoerd. De verkregen beelden werden geanalyseerd met CellProfiler (sectie 9, Aanvullend bestand 1). De resultaten van geautomatiseerde kwantificering laten een significante toename zien van het aantal aggregaten geïnduceerd door P. aeruginosa MPAO1, wat consequent resulteert in een tweevoudige verbetering in vergelijking met wormen gevoed met controle E. coli OP50 (figuur 6).

Figuur 6: Het gemiddelde aantal aggregaten per darm in wormen gekoloniseerd met controle E. coli OP50 en P. aeruginosa MPAO1. Het aantal aggregaten per darm werd beoordeeld met CellProfiler (rubrieken 8-9). Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde aantal aggregaten per darm in wormen gekoloniseerd met OP50 (n = 1068) en MPAO1 (n = 1557). Statistische significantie werd berekend met behulp van student t-test (**** p < 0,0001). Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

De geoptimaliseerde pijplijn is ontworpen om grootschalige schermen te ondersteunen voor omstandigheden die van invloed zijn op proteostase. Om de haalbaarheid van deze aanpak te testen bij het screenen van grote bibliotheken bacteriën op hun effect op de proteostase van de gastheer, werd de hierin beschreven pijplijn gebruikt (secties 1-9) om het effect van 90 P. aeruginosa niet-essentiële gen knock-out mutante stammen op polyQ-aggregatie^{te testen 18}. Dit pilotscherm maakt deel uit van een groter project dat is ontworpen om alle P. aeruginosa niet-essentiële mutante stammen te screenen op hun vermogen om de proteostase van de gastheer te beïnvloeden. Van de 90 geteste bacteriestammen vertoonde de kolonisatie van de darm van C. elegans met één kandidaat een significante afname van het aantal aggregaten (figuur 7). Vervolgexperimenten om de gevoeligheid van deze test te evalueren werden uitgevoerd via handmatige geaggregeerde tellingen uit een willekeurige selectie van zes P. aeruginosa-mutanten die niet significant verschilden van de MPAO1-controle. Deze experimenten werden uitgevoerd met behulp van de meer traditionele 6 cm NGM-platen, waarbij wormen op teststammen werden overgebracht als L1's om eerder vastgestelde methoden samen te^{vatten 9}. Uit de bevestigingsexperimenten door handmatig tellen bleek dat geen van de mutanten, inclusief degene die het aantal aggregaten significant verminderde (figuur 7), polyQ-aggregatie beïnvloedde (aanvullende figuur 4). Bovendien werden de subtiele veranderingen in aggregatie waargenomen in het scherm van de 90 mutante stammen niet gedetecteerd bij handmatige tellingen van geselecteerde kandidaten, wat aangeeft dat dergelijke veranderingen kunnen optreden als gevolg van biologische en experimentele variabiliteit, zoals lage n-waarde. Gezamenlijk geven de resultaten aan dat hoewel onze methode op betrouwbare wijze belangrijke veranderingen kan oppikken, subtiele veranderingen waarschijnlijk zullen worden gemist en alle potentiële kandidaten individueel moeten worden bevestigd.

Figuur 7: Het aantal aggregaten per darm in een representatieve steekproefset van wormen gekoloniseerd door 92 bacteriestammen. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde aantal aggregaten per darm genormaliseerd naar dat van wormen gekoloniseerd met MPAO1. Stippellijnen vertegenwoordigen het gemiddelde aantal aggregaten in wormen gekoloniseerd met MPAO1 (boven, open cirkel) en OP50-controle (onder, open vierkant). Vaste symbolen vertegenwoordigen 90 verschillende knock-out mutante stammen van P. aeruginosa MPAO1. Het gemiddelde aantal aggregaten per worm tussen wormen gekoloniseerd met MPAO1 en een enkele mutant was statistisch significant. Grijze cirkels vertegenwoordigen monsters die handmatig zijn bevestigd (aanvullende figuur 4). Statistische significantie werd berekend met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) gevolgd door meervoudige vergelijking dunnett's post-hoc test (** p < 0,01, **** p < 0,0001). Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Om de grote hoeveelheid gegevens die door CellProfiler wordt gegenereerd te beheren, is een grafische gebruikersinterface (GUI) ontwikkeld om de gegevensverwerking en -organisatie te automatiseren (figuur 8). De GUI is ontwikkeld met behulp van Tkinter, een open-source Python cross-platform widget toolkit. Uit de gegeven metadata haalt de applicatie het aantal aggregaten (kolom K) uit elke put (kolom J) die in een plaat aanwezig is. Een Python-gegevensverwerkingsbibliotheek genaamd "Pandas" werd gebruikt om het bovengenoemde proces uit te voeren. De GUI-toepassing biedt ondersteuning voor slepen en neerzetten voor gebruikers om gegevensbestanden te uploaden. De gegevens in elk bestand worden opgeslagen in de vorm van een tweedimensionale tabelstructuur die een gegevensframe wordt genoemd. Een leeg woordenboekpaar wordt geïnitialiseerd voor elke unieke put die binnen het gegevensframe wordt gevonden. Vervolgens worden de verschillende aggregaten in elke put geteld en toegevoegd aan hun respectieve woordenboekparen. De kolom met minder gegevens is opgevuld met lege getaxeerde tekenreeksen om ervoor te zorgen dat elke kolom even groot is. Ten slotte wordt de structuur geconverteerd naar een gegevensframe dat in de vorm van een spreadsheet wordt geëxporteerd naar de door de gebruiker opgegeven map.

Figuur 8: Grafische gebruikersinterface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Detectie van spierspecifieke polyQ-aggregaten. Wormen die spierspecifieke polyQ35::YFP tot expressie brengen, werden geplateerd als L1's en gekweekt op OP50 gedurende 48 uur. Zodra wormen zich ontwikkelden tot jonge volwassenen, werden ze overgebracht naar 24-well NGM-platen, aangevuld met 100 μg / ml FUDR en gezaaid met MPAO1 gedurende nog eens 72 uur voordat ze werden afgebeeld. (A) Brightfield-afbeelding die wordt gebruikt om wormlichamen te identificeren. (B) Origineel fluorescerend beeld verkregen met behulp van GFP-kanaal. (C) Aggregaten geïdentificeerd met CellProfiler. (D) Een totaal aantal geïdentificeerde aggregaten over de oorspronkelijke fluorescerende afbeelding met worm- en aggregaatcontouren. Het vastleggen en verwerken van afbeeldingen werd uitgevoerd met behulp van de instellingen die worden beschreven in secties 8-9. Panelen E-H vertegenwoordigen close-upbeelden van de overeenkomstige geschetste gebieden in afbeeldingen A-D. Schaalbalken = 500 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Reproduceerbaarheid van geaggregeerde kwantificering tussen verschillende experimentatoren. Gemiddeld aantal aggregaten gekwantificeerd met CellProfiler voor zes putten wormen gekoloniseerd met P. aeruginosa MPAO1 (zwarte staven) en zes putten van wormen gekoloniseerd met controle E. coli OP50 (grijze staven). Elke put werd in beeld gebracht door drie experimentatoren (AVS, DMC, RDH). Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde aantal aggregaten per darm (n = 30-115). Statistische significantie werd berekend met behulp van eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest (* p < 0,05, ** p < 0,01). Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Het effect van de wormpositie op de reproduceerbaarheid van aggregaatkwantificering. Gemiddeld geaggregeerd aantal per darm in wormen gekoloniseerd met controle E. coli OP50 (grijze staven) en P. aeruginosa MPAO1 (zwarte balken). De resultaten vertegenwoordigen het gemiddelde aantal aggregaten per darm (15≥n≥12) gekwantificeerd met CellProfiler. De positie van wormen in de putten werd veranderd door agitatie tussen elke acquisitie. In geen van beide groepen werden statistisch significante verschillen gevonden. Statistische significantie werd berekend met behulp van one-way ANOVA gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest. Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Bevestiging van het pilotscherm met handmatig tellen. Het gemiddelde aantal aggregaten per darm werd handmatig gekwantificeerd. De gegevens vertegenwoordigen aggregatieprofielen van wormen gekoloniseerd met zes MPAO1 knock-out mutanten (grijze cirkels Figuur 7) vergeleken met wild-type MPAO1- en OP50-controles (n = 30). Statistische significantie werd berekend met behulp van eenrichtings-ANOVA gevolgd door meervoudige vergelijking dunnett's post-hoc test (**** p < 0,0001). Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Het effect van FUDR op intestinale polyQ-aggregatie. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde aantal polyQ44::YFP-aggregaten per darm (n = 20). Wormen werden overgebracht op controle (geen FUDR) of FUDR-bevattende platen (100 μg/ml) na 48 uur groei bij 25 °C op E. coli OP50. Handmatige tellingen werden verzameld na nog eens 48 uur. Statistische significantie werd berekend met behulp van student t-test (ns = niet significant). Foutbalken vertegenwoordigen SEM. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Proteostase pijplijn. Downloadbare pijplijn voor beeldanalyse voor gebruik in CellProfiler. Instructies voor het aanbrengen zijn te vinden in sectie 9. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Trainingsset ontwarren worm. Bestand te uploaden naar de module "UntangleWorms". Deze specifieke trainingsset is specifiek voor de wormen die in de initiële aanpak worden gebruikt. Veranderingen in de grootte en vorm van de worm zullen de nauwkeurigheid en kwaliteit van de identificatie veranderen. Het kan nodig zijn om een meer gepersonaliseerd trainingsbestand te maken. Instructies voor het maken van een nieuwe trainingsset zijn te vinden op de officiële CellProfiler-website¹⁷. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Grafische gebruikersinterface voor Windows-besturingssysteem. gui_windowsOS_64x.zip. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Grafische gebruikersinterface voor Mac-besturingssysteem. gui_MacOS_64x.zip. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het beschreven protocol schetst procedures voor C. elegans-kweek - en beeldverwerking die CellProfiler bevat, een open-source beeldanalysesoftware. De representatieve resultaten tonen reproduceerbaarheid, vermindering van bias en schaalbaarheid. Deze gestandaardiseerde procedure zal de screeningstrategieën verbeteren die worden gebruikt met grote bacteriële, genomische of medicijnbibliotheken. Terwijl er andere geautomatiseerde C. elegans-methoden voor objectdetectie bestaan, biedt de beschreven techniek een gestandaardiseerde pijplijn met een hogere doorvoer die culturing, beeldacquisitie en analyse integreert.

Verschillende variaties van wormenteelt moesten worden getest om het hierin beschreven protocol te optimaliseren. Aanvankelijk werden wormen onmiddellijk na leeftijdssynchronisatie (L1-stadium) overgebracht naar monsters van bacteriën. Een dergelijke aanpak resulteerde echter in een populatie wormen met variabele groottes, zelfs onder wormen binnen dezelfde put. C. elegans staan bekend om het vermijden van pathogenen¹⁹, wat kan hebben bijgedragen aan de waargenomen variabiliteit in grootte en uiteindelijk van invloed kan zijn op downstream imaging-wormdetectie, in het bijzonder. Om dergelijke variabiliteit te elimineren, werd het hele NGM-gebied in elke put bedekt met testbacteriën. Bovendien kregen wormen E. coli OP50 en mochten ze zich gedurende 48 uur bij 25 °C volledig ontwikkelen tot jonge volwassenen. Het toestaan van wormen om volwassen te worden op E. coli OP50 voordat ze worden overgebracht op testbacteriën resulteerde in een consistentere lichaamsgrootte. Bovendien werden overbevolking en snelle voedseluitputting door nakomelingen geëlimineerd door NGM-agar aan te vullen met FUDR. De implementatie van FUDR verwijderde nakomelingen en verbeterde geautomatiseerde wormidentificatie, die werd verdoezeld door nageslacht dat zich mengde met de ouderlijke populatie. Het is echter belangrijk om voorzichtig te zijn en de juiste controles te gebruiken bij het gebruik van FUDR, omdat bekend is dat de verbinding C. elegans proteostase en levensduur^{20,21 beïnvloedt}. Onder de in dit protocol beschreven omstandigheden had FUDR geen invloed op intestinale polyQ-aggregatie (aanvullende figuur 5); daarom was het gebruik ervan geschikt en gunstig voor de beschreven methode.

Het invriezen van monsters voorafgaand aan beeldvorming bleek een cruciale stap in de succesvolle werking van de pijpleiding. De geaggregeerde tellingen vóór het bevriezen waren significant hoger dan handmatige tellingen (figuur 3B). Wormen gedurende 18-48 uur bij -20 °C houden voorafgaand aan beeldvorming verminderde de achtergrondfluorescentie en verbeterde uiteindelijk de aggregaatdetectie (figuur 3A). De effecten van bevriezing op aggregaatdetectie zijn alleen onderzocht voor polyQ en mogen niet worden gegeneraliseerd naar andere modellen zonder verder onderzoek van dergelijke effecten.

Ondanks dat alle omstandigheden hetzelfde werden gehouden, werd waargenomen dat het gemiddelde aantal aggregaten per worm kon variëren tussen verschillende runs, terwijl de verhouding tussen het aantal aggregaten bij dieren gekoloniseerd met OP50 versus MPAO1 consistent bleef (figuur 6, aanvullende figuur 2, aanvullende figuur 5). Daarom is het van essentieel belang om altijd E. coli OP50-controle, of eventuele aanvullende geschikte referentiecontroles, in elke run op te nemen. Een dergelijke variabiliteit in geaggregeerde tellingen tussen experimenten kan worden beïnvloed door omgevingsomstandigheden (temperatuur, vochtigheid)^22,23 of genetische achtergrond⁸. In feite werd waargenomen dat na langdurige kweek de darmfluorescentie drastisch afnam of volledig verloren ging, waardoor een nieuwe stam uit bevroren voorraad moest worden ontdooid. De waargenomen afname van fluorescentie kan een gevolg zijn van genetische veranderingen die toxische transgenen onderdrukken, zoals die welke polyQ tot expressie brengen. Niettemin benadrukt de uitzonderlijke reproduceerbaarheid van de resultaten waargenomen tussen verschillende experimentatoren (aanvullende figuur 2), tussen biologische replicaties (figuur 5) en binnen dezelfde steekproef (aanvullende figuur 3) de kracht van deze aanpak.

Talrijke rapporten hebben intestinale polyQ gebruikt om proteostase 9,11,12,13,24,25 te ^bestuderen. Een directe vergelijking tussen de resultaten kan echter niet worden gemaakt vanwege de variabiliteit tussen experimentele benaderingen en uitleesmethoden. Niettemin worden enkele resultaten van eerder gepubliceerde gegevens samengevat door de geautomatiseerde kwantificering die hierin wordt beschreven, waaronder bacteriële inductie van aggregatie ^9,13 en een vergelijkbaar aantal aggregaten¹¹. Gezamenlijk biedt de beschreven pijplijn een waardevol hulpmiddel om proteostase te bestuderen.

De hierin beschreven methode heeft een aantal inherente uitdagingen. Het vereist bijvoorbeeld voldoende tijd om alle componenten van dit protocol onder de knie te krijgen, wat met name geldt voor sectie 8 van het protocol, dat bekendheid met de test vereist om te bepalen of de verkregen afbeeldingen geschikt zijn voor pijplijnanalyse. Afwijkingen van de beeldacquisitie-instellingen die in dit protocol worden gebruikt, zijn mogelijk; wijziging van de instellingen en wormtrainingsset zal echter waarschijnlijk nodig zijn. Deze pijplijn kan aggregaten van verschillende groottes onderscheiden en die raken, wat het "mengen" van aggregaten beperkt en uiteindelijk de detectiegevoeligheid verhoogt. Er kunnen zich echter problemen voordoen bij het identificeren van grote aggregaten die het geaccepteerde groottebereik overschrijden, omdat het uitbreiden van de bovenste groottedrempel kan leiden tot fouten die worden veroorzaakt door slechte identificatie, zoals het onvermogen om aggregaten te onderscheiden die elkaar raken. Voorafgaand aan de beeldanalyse moet een balans worden gevonden tussen nauwkeurigheid, grootte en intensiteit. De efficiëntie van geaggregeerde identificatie kan verder worden verbeterd door machine learning op te nemen om een neuraal netwerk te creëren dat in staat is om aggregaatdetectie te verbeteren. Dergelijke verbeteringen worden momenteel onderzocht en zullen enorm helpen bij het aanpakken van actuele problemen, zoals de detectie van aggregaten die op verschillende brandpuntsvlakken liggen of abnormale vormen hebben.

Een opmerkelijke zwakte van de beschreven methode is de variabiliteit in geautomatiseerde geaggregeerde tellingen, omdat ze niet altijd worden samengevat door handmatige tellingen in wormen die verschillende bacteriestammen krijgen. Op basis van geautomatiseerde tellingen hadden wormen die P. aeruginosa-mutant 53 (M53) kregen bijvoorbeeld significant minder aggregaten in vergelijking met de wildtypestam (MPAO1) (figuur 7); de bevestiging van de treffer vertoonde echter geen significant verschil (aanvullende figuur 4). Over het algemeen hebben high-throughput drugsscreenings een hoge mate van vals-positieve hitdetectie, en de beschreven methode is geen uitzondering²⁶. Het is dus een cruciaal onderdeel van het protocol om alle potentiële hits te bevestigen.

Hoewel dit protocol is geoptimaliseerd om te passen in een screeningstrategie om bacteriën te identificeren die de proteostase van de gastheer beïnvloeden, kan elke stap verder worden gewijzigd om het effect van genomische RNAi-bibliotheken, kleine moleculen of andere aandoeningen te testen. Bij elke stap kunnen aanvullende wijzigingen worden aangebracht om aan de vereisten van een specifieke screeningstrategie te voldoen. Bovendien biedt deze techniek een niveau van flexibiliteit dat de optimalisatie van elke stap mogelijk maakt om bij een specifiek model te passen. Deze benadering kan bijvoorbeeld worden uitgebreid tot polyQ-aggregatie in andere weefsels of het extraheren van andere kenmerken die in afbeeldingen worden gedetecteerd, zoals het monitoren van genexpressie met behulp van induceerbare fluorescerende reporters (bijv. Hitteschokgenen), het beoordelen van subcellulaire lokalisatie van eiwitten (bijv. Nucleaire lokalisatie van DAF-16), het bestuderen van aggregatie in andere ziektemodellen (Aβ_1-42, α-synucleïne, TDP-43, enz.) of het beoordelen van fysiologische fenotypen, zoals wormgrootte.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.7 mL Microtubes	Olympus Plastics	Cat#24-282	Microcentrifuge tubes
10 mL Serological Pipettes	GenClone	Cat#12-104	Plastic pipettes
15 mL Centrifuge Tubes, Racked	Olympus Plastics	Cat#28-101	Conical tubes
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Fisher Scientific	D2235100MG	FUDR
Accu-jet Pro Pipette Controller	Genesee Scientific	91-600RB	Pipette gun
Agar	Fisher Scientific	Cat#BP1423-2	Granulated agar
BioRender	BioRender		Graphical figure generator
Bleach (Regular)	Clorox	Bar# 044600324111, Splash-less Bleach	4.5% sodium hypochlorite
C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp]	Morimoto Lab (Northwestern University)	AM140, Q35::YFP	Muscle polyQ
C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)]	Morimoto Lab (Northwestern University)	AM738, Q44::YFP	Intestinal polyQ
CaCl2·2H2O	Fisher Scientific	Cat#C79-500	Calcium chloride dihydrate
CellProfiler	Broad Institute		Image analysis software
Cholesterol	Fisher Scientific	Cat#ICN10138201	Cholesterol
Circulating Water Bath Head	Lauda	26LE	Lauda E 100
CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO	CoolLED	8114931	Fluorescent light control and emitter
16 mL Culture Tubes	Olympus Plastics	21-129	Culture tubes, 17 mm x 100 mm
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center	OP50	E. coli control strain
Ethanol, 200 Proof	Decon Labs, Inc.	2701
Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen	Leica Microsystems	10450910	Eyepiece set
Filter Set ET GFP - MZ10F	Leica Microsystems	10450588	Filter cube
GraphPad Prism v9.2.0	GraphPad Software, Inc.		Statistical analysis tool
Heratherm Incubator IMP180	Thermo	51031562	Refrigerated incubator
Innova 4000	New Brunswick Scientific	M1192-0000	Shaking incubator
K5 Camera	Leica Microsystems	11547112	Stereomicroscope camera
KH2PO4	Fisher Scientific	Cat#P285-3	Potassium phosphate monobasic
LAS X Imaging Software	Leica Microsystems		Microscope imaging software
Leica MZ10 F Optics Carrier	Leica Microsystems	10450103	Stereomicroscope
Levamisole	Fisher Scientific	Cat#0215522805	Levamisole hydrochloride
Luria Broth (Lennox)	Apex Bioresearch Products	Cat#11-125	LB
Magnetic Stir Plate	Fisher Scientific	11-100-49S	Stir plate
MgSO4·7H2O	Alfa Aesar	A14491	Magnesium sulfate heptahydrate
Microscope Slides	Premiere	8205	Single frosted microscope slides
Na2HPO4·7H2O	Fisher Scientific	Cat#S373-500	Sodium phosphate dibasic heptahydrate
NaCl	Fisher Scientific	Cat#S671-500	Sodium chloride
NaOH	Fisher Scientific	Cat#S318-3	Sodium hydroxide pellets
Objective Achromat, f = 100 mm	Leica Microsystems	10411597	Objective microscope lens
Petri Dishes	Genesee Scientific	Cat#32-107G	100 mm x 15 mm
Pseudomonas aeruginosa Mutant Library	Manoil Lab (University of Washington)		P. aeruginosa mutant library
Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom	Olympus Plastics	25-102	Used for worm growth and imaging
Trinocular Tube 100% M-series	Leica Microsystems	10450043
Trypticase Peptone	ThermoFisher, Difco	Cat#211921
TX-400 Rotor	Thermo Scientific	Cat#75003181	Swing bucket rotor
Vacuum Driven Filter System	GenClone	Cat#25-227	500 mL, PES Membrane,.22 µm
Video Objective with C-Mount	Leica Microsystems	10447367	0.63x camera adapter tube