Dit neurale celdissociatieprotocol is bedoeld voor monsters met een lage hoeveelheid uitgangsmateriaal en levert een zeer levensvatbare eencellige suspensie op voor downstream-analyse, met optionele fixatie- en kleuringsstappen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gecombineerde mechanische en enzymatische dissociatie van hippocampusweefsel van muizenhersenen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit neurale dissociatieprotocol (een aanpassing van het protocol bij een commerciële hersendissociatiekit voor volwassenen) optimaliseert weefselverwerking ter voorbereiding op gedetailleerde downstream-analyse zoals flowcytometrie of eencellige sequencing. Neurale dissociatie kan worden uitgevoerd via mechanische dissociatie (zoals het gebruik van filters, haktechnieken of pipettrituratie), enzymatische spijsvertering of een combinatie daarvan. De delicate aard van neuronale cellen kan de inspanningen bemoeilijken om de zeer levensvatbare, echte eencellige suspensie te verkrijgen met minimaal cellulair puin dat nodig is voor eencellige analyse. De gegevens tonen aan dat deze combinatie van geautomatiseerde mechanische dissociatie en enzymatische spijsvertering consequent een zeer levensvatbare (>90%) eencellige suspensie oplevert, waarmee de bovengenoemde problemen worden overwonnen. Hoewel een paar van de stappen handmatige behendigheid vereisen, verminderen deze stappen de verwerking van monsters en mogelijk celverlies. Dit manuscript beschrijft elke stap van het proces om andere laboratoria uit te rusten om met succes kleine hoeveelheden neuraal weefsel te dissociëren ter voorbereiding op downstream-analyse.
Inleiding
De hippocampus werd voor het eerst beschreven door een Bolognese anatoom, Giulio Cesare Aranzio, in de jaren 15001. Bij het benoemen van deze nieuw ontdekte structuur werd Aranzio waarschijnlijk geïnspireerd door de griezelige gelijkenis met het zeepaardje van het geslacht Hippocampus1. De hippocampus is betrokken bij stressreacties, maar staat algemeen bekend om zijn rol in leren en geheugen. Meer specifiek is de hippocampus verantwoordelijk voor het coderen en ophalen van declaratief en ruimtelijk geheugen1.
De hippocampus, of eigenlijke hippocampus, is verde....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van UAMS. 6 maanden oude vrouwelijke C57Bl6 / J wild-type muizen werden gekocht en gehuisvest (4 muizen per kooi) onder een constante 12 uur licht / donker cyclus.
1. Bereiding van reagentia
- Bereid een oplosbare oplossing voor levende/dode vlekken. Reconstitueer de fluorescerende vlek met 20 μL dimethylsulfoxide (DMSO).
- Wikkel de injectieflacon in folie, label deze als "Reconstituted" en bewaar deze bij -20 °C gedurende maximaal zes maanden.
- Bereid een 0,9% zoutoploss....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Monsters werden verwerkt met een flowcytometer in een kernfaciliteit en de resulterende gegevens werden geëvalueerd met een softwarepakket voor stroomanalyse. Voorheen werden compensatiecontroles geanalyseerd - de levende / dode vlek en negatieve controle. Als meerdere fluorochchromen worden gebruikt, moeten fluorescentie minus één (FMO) controles en single-stain controles worden voorbereid voor elk antilichaam. Compensatie voor spectrale overlap voor de experimentele monsters werd berekend op basis van de geanalyseerde .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Verschillende stappen in dit neurale dissociatieprotocol vereisen bekwame techniek en behendigheid - perfusie, supernatantaspiratie en myelineverwijdering. Tijdens het perfusieproces moeten de inwendige organen intact blijven (afgezien van het verwijderen van het diafragma en het knippen van het hart); dit omvat het vermijden van de bovenste kamers van het hart met de vlindernaald. Hoewel de hoeveelheid zoutoplossing met heparine die nodig is varieert, geeft transparante vloeistof die uit het hart stroomt aan dat het pro.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We bedanken Aimee Rogers voor het bieden van hands-on training en voortdurende productondersteuning. We bedanken Dr. Amanda Burke voor het voortdurend oplossen van problemen en het verduidelijken van discussies. We bedanken Meredith Joheim en de UAMS Science Communication Group voor de grammaticale redactie en opmaak van dit manuscript. Deze studie werd ondersteund door NIH R25GM083247 en NIH 1R01CA258673 (A.R.A).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02-682-003 | Basix, assorted color |
| 15 mL Falcon Tubes | Becton Dickinson Labware Europe | 352009 | Polystyrene |
| 25 mL Serological Pipets | Fisher Scientific | 14-955-235 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube | Falcon | 352052 | |
| 500 mL Vacuum Filter/ Storage Bottle System | Corning | 431097 | |
| 70 μm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Adult Brain Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | Contains Enzyme P, Buffer Z, Buffer Y, Enzyme A, Buffer A, Debris Removal Solution |
| Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-105 | |
| Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mouse, clone REA969 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti-Myelin Basic Protein | Sigma-Aldrich | M3821-100UG | |
| Anti-PSA-NCAM-PE, human, mouse and rat, Clone 2-2B | Miltenyi Biotec | 130-117-394 | |
| BD LSRFortessa | BD | ||
| BSA | Sigma-Aldrich | A7906-50G | |
| CD11b-VioBlue, mouse, Clone REA592 | Miltenyi Biotec | 130-113-810 | |
| CD31 Antibody | Miltenyi Biotec | 130-111-541 | |
| Ceramic Hot Plate Stirrer | Fisher Scientific | 11-100-100SH | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Ethanol | Pharmco by Greenfield Global | 111000200 | |
| Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | Perfusion |
| FlowJo | BD | (v10.7.0) | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Gibco DPBS (1X) | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| Glass Beaker | Fisher Scientific | 02-555-25A | |
| Heparin sodium | Fresenius Kabi | 504011 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34965 | |
| Magnetic Stir Bar | Fisher Scientific | 14-513-51 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Dissection |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244-3KG | Prilled, 95% |
| Pipette tips GP LTS 20 µL 960A/10 | Rainin | 30389270 | |
| Pipette Tips GP LTS 250 µL 960A/10 | Rainin | 30389277 | |
| Pipette tips RT LTS 1000 µL FL 768A/8 | Rainin | 30389213 | |
| Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 μL) | Rainin | 30386597 | |
| RBXMO FITC XADS | Fisher Scientific | A16167 | |
| Round Ice Bucket with Lid | Fisher Scientific | 07-210-129 | |
| Round-Bottom Tubes with Cell Strainer Cap | Falcon | 100-0087 | |
| S1 Pipet Fillers | ThermoFisher Scientific | 9541 | |
| Spatula & Probe | Fine Science Tools | 10090-13 | Dissection & Perfusion |
| Surflo Winged Infusion Set 23 G x 3/4" | Termuno | SV-23BLK | Butterfly needle |
| Test Tube Rack | Fisher Scientific | 14-809-37 | |
| Thermo Scientific Legend XTR Centrifuge | ThermoFisher | discontinued | Or other standard table top centrifuge |
| Variable-Flow Peristaltic Pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | Low-flow model |
| VetFlo Starter Kit for Mice | Kent Scientific | VetFlo-MSEKIT | Anesthesia mask, tubing, induction chamber, charcoal canisters |
| VetFlo Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | 0.2–4 LPM |
| Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer | Beckman Coulter Life Sciences | 731196 | Cell Counting |
| Vi-CELL XR 4 Bags of Sample Vials | Beckman Coulter Life Sciences | 383721 | Cell Counting |
Referenties
- Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. The Hippocampus Book. , Oxford University Press, Inc. (2007).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice. Proceedings of the National Academy of Sciences ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
