Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies

Summary

Lipide monolagen worden al tientallen jaren gebruikt als basis voor het vormen van tweedimensionale (2D) eiwitkristallen voor structurele studies. Ze zijn stabiel op het lucht-water interface en kunnen dienen als een dun ondersteunend materiaal voor elektronenbeeldvorming. Hier presenteren we de bewezen stappen voor het voorbereiden van lipide monolagen voor biologische studies.

Abstract

Elektronenkristallografie is een krachtig hulpmiddel voor het bepalen van structuren met hoge resolutie. Macromoleculen zoals oplosbare of membraaneiwitten kunnen onder gunstige omstandigheden worden gekweekt tot zeer geordende tweedimensionale (2D) kristallen. De kwaliteit van de gekweekte 2D kristallen is cruciaal voor de resolutie van de uiteindelijke reconstructie via 2D beeldverwerking. In de loop der jaren zijn lipide monolagen gebruikt als een ondersteunende laag om de 2D-kristallisatie van perifere membraaneiwitten en oplosbare eiwitten te bevorderen. Deze methode kan ook worden toegepast op 2D-kristallisatie van integrale membraaneiwitten, maar vereist uitgebreider empirisch onderzoek om detergent- en dialyseomstandigheden te bepalen om partitionering naar de monolaag te bevorderen. Een lipide monolaag vormt zich op het lucht-water interface zodanig dat de polaire lipidekopgroepen gehydrateerd blijven in de waterige fase en de niet-polaire, acylketens, staarten zich in de lucht afscheiden, waardoor de oppervlaktespanning wordt verbroken en het wateroppervlak wordt afgevlakt. De geladen aard of onderscheidende chemische eigenschappen van de kopgroepen bieden affiniteit voor eiwitten in oplossing, waardoor binding voor 2D-arrayvorming wordt bevorderd. Een nieuw gevormde monolaag met de 2D-array kan gemakkelijk worden overgedragen in een elektronenmicroscoop (EM) op een met koolstof gecoat koperen raster dat wordt gebruikt om de kristallijne array op te tillen en te ondersteunen. In dit werk beschrijven we een lipide monolaag methodologie voor cryogene elektronen microscopische (cryo-EM) beeldvorming.

Introduction

Elektronendiffractie door 2D-kristallen of spiraalvormige arrays van eiwitten kan sub-nanometerresoluties bereiken in gunstige gevallen^1,2,3. Van bijzonder belang zijn gereconstitueerde 2D-membraaneiwitarrays of kristallen in hun near-native omgevingen¹. Omdat een kristal fungeert als een signaalversterker die de intensiteit van de structurele factoren bij specifieke ruimtelijke frequenties verbetert, maakt elektronenkristallografie het mogelijk om een doelwit te onderzoeken met een kleinere grootte bij hoge resoluties, zoals kleine moleculen, dan die voor cryo-EM met één deeltje. De elektronenbundel kan worden gediffracteerd door een geordende 2D-array van eiwitten, waardoor een diffractiepatroon of een roosterbeeld wordt gegenereerd, afhankelijk van waar het beeldvlak wordt geregistreerd op de detector⁴. De diffracted intensiteiten kunnen vervolgens worden geëxtraheerd en verwerkt om een 2D-projectiestructuur van het kristal te reconstrueren. Elektronen hebben een grotere verstrooiingsdoorsnede dan röntgenstralen en de verstrooiing ervan volgt meestal het Rutherford-model op basis van de Coulomb-interactie tussen de elektronen en de geladen atomen in het molecuul⁵. De diktes van 2D-membraankristallen zijn meestal minder dan 100 nm, geschikt voor elektronenoverdracht zonder dynamische verstrooiing binnen monster⁶. Van elektronkristallografische studies is aangetoond dat het een krachtig hulpmiddel is om structurele informatie met hoge resolutie van membraaneiwitten en lipide-eiwitinteracties^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}te onderzoeken.

Een lipide monolaag is een enkele lipidelaag die bestaat uit fosfolipiden die dicht opeengepakt zijn op een lucht-waterinterface⁶, die de vorming van 2D-arrays voor oplosbare eiwitten of perifere membraaneiwitten kan helpen¹⁸. Afhankelijk van de dichtheid van de lipiden en hun laterale druk, kunnen de lipidemoleculen een geordende 2D-array vormen op de lucht-waterinterface met hun acylketens uitgebreid naar de lucht en hydrofiele hoofdgroepen blootgesteld in de waterige oplossing^1,6,19. De lipidehoofdgroep kan interageren met eiwitten via elektrostatische interactie of kan worden aangepast om een affiniteitstag te bieden om een specifiek eiwitdomein te binden. Bijvoorbeeld, de DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]^2- Ni²⁺) wordt vaak gebruikt bij het vormen van een lipide monolaag om de eiwitten te binden met een poly-histidine tag^20,21,22. Ook kan het choleratoxine B een bepaalde pentasaccharide van ganglioside GM1 binden in een lipide monolaag voor structurele studies^23,24. Door de eiwitten op de lipidehoofdgroepen te verankeren, kan de lipide monolaag helpen bij de vorming van de 2D-arrays die dun zijn voor elektronenkristallografische studies met hoge resolutie. De lipide monolayer techniek is gebruikt in de elektronenkristallografie voor structurele studies van eiwitten, zoals streptavidin^2,25,annexine V^26,cholera toxine^27, E. coli gyrase B subunit²⁸, E. coli RNA polymerase 25^,29,30, carboxysome shell proteins³¹ en de capsid eiwitten van het HIV-1³² en Moloney murine leukemie virus ³³. Vanwege de stabiliteit en chemische eigenschap van de lipide monolaag, zijn verschillende toepassingen voor monstervoorbereiding onderzocht voor cryo-EM-beeldvorming³⁴. Optimalisatie zal echter nodig zijn voor de vorming van eiwitarrays.

Hier geven we uitgebreide details over de algemene voorbereiding van lipide monolagen voor cryo-EM beeldvorming en enkele overwegingen die de kwaliteit van de gevormde monolagen kunnen beïnvloeden.

Protocol

1. Voorbereiding van het teflonblok

1. Bereid het teflonblok voor uit chemisch resistente PTFE-hars (polytetrafluorethyleen). Maak gaten in het blok met behulp van een algemene boor gevolgd door de afmetingen die zijn gelabeld in figuur 1.

2. Monolaags lipidepreparaat

OPMERKING: Geschatte bedrijfstijd: 30- 45 minuten

1. Lipidenvoorraad voorbereiding
   1. Bereid een lipidenmengsel van 0,01 mg / ml in 9:1 (v / v) chloroform / methanol met behulp van 8,91 ml chloroform, 0,99 ml methanol en 0,01 ml 10 mg / ml lipiden.
2. Teflon plaat voorbereiding
   1. Soniceer een teflonplaat in een methanolbad gedurende 5 minuten.
   2. Wassen met heet water gedurende 15 minuten.
   3. Afspoelen met gedestilleerd water.
   4. Droog de teflonplaat gedurende 30 minuten in eensiccator en houd deze onder vacuüm wanneer deze niet in gebruik is(figuur 1).

3. Vorming van lipide monolaag op bufferreservoir

OPMERKING: Geschatte bedrijfstijd: 1,5 uur

1. Bereid op de dag van het experiment een lipidenmengsel van 0,01 mg/ml in een 9:1 mengsel van chloroform/methanol.
2. Plaats een Type-1 filterpapier in een petrischaaltje en schik het teflonblok bovenop het filterpapier.
3. Vul de putjes van de teflonplaat met 60 μL van de buffer.
4. Voeg voorzichtig druppelsgeer voor druppel (idealiter 1 μL per druppel) een lipidenmengsel toe aan het bufferoppervlak met behulp van een Hamilton-spuit.
5. Maak het filtreerpapier nat met gedestilleerd water om de vochtigheid in de petrischaal te houden.
6. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten. Het chloroform moet verdampen en er moet een monolaag lipide op het oppervlak van de buffer worden gevormd.

4. Toepassing van een EM-raster op een lipide monolaag

OPMERKING: Geschatte bedrijfstijd: 1,5 uur

1. Plaats voorzichtig een gatachtig koolstofgecoat EM-rooster zonder gloeiende ontlading, koolstofzijde naar beneden, op de bovenkant van elk bufferreservoir.
2. Injecteer voorzichtig eiwitten in de zijinjectieput. Gebruik de uiteindelijke eiwitconcentraties in de put rond 1 μM eiwit als uitgangspunt. Optimaliseer de eiwitconcentratie vooraf voor het experiment.
3. Incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
4. Injecteer voorzichtig ongeveer 20-30 μL buffer in de injectiepoort aan de zijkant. Hierdoor wordt het raster boven het oppervlak van het teflonblok opgetild.
5. Pak het rooster meteen op met een pincet en til het verticaal van de druppel.
6. Monolaagmonsters voorbereiden op negatieve kleuring of cryo-TEM-beeldvorming(figuur 2). Als de eiwitten een 2D-array vormen, zal het beeldvermogensspectrum of fourier-periodogram diffractie-intensiteiten vertonen op de ruimtelijke frequenties op basis van de kristalsymmetrie. Als er geen diffractievlekken worden getoond in het vermogensspectrum, is het onwaarschijnlijk dat de eiwitten een 2D-kristal vormen.
7. Controleer de dekking van de lipide monolaag op het EM-net met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM). Een lager vergroot elektronenbeeld is nuttig om de morfologie van de bedekte monolaag te identificeren. Meestal zal het beeldcontrast van het met monolaag bedekte gebied iets lager zijn dan dat van de onbedekte gebieden. Bovendien zal het berekende 2D-beeldvermogensspectrum helpen bij het identificeren van de locatie van de 2D-kristallijne.

Results

Een lipide monolaag afgezet op het EM-raster kan worden gevisualiseerd onder een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) zonder kleuring. De monolaagaanwezigheid is te herkennen aan het contrastverschil met het gebied zonder enig monster in het bundelpad. Gebieden met lipide monolaagdekking hebben een lager lokaal contrast dan die zonder dekking, omdat de elektronenbundel door de lege gaten geen verstrooiing heeft en een helderdere verlichting vertoont(figuur 3).

O...

Discussion

Een lipide monolaag is een krachtig hulpmiddel dat de groei van grote 2D-kristallen vergemakkelijkt voor structurele studies van biologische macromoleculen. Om met succes een intacte lipide monolaag op het lucht-water interface te bereiden, wordt het sterk aanbevolen dat de lipiden vers worden bereid op de dag van het experiment, omdat oxidatie van de lipide acylketen kan leiden tot verstoring van de verpakking in de monolaag en de resulterende kristalvorming nadelig kan beïnvloeden. Gekochte lipiden in poedervorm moeten...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14:0 PC (DMPC)	Avanti Lipids	850345	1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-fosfocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2,5 mL
Bulb voor kleine pipetten	Fisher Scientific	03-448-21
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Drogerkast met vacuüm	Southern Labware	55207
EM roosters	Electron Microscopy Sciences	CF413-50	CF-1.2/1.3-4C 1,2 µm gat, 1,3 µm ruimte
Filterpapier	GE Healthcare Life Sciences	1001-090	Diameter 90 mm
Glazen Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Hamilton-spuit (25 µL)	Hamilton Company	80465
Hamilton-spuit (250 µL)	Hamilton Company	81165
Hamilton-spuit (5 µL)	Hamilton Company	87930
Hamilton-spuit (500 µL)	Hamilton Company	203080
Methanol	Sigma-Aldrich	M1775-1GA
Petrischaal	VWR	25384-342	100 mm × 15 mm
Teflon-blok	Grainger	55UK05	60 µL putjes met zijinjectiepoorten, handmatig gemaakt
Pincet	Electron Microscopy Sciences	78325	Verschillende stijlen
Ultrazuiver water
Ultrasone reiniger	VWR	97043-996