Methodenartikel

Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator

DOI:

10.3791/63045

⸱

24 september 2021

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 3Department of Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, Ann Arbor, 4Rogel Cancer Center, University of Michigan, Ann Arbor, 5Institute of Gerontology, University of Michigan, Ann Arbor

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier gepresenteerde methode vat geoptimaliseerde protocollen samen voor het beoordelen van cellulaire bio-energetica in niet-adherente muishematopoietische stam en primitieve voorlopercellen (HSPC's) met behulp van de extracellulaire fluxanalysator om de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR) van HSPC's in realtime te meten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onder steady state blijven hematopoëtische stamcellen (HSC's) grotendeels rustig en wordt aangenomen dat ze voornamelijk afhankelijk zijn van glycolyse om aan hun energetische behoeften te voldoen. Onder stressomstandigheden zoals infectie of bloedverlies worden HSC's echter proliferatief en produceren ze snel stroomafwaartse voorlopercellen, die op hun beurt verder differentiëren en uiteindelijk volwassen bloedcellen produceren. Tijdens dit overgangs- en differentiatieproces verlaten HSC's rust en ondergaan ze snel een metabole omschakeling van glycolyse naar oxidatieve fosforylering (OxPHOS). Verschillende stressomstandigheden, zoals veroudering, kanker, diabetes en obesitas, kunnen de mitochondriale functie negatief beïnvloeden en kunnen dus de metabole herprogrammering en differentiatie van HSC's en voorlopercellen tijdens hematopoëse veranderen. Waardevolle inzichten in glycolytische en mitochondriale functies van HSC's en voorlopercellen onder normale en stressomstandigheden kunnen worden verkregen door de beoordeling van hun extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR), die indicatoren zijn van respectievelijk cellulaire glycolyse en mitochondriale ademhaling.

Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt om ECAR en OCR te meten in van het beenmerg afgeleide afstammingsnegatieve celpopulaties van muizen, die zowel hematopoëtische stam als primitieve voorlopercellen (HSPC's) omvatten, met behulp van de extracellulaire fluxanalysator. Dit protocol beschrijft benaderingen voor het isoleren van afstammingsneg-negatieve cellen uit het beenmerg van muizen, verklaart optimalisatie van celzaaidichtheid en concentraties van 2-deoxy-D-glucose (2-DG, een glucose-analoog dat glycolyse remt) en verschillende OxPHOS-gerichte geneesmiddelen (oligomycine, FCCP, rotenon en antimycine A) die in deze testen worden gebruikt, en beschrijft behandelingsstrategieën voor geneesmiddelen. Belangrijke parameters van glycolytische flux, zoals glycolyse, glycolytische capaciteit en glycolytische reserve, en OxPHOS-parameters, zoals basale ademhaling, maximale ademhaling, protonlek, ATP-productie, reserve ademhalingscapaciteit en koppelingsefficiëntie, kunnen in deze testen worden gemeten. Dit protocol maakt ECAR- en OCR-metingen op niet-adherente HSPC's mogelijk en kan worden gegeneraliseerd om de analyseomstandigheden voor elk type suspensiecellen te optimaliseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoiese is het proces waarbij verschillende soorten volwassen bloedcellen met zeer gespecialiseerde functies worden gevormd uit HSC's1. HSC's zijn in staat tot zelfvernieuwing en differentiatie in verschillende multipotente en afstammingsspecifieke voorloperpopulaties. Deze voorlopers produceren uiteindelijk cellen van lymfoïde, myeloïde, erytroïde en megakaryocytenlijnen. Om hun zelfvernieuwingscapaciteit te behouden, blijven HSC's grotendeels rustig en wordt aangenomen dat ze, net als andere weefselstamcellen, afhankelijk zijn van glycolyse in plaats van mitochondriaal OxPHOS voor ATP-productie 2,3. Toegang tot de celcyclus leidt tot verbeterde ademhaling en OxPHOS, wat resulteert in verhoogde niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS), die schadelijk zijn voor HSC-onderhoud en -functie3. Herhaalde celdeling kan dus leiden tot een verminderd zelfvernieuwend vermogen van HSC's en uiteindelijk tot uitputting ervan.

Bij volwassen hematopoiese ondergaan HSC's voornamelijk asymmetrische celdeling, waarbij een van de dochtercellen HSC-potentieel behoudt en blijft vertrouwen op glycolytisch metabolisme. De andere dochtercel wordt een primitieve voorlopercel die zelfvernieuwingsvermogen verliest maar zich vermenigvuldigt en uiteindelijk aanleiding geeft tot gedifferentieerde functionele hematopoëtische cellen4. Wanneer HSC's differentiëren om stroomafwaartse voorlopers te produceren, wordt gedacht dat een omschakeling van glycolyse naar mitochondriaal metabolisme plaatsvindt om de energie en bouwstenen te leveren die nodig zijn om deze snelle overgang te ondersteunen5, zoals gesuggereerd door de observaties dat HSC's inactieve mitochondriale massa bezitten 6,7,8,9 . Daarentegen is mitochondriale activiteit (aangegeven door gekoppelde ROS-niveaus) veel hoger in afstammingsgebonden voorlopers dan in HSC's 9,10,11. Metabole veranderingen die optreden tijdens de vroegste stap van hematopoëse suggereren dus een directe en cruciale rol van mitochondriën bij het reguleren van het lot van HSC.

Disfunctionele mitochondriën die aanwezig zijn onder verschillende stressomstandigheden, zoals veroudering, kanker, diabetes en obesitas12, kunnen het zelfvernieuwingsvermogen van HSC verstoren, waardoor een onbalans in HSC / voorloperdifferentiatie wordt veroorzaakt door overmatige hoeveelheden ROS te produceren, de ATP-productie te verminderen en / of door andere metabole processen te veranderen 9,12,13 . Verstoringen in metabole homeostase in HSC/voorloper differentiatie kunnen een significante invloed hebben op de hematopoëse, wat mogelijk bijdraagt aan de ontwikkeling van hematologische afwijkingen13. Gezien de kritische invloeden van glycolyse en mitochondriaal OxPHOS op HSC-stengelheid en differentiatie, is het van belang om zowel metabole parameters onder normale als stressomstandigheden te onderzoeken. Waardevolle inzichten in de glycolytische en mitochondriale functie van HSC's en voorlopercellen kunnen worden verkregen door hun ECAR en OCR te beoordelen, die indicatoren zijn van respectievelijk cellulaire glycolyse en mitochondriale ademhaling.

De Seahorse extracellulaire flux analyzer is een krachtig apparaat uitgerust met twee sondes per put om tegelijkertijd ECAR en OCR in levende cellen te meten en kan dus worden gebruikt om cellulaire bio-energetica in realtime te beoordelen, in reactie op verschillende substraten of remmers. De testcartridge die met de analysator wordt gebruikt, bevat injectiepoorten om maximaal vier geneesmiddelen voor geautomatiseerde injectie tijdens de test te houden. Een schema van een typische glycolyse stresstest is weergegeven in figuur 1A. De test begint met het meten van ECAR van cellen, geïncubeerd in glycolyse stresstestmedium dat glutamine bevat, maar geen glucose of pyruvaat. Dit vertegenwoordigt verzuring die optreedt als gevolg van niet-glycolytische activiteiten van de cellen en wordt gerapporteerd als niet-glycolytische verzuring. Dit wordt gevolgd door de injectie van glucose in een verzadigingsconcentratie. Via glycolyse wordt glucose in de cel omgezet in pyruvaat, dat verder wordt gemetaboliseerd in het cytoplasma om lactaat te produceren, of in mitochondriën om CO2 en water te produceren.

Omzetting van glucose in lactaat veroorzaakt nettoproductie en daaropvolgende afgifte van protonen in het extracellulaire medium, wat resulteert in een snelle toename van de ECAR 14,15,16. Deze glucose-gestimuleerde verandering in ECAR wordt gerapporteerd als glycolyse onder basale omstandigheden. De tweede injectie bestaat uit oligomycine (een remmer van ATP-synthase, ook bekend als complex V17), dat de mitochondriale ATP-productie remt. Tijdens oligomycine-gemedieerde OxPHOS-remming upreguleren cellen de glycolyse maximaal om aan hun energetische eisen te voldoen. Dit veroorzaakt een verdere toename van ECAR, waardoor de maximale glycolytische capaciteit van de cellen wordt onthuld. Het verschil tussen de maximale glycolytische capaciteit en basale glycolyse wordt glycolytische reserve genoemd. Ten slotte wordt 2-DG geïnjecteerd, wat een aanzienlijke daling van de ECAR veroorzaakt, meestal dicht bij niet-glycolytische verzuringsniveaus. 2-DG is een glucose-analoog dat concurrerend bindt aan hexokinase, wat resulteert in remming van glycolyse18. De door 2 DG geïnduceerde afname van ECAR bevestigt dus verder dat glycolyse inderdaad de bron is van ECAR waargenomen na glucose- en oligomycine-injecties.

Figuur 1B toont het schema voor een typische mitochondriale stresstest. De test begint met baseline OCR-meting van de cellen, geïncubeerd in mitochondriaal stresstestmedium dat glucose, glutamine en pyruvaat bevat. Na basale OCR-metingen wordt oligomycine geïnjecteerd in deze test, die complexe V remt, waardoor de elektronenstroom door de elektronentransportketen (ETC)17 wordt verminderd. Bijgevolg wordt OCR verminderd als reactie op oligomycine-injectie en deze afname van OCR is gekoppeld aan mitochondriale ATP-productie. De tweede injectie bestaat uit carbonylcyanide-4 (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP), een protonofoor en een ontkoppelaar van mitochondriaal OxPHOS17. FCCP stort de mitochondriale protongradiënt in door de stroom van protonen over het mitochondriale binnenmembraan mogelijk te maken. Door de FCCP-injectie wordt de elektronenstroom door de ETC onderdrukt en verbruikt complex IV zuurstof op het maximale niveau. Het verschil tussen maximale OCR en basale OCR wordt de reserve ademhalingscapaciteit genoemd, wat een maat is voor het vermogen van de cel om te reageren op een verhoogde energievraag onder stressomstandigheden. Ten slotte wordt een mengsel van twee ETC-remmers (rotenon, een complex I-remmer en antimycine A, een complexeIII-remmer 17) geïnjecteerd, waardoor de elektronenstroom volledig wordt afgesloten en OCR tot een laag niveau afneemt. OCR gemeten na rotenon en antimycine A-injectie komt overeen met niet-mitochondriale OCR aangedreven door andere processen in de cellen. Niet-mitochondriale OCR maakt de berekening van basale ademhaling, protonenlekkage en maximale ademhaling mogelijk.

Basale ademhaling vertegenwoordigt het verschil tussen baseline OCR en niet-mitochondriale OCR. Protonlek verwijst naar het verschil tussen OCR na oligomycine-injectie en niet-mitochondriale OCR. Maximale ademhaling vertegenwoordigt het verschil tussen OCR na FCCP-injectie en niet-mitochondriale OCR. De koppelingsefficiëntie wordt berekend als het percentage atp-productiesnelheid ten opzichte van de basale ademhalingsfrequentie. Dit method paper biedt een gedetailleerd protocol voor het meten van ECAR en OCR in afstammingsnegatieve HSPC's met behulp van de Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyzer. Dit protocol beschrijft benaderingen voor het isoleren van muizenlijnnegatieve HSPC's, verklaart de optimalisatie van celzaaidichtheid en concentraties van verschillende geneesmiddelen die worden gebruikt in extracellulaire fluxtests en beschrijft strategieën voor medicamenteuze behandeling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven met gewervelde dieren werden goedgekeurd door en uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften van het University of Michigan Committee on Use and Care of Animals.

1. Dag voor de test (Totale tijd: ~ 10 min)

  1. Hydratatie van de sensorcartridge (staptijd: ~ 10 min)
    1. Open de extracellulaire fluxtestkit en verwijder de sensorcartridge en de gebruiksplaat. Sla laadgidsen op voor gebruik de volgende dag.
    2. Scheid de sensorcartridge (het bovenste groene deel met deksel) handmatig van de gebruiksplaat (onderste 96-well microplaat) en plaats deze ondersteboven naast de utility-plaat.
    3. Vul met behulp van een meerkanaalspipet elke put van de nutsplaat met 200 μL kalibrant, meegeleverd met fluxtestkit.
    4. Plaats de sensorcartridge terug op de gebruiksplaat en zorg ervoor dat u de sensoren volledig onderdompelt in het kalibrant.
    5. Plaats de geassembleerde sensorcartridge en de gebruiksplaat met kalibrant een nacht in een niet-CO2 incubator van 37 °C. Om verdamping van het kalibrant te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de incubator goed wordt bevochtigd. Als u een gewone ovenincubator gebruikt voor incubaties zonder CO2 37 °C, plaatst u een open bekerglas met water in de incubator om het te bevochtigen. Gebruik, indien beschikbaar, een XF-voorbereidingsstation voor alle incubaties van niet-CO2 37 °C.
      OPMERKING: Als alternatief kan de sensorcartridge 's nachts worden gehydrateerd met 200 μL per put steriel ultrapuur water in een niet-CO2 37 °C incubator. Vervang water door 200 μL per put van 37 °C voorverwarmd kalibrant, ten minste 45-60 minuten voordat u de injectiepoorten op de dag van de test laadt.

2. Dag van de test (Totale tijd: ~ 9 h 30 min)

OPMERKING: De hierboven aangegeven totale tijd omvat de cumulatieve duur van stap 2.1-2.4 naast stap 2.5 of stap 2.6.

  1. Voorbereiding van celklevende microplaten (staptijd: ~ 1 h 30 min)
    OPMERKING: Voer alle stappen uit in een bioveiligheidskast.
    1. Bereid 2,5 ml van de cellijmoplossing (22,4 μg/ml, zie de materialentabel) per 96-well celkweekmicroplaat door 56 μg van de cellijm op te lossen in een geschikt volume filtergesteriliseerd 0,1 M natriumbicarbonaat (pH 8,0) en onmiddellijk 1 N natriumhydroxide toe te voegen aan de helft van het volume cellijm. Vortex of pipet op en neer om te mengen.
    2. Open de 96-well celkweekmicroplaat (meegeleverd met de flux assay kit) en doseer 25 μL van de bereide celkleefoplossing op de bodem van elke put. Bedek de microplaat met het deksel en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in de kap.
    3. Verwijder na incubatie overtollige cellijmoplossing en gooi deze weg met behulp van een meerkanaalspipet of aspirator en was elke put tweemaal met 200 μL steriel ultrapuur water. Droog de plaat aan de lucht, met het deksel verwijderd, in de kap gedurende 30-45 minuten.
      OPMERKING: Microplaten met celkleefstofcoating mogen maximaal één week bij 4 °C worden bewaard. Voorgecoate microplaten die bij 4 °C zijn opgeslagen, moeten vóór het zaaien van cellen tot kamertemperatuur in de kap worden verwarmd.
  2. Bereiding van testmedia (staptijd: ~ 30 min)
    1. Bereiding van glycolyse stress test medium
      1. Vul 100 ml basismedium aan (zie de tabel met materialen) met 1 ml L-glutamine van 200 mM.
        OPMERKING: De uiteindelijke L-glutamineconcentratie in het testmedium is 2 mM.
      2. Verwarm het met L-glutamine aangevulde medium tot 37 °C in een waterbad.
      3. Stel de pH van het warme medium in op 7,4 met 1 N NaOH.
      4. Filter-steriliseer het medium met een filter van 0,2 μm en houd het op 37 °C totdat het klaar is voor gebruik.
    2. Bereiding van mitochondriaal stresstesttestmedium
      1. Supplement 100 ml van het basismedium met 0,45 g glucose, 1 ml L-glutamine van 200 ml en 1 ml natriumpyruvaat van 100 mM.
        OPMERKING: Het uiteindelijke testmedium bevat 25 mM glucose, 2 mM L-glutamine en 1 mM natriumpyruvaat.
      2. Warme glucose, L-glutamine en het natriumpyruvaat-aangevuld medium tot 37 °C in een waterbad.
      3. Stel de pH van het warme medium in op 7,4 met 1 N NaOH.
      4. Filter-steriliseer medium met een filter van 0,2 μm en houd op 37 °C totdat het klaar is voor gebruik.
  3. Oogst muislijnnegatieve HSPC's (staptijd: ~ 3 h)
    1. Bereid de testbuffer door de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hank aan te vullen met 4% foetaal runderserum. Bereid 1x verrijkingsbuffer door de 5x bouillon te verdunnen met steriel gedestilleerd water. Houd beide buffers op ijs tot gebruik.
    2. Euthanaseer muizen op humane wijze met behulp van CO2 gevolgd door cervicale dislocatie en verwijder de achterpoten met een schaar. Verwijder voorzichtig alle weefsels van de botten en knip de uiteinden aan beide zijden van het dijbeen en scheenbeen met een schaar. Spoel beenmergcellen uit het dijbeen en scheenbeen met behulp van de testbuffer. Leid de gespoelde cellen door een steriel filter van 70 μm, centrifugeer het filtraat gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 200 × g en gooi het supernatant weg.
    3. Lyseer de rode bloedcellen door de celkorrel opnieuw op te suspenderen in 500 μL ACK-buffer (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2). Na lysis gedurende 1 minuut op ijs, was de monsters door toevoeging van 1 ml testbuffer en centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
    4. Incubeer de monsters na het wassen met een cocktail van gebiotinyleerde antilichamen gericht tegen CD2 (1:200 verdunning), CD3 (1:200 verdunning), CD5 (1:200 verdunning), CD8 (1:200 verdunning), Ter-119 (1:200 verdunning), B220 (1:200 verdunning) en Gr-1 (1:800 verdunning) gedurende 45 minuten op ijs in een totaal volume van 500 μL testbuffer.
    5. Was de monsters met 1 ml testbuffer met centrifugatie zoals hierboven.
    6. Was de monsters met 1 ml 1x verrijkingsbuffer met centrifugatie zoals hierboven.
    7. Incubeer de monsters met 20 μL streptavidin nanokorrels en 100 μL 1x verrijkingsbuffer op ijs gedurende 15 minuten.
    8. Was de monsters met 1 ml 1x verrijkingsbuffer met centrifugatie zoals hierboven.
    9. Resuspend de monsters in 2,5 ml 1x verrijkingsbuffer. Plaats ze gedurende 5 minuten op een scheidingsmagneet. Verzamel de supernatanten afzonderlijk in conische buizen van 15 ml.
    10. Resuspend magneetgescheiden monsters in een extra 2,5 ml 1x verrijkingsbuffer en plaats ze opnieuw op de scheidingsmagneet gedurende 5 minuten. Verzamel en combineer supernatanten van de eerdere collecties in conische buizen van 15 ml uit stap 2.3.9.
      OPMERKING: De supernatanten bevatten de afstammingsnegatieve celfracties.
    11. Centrifugeer de conische buizen van 15 ml die de negatief geselecteerde cellen bevatten gedurende 5 minuten bij 200 × g bij 4 °C.
    12. Resuspend de celkorrels in 1 ml testbuffer en tel het celnummer met trypan blue handmatig of via een geautomatiseerde celteller zoals een Gravin 3.
      OPMERKING: Volgens de hierboven beschreven benadering moeten ~ 6 × 106 afstammingsnegatieve HSPC's gemakkelijk worden gezuiverd uit de achterpoten van een enkele muis. Als reagentia, zoals assaybuffer, 1x verrijkingsbuffer en afstammingsspecifieke antilichaamcocktail, worden bereid op de dag voorafgaand aan het experiment, duurt het ongeveer 2,5-3 uur om HSPC's van 4 muizen te verrijken. Het zou nog eens 10 minuten duren voor elke muis voorbij dit aantal.
  4. Zaaicellen in microplaten met cellijmcoating (staptijd: ~ 1 uur)
    1. Centrifugeer cellen uit stap 2.3.12 bij 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel in het juiste testmedium (glycolysestresstestmedium of mitochondriaal stresstestmedium). Centrifugeer bij 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Herhaal stap 2.4.2. Verwijder het supernatant en resuspend de cellen in het geschikte verwarmde testmedium tot een concentratie van 2,5 × 105 cellen per 50 μL of 5 × 106 per ml.
    4. Pipetteer 50 μL van de celsuspensie langs de zijkant van elke put van de kamertemperatuur cel-met kleefstof gecoate 96-well celkweek microplaat. Pipetteer 50 μL van het testmedium in de hoekachtergrondmeetputten. Gebruik een meerkanaalspipet voor celbeplating om consistentie te garanderen.
    5. Maak een centrifugebalansplaat door 50 μL water per put van een niet-gecoate 96-well celkweekmicroplaat toe te voegen.
    6. Centrifugeer de cellen in de plaat bij 200 × g gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Rem niet. Breng de plaat gedurende 25-30 minuten over naar een niet-CO 2 incubator van 37 °C om ervoor te zorgen dat de cellen volledig zijn bevestigd. Bevestig visueel onder een microscoop dat de cellen stabiel aan het microplaatoppervlak zijn gehecht.
      OPMERKING: Aangezien ~ 6 × 106 afstammingsnegatieve HSPC's kunnen worden geoogst uit de achterpoten van een enkele muis, zijn HSPC's geïsoleerd uit 4 muizen (~ 2,4 × 107 cellen) nodig om een volledige 96-well plaat te vullen als het doel is om meerdere interventies ex vivo parallel te screenen. Als het doel echter is om de impact van een genetische verandering of een interventie op de metabole parameters van HSPC's in vivo te onderzoeken, dan kunnen HSPC's geïsoleerd uit meerdere paren controle- en testmuizen parallel worden geanalyseerd in meerdere technische replicaties met behulp van een enkele plaat.
  5. Uitvoeren van glycolyse stress test met behulp van de extracellulaire flux analyzer (Stap tijd: ~ 3 h 30 min)
    1. Sensorcartridge met injecteerverbindingen laden
      1. Bereid 100 mM glucose, 20 μM oligomycine en 500 mM 2-DG oplossingen in voorgewarmde glycolyse stress test medium (pH 7,4).
        OPMERKING: Alle injecterende samengestelde oplossingen worden gemaakt met een concentratie van 10x. De uiteindelijke putconcentraties zijn 10 mM voor glucose, 2 μM voor oligomycine en 50 mM voor 2-DG (zie tabel 1).
      2. Verwijder de gehydrateerde sensorcartridge uit de niet-CO2 incubator van 37 °C uit stap 1.1.5. Verwijder luchtbellen uit het kalibrant in de gebruiksplaat door de sensorcartridge uit het kalibrant te tillen en op dezelfde gebruiksplaat te vervangen door de kalibrant.
      3. Plaats de A/D-laadgeleider plat (meegeleverd in de extracellulaire fluxtestkit) op de bovenkant van de sensorcartridge en oriënteer deze zo dat de letter 'A' zich in de linkerbovenhoek bevindt om ervoor te zorgen dat alleen poort A beschikbaar is om te laden. Doseer met behulp van een meerkanaalspipet 20 μL 100 mM glucose-oplossing in poort A.
      4. Vervang de A/D-laadgeleider plat door de B/C-laadgeleider plat, zodat de letter 'B' zich in de linkerbovenhoek bevindt om ervoor te zorgen dat alleen poort B beschikbaar is om te laden. Doseer met behulp van een meerkanaalspipet 22 μL 20 μM oligomycine-oplossing in poort B.
      5. Heroriënteer de B/C-laadgeleider plat om de letter 'C' in de linkerbovenhoek te vinden voor laadpoorten C. Doseer met behulp van een meerkanaals pipet 25 μL van 500 mM 2-DG-oplossing in poort C.
      6. Verwijder de laadgeleiderflats en gooi ze weg.
        OPMERKING: Het is belangrijk dat elke poortreeks van alle 96 putten, inclusief die van de achtergrondputten, volledig wordt geladen met hetzelfde volume van de injecterende verbinding.
    2. Sjablonen maken, kalibreren en meten
      1. Maak of laad de sjabloon voor de glycolyse-stresstest op de controller. Voer details in over injectiestrategieën, behandelingsomstandigheden en celtypen en druk op groepen genereren. Ga naar de plaatkaart en wijs putten toe aan elke groep die moet worden geanalyseerd. Wijs de 4 hoekputten toe voor achtergrondmetingen.
      2. Controleer in het protocol of kalibratie en evenwicht zijn gecontroleerd in de initialisatiestap .
      3. Voor nulmeting en metingen na elke injectie (glucose, oligomycine en 2-DG), stelt u het aantal meetcycli in op 3 en Mix - Wait - Meettijden op 3 min - 0 min - 3 min (zie tabel 2).
      4. Verwijder het deksel van de met verbindingen geladen en gehydrateerde sensorcartridge, ondergedompeld in kalibrant in de gebruiksplaat. Plaats het op de werklade van de extracellulaire fluxanalysator en begin met de run.
        OPMERKING: De eerste stap is de kalibratie, die meestal ~ 20 minuten duurt.
      5. Haal de microplaat met de cellen uit de niet-CO2 37 °C incubator uit stap 2.4.6 nadat 25-30 minuten incubatie voorbij is. Voeg zonder de cellen te storen langzaam 130 μL van het voorgewarmde glycolyse-stresstesttestmedium (pH 7,4) per put toe om het mediumvolume in elke put op te maken tot 180 μL en breng de plaat terug naar de niet-CO2 37 °C incubator voor extra 15-20 minuten.
        OPMERKING: Een totale incubatietijd van 45-60 minuten na centrifugeren heeft de voorkeur.
      6. Nadat de kalibratie is voltooid, vervangt u de gebruiksplaat door de testmicroplaat (zonder deksel) die de cellen bevat. Druk op de loadcelplaat om de metingen te starten, wat ~ 1,5 uur duurt voordat de test is voltooid.
      7. Nadat de metingen zijn voltooid, verzamelt u de testmicroplaat die de cellen bevat en verwijdert u het testmedium zonder de cellen te storen. Was eenmaal voorzichtig met 250 μL 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder de cellen te ontwrichten.
      8. Voeg 10 μL RIPA-lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40, 0,5% Na deoxycholaat, 0,1% natriumdodecylssulfaat, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF), aangevuld met 1x proteaseremmercocktail, toe aan elke put en roer de plaat op een shaker gedurende 10 minuten. Vries de hele plaat in bij -80 °C.
      9. Ontdooi de plaat en voer een eiwitmeting uit voor gegevensnormalisatie volgens de instructies van de fabrikant.
      10. Haal de gegevens op en analyseer deze. Open het gegevensbestand met Wave Desktop Software. Klik op Normaliseren en plak de normalisatiewaarden voor elk putje. Klik op toepassen om de gegevens te normaliseren. Klik op Exporteren en selecteer glycolyse stresstestrapportgenerator om de geanalyseerde gegevens naar een rapportgenerator te exporteren. U kunt de gegevens ook exporteren naar een externe toepassing.
        OPMERKING: Als alternatief kan het totale nucleaire DNA-gehalte in elke put worden gebruikt om de gegevens te normaliseren. Een fluorescerende kleurstof, zoals CyQuant die bindt aan nucleïnezuur, kan worden gebruikt om het totale nucleaire DNA-gehalte per put te beoordelen.
  6. Het uitvoeren van een mitochondriale stresstest met behulp van de extracellulaire fluxanalysator (staptijd: ~ 3 h 30 min)
    1. Sensorcartridge met injecteerverbindingen laden
      1. Bereid 20 μM oligomycine, 20 μM FCCP en 5 μM rotenon + 5 μM antimycine A-oplossingen in voorgewarmd mitochondriaal stresstesttestmedium (pH 7,4).
        OPMERKING: Alle injecterende samengestelde oplossingen worden gemaakt met een concentratie van 10x. De uiteindelijke putconcentraties zijn 2 μM voor oligomycine, 2 μM voor FCCP en 0,5 μM voor rotenon en antimycine A (zie tabel 3).
      2. Verwijder de patroon van de gehydrateerde sensor uit de incubator van 37 °C uit stap 1.1.5 en verwijder luchtbellen zoals eerder beschreven in stap 2.5.1.2.
      3. Geef volgens de stappen 2.5.1.3 tot en met 2.5.1.6 20 μL 20 μM oligomycine af in poort A, 22 μL 20 μM FCCP in poort B en 25 μL een mengsel van 5 μM rotenon en 5 μM antimycine A in poort C.
        OPMERKING: Het is belangrijk dat elke poortreeks van alle 96 putten, inclusief die van de achtergrondputten, volledig wordt geladen met hetzelfde volume injecteermiddel.
    2. Sjablonen maken, kalibreren en meten
      1. Maak of laad de sjabloon voor de mitochondriale stresstest op de controller. Voer details in over injectiestrategieën, behandelingsomstandigheden en celtypen en druk op groepen genereren. Ga naar de plaatkaart en wijs putten toe aan elke groep die moet worden geanalyseerd. Wijs de 4 hoekputten toe voor achtergrondmetingen.
      2. Controleer in het protocol of kalibratie en evenwicht zijn gecontroleerd in de initialisatiestap.
      3. Voor nulmeting en metingen na elke injectie (oligomycine, FCCP en rotenon + antimycine A), stelt u het aantal meetcycli in op 3 en Mix - Wait - Meettijden op 3 min - 0 min - 3 min (zie tabel 4).
      4. Start de uitvoering om de kalibratie uit te voeren zoals in stap 2.5.2.4.
      5. Voeg 130 μL van het voorgewarmde mitochondriale stresstestmedium (pH 7,4) toe per put en in stap 2.5.2.5.
      6. Start de metingen; de gegevens ophalen en analyseren zoals in de stappen 2.5.2.6 tot en met 2.5.2.10. Exporteer de geanalyseerde gegevens naar de mitochondriale stresstestrapportgenerator of een externe toepassing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van dit protocol werden het celnummer en de concentraties van verschillende OxPHOS-gerichte geneesmiddelen (gebruikt in de extracellulaire flux-assays) geoptimaliseerd om ECAR en OCR van HSPC's te meten die zijn geïsoleerd van 24 weken oude vrouwelijke C57BL / 6-muizen. Eerst werd de glycolyse-stresstest uitgevoerd om het celgetal en de oligomycineconcentratie te optimaliseren. Een wisselend aantal HSPC's per put variërend van 5 × 104 tot 2,5 × 105 werden gebruikt in deze test. Zoals te z...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit method paper beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor de beoordeling van cellulaire bio-energetica (glycolyse en OxPHOS) in muis HSPC's met behulp van de Seahorse extracellulaire flux analyzer. Dit apparaat is een krachtig hulpmiddel dat tegelijkertijd de ECAR en OCR van levende cellen meet, die respectievelijk metrieken zijn van glycolyse en mitochondriale ademhaling. Het kan dus worden gebruikt om de cellulaire bio-energetica in realtime te beoordelen. Verder biedt het 96-well microplate-gebaseerde platform kwa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk in lombard laboratorium wordt ondersteund door de NIH (NIGMS R01GM101171, NIEHS R21ES032305), DoD (CA190267, CA170628, NF170044 en ME200030) en Glenn Foundation for Medical Research. Het werk in het Li-laboratorium wordt ondersteund door NIH (NHLBI 5R01HL150707).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 μm filterCorning430626Wordt gebruikt om het assay-medium te filteren en te steriliseren
100 mM natriumpyruvaatLife Technologies11360-070Component van mitochondriale stress test assay-medium
15 mL conische Falcon buizenCorning352096Gebruikt tijdens het oogsten van HSPC's en voor het bereiden van assay-medicijnoplossingen
200 mM L-glutamineLife Technologies25030-081Component van glycolyse stress test en mitochondriaal stress test assay-media
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)Sigma-AldrichD83753e medicijninjectie tijdens glycolyse stress test
5x verrijkingsbuffer (MojoSort)Biolegend480017Gebruikt voor wasbeurten tijdens HSPC-oogst
Ammoniumchloride (NH4Cl)Fisher ScientificA661-3Component van ACK lysis buffer
Antimycine ASigma-AldrichA86743e medicijninjectie tijdens mitochondriaal stress test
Bio-Rad DC-eiwitassaykitBio-Rad500-0112Gebruikt volgens de instructies van de fabrikant
Carbonylcyanide-4 (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP)Sigma-AldrichC29202e medicijninjectie tijdens mitochondriaal stress test
Cell-TakCorning354240Cellulair hechtingsmiddel. Gebruikt voor het coaten van cellulaire microplaten
Countes 3 geautomatiseerde celtellerThermoFisher ScientificVoor celtelling
EDTAFisher ScientificO2793-500Component van ACK lysis buffer en RIPA lysis buffer
Falcon 70 μm filterFisher Scientific08-771-2Gebruikt als celstrainer tijdens HSPC-oogst
Gibco foetaal bovien serum (FBS)Fisher Scientific26400044Gebruikt om assay-buffer te bereiden tijdens HSPC-oogst
Gibco HBSSFisher Scientific14175095Gebruikt om assay-buffer te bereiden tijdens HSPC-oogst
GlucoseSigma-AldrichG7528Component van mitochondriaal stress test assay-medium en eerste injectie van glycolyse stress test
OligomycineSigma-AldrichO48762e medicijninjectie tijdens glycolyse stress test en 1e medicijninjectie tijdens mitochondriaal stress test
PBSLife Technologies10010-049Gebruikt om cellen te wassen na assay voor eiwitkwantificering
Kaliumbicarbonaat (KHCO3)Fisher ScientificP235-500Component van ACK lysis buffer
Protease Inhibitor Cocktail (PIC)Roche11836170001Wordt geleverd als tabletten. Een tablet werd opgelost in 10 mL RIPA-buffer om 1x PIC te maken.
Rat biotin antimouse-B220, Clone ID: RA3-6B2Biolegend103203Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst
Rat biotin antimouse-CD2, Clone ID: RM2-5Biolegend100103Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst
Rat biotin antimouse-CD3, Clone ID: 17A2Biolegend100243Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst
Rat biotin antimouse-CD5, Clone ID: 53-7.3Biolegend100603Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst
Rat biotin antimouse-CD8, Clone ID: 53-6.7Biolegend100703Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst
Rat biotin antimouse-Gr-1, Clone ID: RB6-8C5Biolegend108403Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst
Rat biotin antimouse-Ter-119, Clone ID: TER-119Biolegend116203Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst
RotenonSigma-AldrichR88753e medicijninjectie tijdens mitochondriaal stress test
Seahorse XFe96 extracellulaire flux analyzerSeahorse Biosciences nu AgilentVoor ECAR en OCR metingen in real time.
NatriumbicarbonaatSigma-AldrichS5761Gebruikt om Cell-adhesive oplossing voor microplaatcoating te maken
Natriumchloride (NaCl)FisherBP358Component van RIPA lysis buffer
NatriumdeoxycholaatSigma-AldrichD6750Component van RIPA lysis buffer
Natriumfluoride (NaF)Sigma-AldrichS7920Component van RIPA lysis buffer
Natriumhydroxide (NaOH)Sigma-AldrichS8045Bereid 1 N oplossing. Gebruikt voor pH-normalisatie
Streptavidine Nanobeads (MojoSort)Biolegend480015Gebruikt voor lijnage-depletie tijdens HSPC-oogst
Tris-HClFisherBP153Component van RIPA lysis buffer
XF basismediumAgilent102353-100basismedium gebruikt om glycolyse stress test en mitochondriaal stress test assay-media te bereiden
XF voorbereid stationSeahorse BiosciencesGebruikt voor niet-CO2 37 °C incubaties
XFe96 extracellulaire FluxPakAgilent102416-100 of 102601-100Bevat assaycartridges met gebruiksplaten, laadplateaus voor het laden van
geneesmiddelen op de assaycartridge, XF-kalibratieoplossing en XF-celcultuur microplaat

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rieger, M. A., Schroeder, T. Hematopoiesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008250(2012).
  2. Papa, L., Djedaini, M., Hoffman, R. Mitochondrial role in stemness and differentiation of hematopoietic stem cells. Stem Cells International. 2019, 4067162(2019).
  3. Snoeck, H. W. Mitochondrial regulation of hematopoietic stem cells. Current Opinion in Cell Biology. 49, 91-98 (2017).
  4. Bujko, K., Kucia, M., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 49-77 (2019).
  5. Ito, K., Suda, T. Metabolic requirements for the maintenance of self-renewing stem cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 243-256 (2014).
  6. Norddahl, G. L., et al. Accumulating mitochondrial DNA mutations drive premature hematopoietic aging phenotypes distinct from physiological stem cell aging. Cell Stem Cell. 8 (5), 499-510 (2011).
  7. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-independent methods reveal elevated mitochondrial mass in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  8. Kim, M., Cooper, D. D., Hayes, S. F., Spangrude, G. J. Rhodamine-123 staining in hematopoietic stem cells of young mice indicates mitochondrial activation rather than dye efflux. Blood. 91 (11), 4106-4117 (1998).
  9. Filippi, M. D., Ghaffari, S. Mitochondria in the maintenance of hematopoietic stem cells: new perspectives and opportunities. Blood. 133 (18), 1943-1952 (2019).
  10. Inoue, S., et al. Mitochondrial respiration defects modulate differentiation but not proliferation of hematopoietic stem and progenitor cells. FEBS Letters. 584 (15), 3402-3409 (2010).
  11. Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
  12. Bhatti, J. S., Bhatti, G. K., Reddy, P. H. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in metabolic disorders - A step towards mitochondria based therapeutic strategies. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1863 (5), 1066-1077 (2017).
  13. Fontenay, M., Cathelin, S., Amiot, M., Gyan, E., Solary, E. Mitochondria in hematopoiesis and hematological diseases. Oncogene. 25 (34), 4757-4767 (2006).
  14. Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
  15. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511(2010).
  16. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  17. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. Bioenergetics, Fourth Edition. Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. , Academic Press. Ch. 9 255-302 (2013).
  18. Aft, R. L., Zhang, F. W., Gius, D. Evaluation of 2-deoxy-D-glucose as a chemotherapeutic agent: mechanism of cell death. British Journal of Cancer. 87 (7), 805-812 (2002).
  19. Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54918(2016).
  20. Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
  21. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hematopo tische stamcellenbeoordeling van glycolyseoxidatieve fosforyleringzuurstofconsumptiesnelheidextracellulaire acidificatiesnelheidmitochondri le stresstestglycolyse stresstest

Gerelateerde artikelen