Fotoafbreekbare hydrogelinterfaces voor screening, selectie en isolatie van bacteriën

Summary

Het gebruik van fotoafbreekbare hydrogels om bacteriële cellen te isoleren door gebruik te maken van een lichtpatiteringstool met hoge resolutie wordt gerapporteerd. Essentiële experimentele procedures, resultaten en voordelen van het proces worden beoordeeld. De methode maakt een snelle en goedkope isolatie mogelijk van gerichte bacteriën met zeldzame of unieke functies uit heterogene gemeenschappen of populaties.

Abstract

Biologen hebben lang geprobeerd de relatie tussen fenotype en genotype te begrijpen. Om dit verband beter te begrijpen, is het cruciaal om praktische technologieën te ontwikkelen die microscopische celscreening koppelen aan celisolatie met een hoge zuiverheid voor downstream genetische analyse. Hier wordt het gebruik van fotoafbreekbare poly(ethyleenglycol)hydrogels voor screening en isolatie van bacteriën met unieke groeifenotypen uit heterogene celpopulaties beschreven. De methode is gebaseerd op het inkapselen of insluiten van cellen met de hydrogel, gevolgd door cultuur, microscopische screening en vervolgens het gebruik van een hoge resolutie lichtpatroontool voor spatiotemporale controle van hydrogelafbraak en afgifte van geselecteerde cellen in een oplossing voor ophalen. Het toepassen van verschillende lichtpatronen zorgt voor controle over de morfologie van de geëxtraheerde cel, en patronen zoals ringen of kruisen kunnen worden gebruikt om cellen met minimale directe blootstelling aan UV-licht op te halen om DNA-schade aan de isolaten te beperken. Bovendien levert de lichtpatroontool een instelbare lichtdosis om verschillende degradatie- en celafgiftesnelheden te bereiken. Het maakt degradatie bij hoge resolutie mogelijk, waardoor celopvraging met ruimtelijke precisie op micronschaal mogelijk is. Hier wordt het gebruik van dit materiaal om bacteriën te screenen en op te halen uit zowel bulkhydrogels als microgefabriceerde lab-on-a-chip-apparaten gedemonstreerd. De methode is goedkoop, eenvoudig en kan worden gebruikt voor veel voorkomende en opkomende toepassingen in de microbiologie, waaronder isolatie van bacteriestammen met zeldzame groeiprofielen uit mutantenbibliotheken en isolatie van bacteriële consortia met emergente fenotypes voor genomische karakteriseringen.

Introduction

Isolatie van cellen met uniek gedrag uit een complexe en heterogene omgeving is fundamenteel voor het verkrijgen van genetische informatie in de biologie¹. In de microbiologie wordt de selectie en isolatie van zeldzame of unieke microben na observatie belangrijk in veel toepassingen die een verband vereisen tussen genomische informatie en waarneembare fenotypische informatie. Deze toepassingen omvatten het selecteren van fenotypisch zeldzame stammen uit mutantenbibliotheken^2,het selecteren van keystone-micro-organismen uit complexe microbiële gemeenschappen^3,4en het selecteren van fenotypisch zeldzame maar belangrijke bacteriën uit isogene populaties. Isolatie van levensvatbare maar niet-cultureerbare cellen (VBNC) van een bacteriepopulatie is een belangrijk voorbeeld van de laatste, waarbij cellen met het VBNC-fenotype vaak verborgen zijn in bacteriepopulaties bij 1:10² tot 1:10⁵ verhoudingen^5,6. Vanwege de wijdverspreide problemen bij het isoleren van bacteriën, blijft veel onbekend over veel fenotypisch zeldzame micro-organismen. Deze beperkingen benadrukken de noodzaak van celisolatietechnieken om eerst de doelcel of cellen uit een mengsel te identificeren en ze vervolgens op te halen en te isoleren voor downstream moleculaire analyse⁷.

Enkele van de meest voorkomende methoden voor celisolatie zijn flowcytometrie en fluorescerende geactiveerde celsortering^{(FACS) 8,}immunomagnetische scheiding^9,10en microfluïdica^11. Hoewel deze isolatiemethoden een hoge waarde hebben, hebben ze ook nadelen die het gebruik ervan beperken. FACS kan bijvoorbeeld routinematige microbiële isolatie op het niveau van één cel bieden voor follow-up genomische analyse^3, maar wordt vaak beperkt door de beschikbaarheid en kosten, evenals stroomafwaartse besmettingsproblemen¹¹. Microfluïdische benaderingen zoals microfluïdische flowcytometrie hebben veel aandacht gekregen, wat, in vergelijking met conventionele flowcytometrie, een aanzienlijke vermindering van het vereiste monstervolume mogelijk maakt¹². Het scheiden en ophalen van een individuele of kleine verzameling cellen van microfluïdische apparaten is echter vaak een uitdagend probleem dat meestal een complexere installatie en apparaatontwerp vereist¹³. Veel microfluïdische benaderingen karakteriseren cellen genetisch voordat ze worden ingevoerd en waargenomen in een apparaat¹⁴, waardoor het aantal unieke soorten dat wordt waargenomen bij het uitvoeren van een functioneel scherm wordt beperkt. Gezien deze beperkingen is verdere innovatie van zowel methoden als materialen die praktisch zijn voor celscreening en isolatie vereist voor wijdverbreid gebruik in veel laboratoria.

Dit artikel presenteert een nieuwe, op materialen gebaseerde benadering voor het screenen en isoleren van bacteriën. De methode maakt gebruik van fotodegradeerbare hydrogels voor celinkapseling, kweek, microscopische observatie en on-demand afgifte en herstel van gerichte bacteriën met unieke fenotypen. Hydrogels zijn ontworpen om een maaswijdte van 10 nm te bevatten, waarbij elke crosslink o-nitrobenzylgroepen¹⁵bevat. Het materiaal kapselt cellen in of vangt ze op voor observatie en maakt de diffusie van voedingsstoffen en afvalproducten van en naar cellen voor kweek mogelijk. Door het materiaal bloot te stellen aan een 365 nm UV-lichtbron met een patroon door een rechtopstaande microscoop, kan de hydrogel lokaal worden afgebroken door fotocleavage van o-nitrobenzylgroepen^16,17. Afbraak leidt tot de selectieve afgifte van cellen voor herstel voor downstream-analyse, inclusief genomische en mogelijk proteomische en transcriptomische analyse. De experimentele opzet en het protocol zijn relatief eenvoudig, goedkoop en translationeel naar microbiologische laboratoria. Het vereist alleen celinkapseling door hydrogelvorming, observatie van gevangen cellen met een rechtopstaande brightfield- en fluorescentiemicroscoop en de verlichting van interessante cellen met een uv-lichtbron met patroon om op te halen.

Een belangrijk voordeel van deze op materialen gebaseerde benadering van screening is het aanpassingsvermogen aan verschillende screeningformaten. In het meest basale formaat kan het materiaal worden gebruikt voor screening door een heterogene celverzameling in bulkhydrogels in te kapselen. Cellen worden vervolgens geobserveerd voor het gewenste fenotype en individuele cellen van belang worden verwijderd voor genomische karakterisering. In meer uitgebreide formaten kan het materiaal ook worden geïntegreerd in lab-on-a-chip-apparaten om nauwkeurige celafgifte en -herstel uit de gewenste delen van het apparaat te bieden. Beide formaten worden hier beschreven en beide hebben recente nieuwe microbiële screening- en selectietoepassingen mogelijk gemaakt^17,18,19. De methode wordt hier gedemonstreerd met model Gram-negatieve organismen (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) en een model Gram-positief organisme (Bacillus subtilis) en is gemakkelijk uitgebreid naar een verscheidenheid aan andere bacteriën.

Protocol

1. Bacteriestammen en kweekprotocollen

1. Streak kolonies van bacteriën op agar platen aangevuld met geschikte groeimedia. In dit rapport wordt B. subtilis (stam 1A1135, Bacillus Genetic Stock Center) gekweekt op ATGN (0,079 M KH₂PO₄, 0,015 M (NH₄)₂SO₄, 0,6 mM MgSO₄·7H₂O, 0,06 mM CaCl₂·2H₂O, 0,0071 mM MnSO₄· H₂O, 0,125 M FeSO_4· 7H₂O, 28 mM glucose, pH: 7 ± 0,2, 15 g/L agar) agarplaten aangevuld met 100 μg/ml spectinomycine en E. coli (stam 25922, ATCC) op ATGN agarplaten aangevuld met 100 μg/ml ampicilline.
   OPMERKING: Eerdere rapporten van hydrogel-inkapseling en afgifte met deze materialen van Fattahi et al.¹⁹ gebruikten in plaats daarvan A. tumefaciens C58-cellen
2. Pluk gewenste kolonies van ATGN-agarplaten en begin met nachtculturen. Voor de hier gebruikte stammen E. coli en B. subtilis wordt de kweek bij 37 °C tijdens het schudden bij 215 tpm in een vloeibaar ATGN-medium gedurende 24 uur. Bewaar de celculturen in 50% glycerol bij -80 °C tot toekomstig gebruik.
3. Pluk kolonies van beide stammen uit glycerolvoorraden met behulp van steriele inentingslussen en incubeer in ATGN vloeibare media gedurende 24 uur bij 37 °C en 215 tpm.

2. Voorbereiding van het materiaal dat nodig is voor hydrogelvorming

1. Fotodegradeerbare PEG-o-NB-diacrylaatsynthese
   OPMERKING: De interne synthese van het PEG-o-NB-diacrylaat is goed beschreven en eerder gerapporteerd^16,17. Als alternatief, omdat de synthese routine is, kan deze worden uitbesteed aan een chemische synthesefaciliteit.
2. Buffer voor crosslinking
   1. Neem het recept van het geselecteerde medium voor de bacteriestam en bereid media met 2x voedingsstoffen. Voeg fosfaat, bijvoorbeeld NaH₂PO_4, toe aan het medium tot een eindconcentratie van 100 mM. Stel vervolgens de pH-waarde in op 8 met 5 M NaOH (aq).
   2. Steriliseer de bufferoplossing en bewaar deze bij -20 °C tot verder gebruik.
      OPMERKING: Laat alle overgangsmetalen in de media weg, omdat deze metalen de oxidatie van de thiolen tot disulfiden katalyseren.
3. PEG-o-NB-diacrylaatoplossing
   1. Voeg voor elke mg van het aliquot PEG-o-NB-diacrylaat (3.400 Da molecuulgewicht) poeder 3,08 μL ultrapuur water toe om een concentratie van 49 mM PEG-o-NB-diacrylaat (98 mM acrylaatconcentratie) te bereiken.
   2. Vortex de oplossing totdat deze goed gemengd is en bewaar deze oplossing bij -20 °C tot verder gebruik.
4. 4-armige PEG-thioloplossing
   1. Voeg voor 4-armig PEG-thiol (10.000 Da molecuulgewicht) preparaat 4 μL ultrapuur water per mg poeder toe om een concentratie van 20 mM (80 mM thiolconcentratie) te bereiken.
   2. Vortex deze oplossing totdat deze goed gemengd is en bewaar deze oplossing bij -20 °C tot verder gebruik.

3. Bereiding van geperfluoralkyleerde (niet-reactieve) coverslips

1. Plaats maximaal 5 glazen platen (25 mm x 75 mm x 1 mm) in een polypropyleen schuifstuurwagen. Soniceer de dia's met een 2% (w/v) reinigingsmiddeloplossing(Tabel met materialen)gedurende 20 minuten.
2. Spoel de glaasjes drie keer af met ultrapuur water en laat de glaasjes vervolgens gedurende 20 minuten in water klinken. Droog de glijbanen met behulp van een stroom van N₂.
3. Plasmareiniging (zie Materiaaltabel) aan weerszijden van de glasdia's volgens het protocol in paragraaf 4.1 gedurende 2 min.
4. Plaats de plasma gereinigde dia's terug in de diamailer en vul de container met een 0,5% (v/v) oplossing van trichloorm (1H, 1H, 2H, 2H, -perfluoroctyl)silaan in tolueen. Laat deze glazen platen gedurende 3 uur bij kamertemperatuur (RT) functioneren.
5. Nadat de dia's zijn gefunctionaliseerd, spoelt u de dia's in de diamailer, eerst met tolueen en vervolgens ethanol (drie keer met elk oplosmiddel). Droog vervolgens elke gefunctionaliseerde dia met een stroom van N₂.

4. Bereiding van thiol gefunctionaliseerde (base) coverslips

1. Reiniging van de glazen afdekplaten met behulp van een plasmareiniger
   1. Leg 18 mm x 18 mm coverslips in een petrischaaltje. Plaats vervolgens de petrischaal in een plasmareinigerkamer en schakel de kracht van de plasmareiniger in.
   2. Schakel de vacuümpomp in om de lucht in de kamer te zuiveren totdat de manometer 400 mTorr aangeeft.
   3. Open de doseerklep om lucht in de kamer te laten totdat de manometer een constante druk bereikt (800-1000 mTorr). Selecteer vervolgens RF met de modus "Hi" en stel de coverslips gedurende 3 minuten bloot.
   4. Schakel na 3 minuten de RF-modus en vacuümpomp uit.
   5. Haal de petrischaal uit de kamer, draai de dekplaten om en plaats ze terug in de kamer om de andere kant van de glazen afdekplaat bloot te leggen.
   6. Herhaal stap 4.1.2-4.1.4 om de onbehandelde zijde van de glazen afdekplaat te reinigen.
   7. Verwijder na het voltooien van het proces de petrischaal uit de kamer en zet de plasmareiniger en stofzuiger uit.
2. Reiniging en hydroxylering van de coverslips met piranha-oplossing
   OPMERKING: Standaard piranha-reinigingsprotocollen kunnen worden gebruikt om glasslips te reinigen en te hydroxyleren. Piranha-oplossing is een 30:70 (v/v) mengsel van H₂O₂ en H₂SO₄. Alternatieve methoden voor het reinigen van glazen afdekkingsplaten kunnen ook worden gebruikt.
   LET OP: Piranha-oplossing is sterk corrosief en explosief met organische oplosmiddelen en moet met uiterste voorzichtigheid worden behandeld. Er moeten passende veiligheids- en inperkingsmaatregelen worden genomen, zoals het gebruik van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (laboratoriumjas, chemisch bestendig schort, veiligheidsbril, gezichtsscherm, zuurbestendige butylhandschoenen). Alle glaswerk en werkoppervlakken die in contact komen met piranha-oplossing moeten vóór gebruik schoon, droog en vrij van organische residuen zijn. Piranha-oplossing mag nooit worden bewaard in een gedeeltelijk gesloten of gesloten container.
   1. Plaats een schone glazen schaal van 100 mm x 50 mm op een magnetische roerder met instelbare roersnelheid onder een zuurkast en voeg 14 ml H₂SO₄ toe aan de schaal.
   2. Plaats voorzichtig een kleine, met teflon beklede magnetische roerstaaf met een met teflon beklede tang in de schaal. Draai vervolgens de roerder langzaam om spatten van het zuur te voorkomen.
   3. Voeg vervolgens voorzichtig 6 ml H₂O₂ toe aan de schaal en laat de oplossing goed gemengd worden.
   4. Zet de roerder uit en haal met de tang de roerstaaf uit de schaal. Plaats vervolgens voorzichtig de deklipjes in de schaal met behulp van de tang en stel de temperatuur in op 60-80 °C.
   5. Verwijder na 30 minuten voorzichtig de deklipjes met behulp van de tang en dompel ze twee keer onder in gedeïoniseerd water (DI) water om de resterende piranha-oplossing af te spoelen.
   6. Bewaar na het spoelen met water de coverslips in DI-water bij RT tot verder gebruik.
   7. Zet de kookplaat uit en laat de piranha-oplossing afkoelen.
   8. Om de piranha-oplossing weg te gooien, plaatst u de glazen schaal van 100 mm x 50 mm met de gekoelde piranha-oplossing voorzichtig in een groter, leeg glazen bekerglas met een volume van ten minste 1,5 l. Voeg vervolgens 1 L water toe om te verdunnen en voeg natriumbicarbonaatpoeder toe om te neutraliseren. Merk op dat natriumbicarbonaat borrelen en warmteontwikkeling veroorzaakt en zeer langzaam moet worden toegevoegd, anders kan borrelen leiden tot spatten van het zuur. Wanneer verdere toevoeging van natriumbicarbonaat geen borrel veroorzaakt, controleer dan de pH met pH-papier om te controleren of deze is geneutraliseerd. Zodra de oplossing is geneutraliseerd en afgekoeld, kan deze in de gootsteen worden gegoten.
3. Thiol functionalisatie van de coverslips
   1. Bereid een 5% (v/v) oplossing van 269 mM (3-mercaptopropyl) trimethoxysilaan (MPTS) oplossing in droog tolueen.
   2. Voeg 10 ml van de oplossing toe aan afzonderlijke conische centrifugebuizen van 50 ml en plaats één gereinigde afdekplaat in elke buis en dompel deze onder in de oplossing.
      OPMERKING: Eén coverslip per buis van 50 ml wordt gebruikt om de thiolatie van beide zijden van het substraat te garanderen zonder te worden gestoord door andere substraten.
   3. Was na 4 uur elke coverslip (vier wasbeurten per coverslip) met tolueen, een 1:1 (v/v) ethanol: tolueenmengsel en ethanol.
      OPMERKING: Dit wordt gedaan door elke afdekplaat sequentieel onder te dompelen in conische centrifugebuizen die de genoemde oplossingen bevatten.
   4. Dompel ze na het spoelen van het substraat onder in ethanol en bewaar ze bij 4 °C tot verder gebruik.
      OPMERKING: Afhankelijk van het aantal coverslips kan deze methode bewerkelijk worden door coverslips één voor één te behandelen. Voor meerdere coverslips kunnen Columbia-potten worden gebruikt die meerdere coverslips tegelijkertijd passen.

5. Fabricage van silicium microwell arrays

1. Paryleencoating: Gebruik het standaardprotocol beschreven in eerdere onderzoeksartikelen^20,21 om siliciumwafers te coaten met paryleen.
2. Microfabricage: Volg het protocol beschreven door Barua et al.¹⁸ om de microwell-array te ontwerpen en te fabriceren(aanvullende figuur 1).
   OPMERKING: Standaard fotolithografische technieken beschreven door Timm et al.¹⁷ werden toegepast om microwell arrays te fabriceren op paryleen-gecoate silicium wafers.

6. Hydrogelvorming

1. Bulk hydrogel vorming op glazen coverslips
   1. Hydrogelprecursoroplossing: Voeg 12,5 μL van de crosslinkingbuffer toe aan een microcentrifugebuis van 0,5 ml, gevolgd door 5,6 μL PEG-o-NB-diacrylaatoplossing. Voeg ten slotte 6,9 μL 4-armige PEG-thioloplossing toe aan het mengsel.
      OPMERKING: Het toevoegen van de 4-armige PEG-thiol aan het mengsel initieert de crosslinking-reactie. Daarom moet de hydrogel-precursoroplossing onmiddellijk na het mengen worden gebruikt.
   2. Voor celinkapseling in de hydrogelprecursoroplossing volgt u de stappen 6.1.3-6.1.9.
   3. Voor celinkapseling ent u vóór stap 6.1.1 de crosslinkingbuffer met de gewenste celdichtheid. Zoals eerder gemeld¹⁹, werd waargenomen dat celdichtheid van 7,26 × 10⁷ CFU / ml in de crosslinkingbuffer correleert met een dichtheid van ~ 90 cellen / mm² ingekapseld over de hydrogel.
   4. Leg de thiolated base coverslip op een schone petrischaal. Plaats twee afstandhouders (zie Materialentabel) aan de twee tegenover elkaar liggende zijden van de dekplaat.
      OPMERKING: Thiol-functionalisatie van de coverslips is noodzakelijk voor de covalente bevestiging van de hydrogel aan het coverslip-oppervlak. Dit gebeurt door de reactie van thiolgroepen op het oppervlak en de acrylaatgroepen die aanwezig zijn in de hydrogelprecursoroplossing.
   5. Bevestig de afstandhouders op de bodemdeksel door de afstandhouders op de petrischaal te plakken.
   6. Pipetteer het gewenste volume van de precursoroplossing op een niet-reactieve, geperfluoralkyleerde glasplaat.
   7. Plaats de geperfluoraliseerde glasplaat op de basisdekplaat(figuur 1C). Wacht 25 minuten bij RT voordat de hydrogelvorming is voltooid.
   8. Verwijder na het doseren voorzichtig de geperfluoraliseerde glasplaat. De hydrogel blijft vastzitten aan de basisdekplaat.
      OPMERKING: Gebruik voor 18 mm x 8 mm coverslips om een membraan van 12,7 μm dik te verkrijgen ~ 7 μL van de precursoroplossing(Figuur 1A,B). Het gebruik van grotere volumes precursoroplossing kan resulteren in hydrogel onder de basisdekplaat. Dit kan ertoe leiden dat de basisdeksels aan de petrischaal blijven plakken en breken bij een poging tot verwijdering. Ook hydrogelresidu onder de deklip is problematisch voor microscopie. Zachte verwijdering van de niet-reactieve geperfluoralkyleerde glasplaat is vereist omdat snelle verwijdering de hydrogel kan beschadigen.
   9. Plaats het substraat in een petrischaaltje van 60 mm x 15 mm in gespecificeerde kweekmedia. Hier werd ATGN-media aangevuld met 100 μg / ml spectinomycine voor B. subtilis of 100 μg / ml ampicilline voor E.coli bij 37 ° C gebruikt voor 24 uur kweektijden.

Figuur 1: Hydrogelvorming op thioleerde glazen afdekplaten. (A) Afstandhouders met een dikte van 12,7 μm worden geplaatst aan twee tegengestelde zijden van een basisdekplaat die reactieve thiolgroepen bevat. B)De hydrogelprecursoroplossing wordt gepipetteerd over een niet-reactieve, gefluoreerde glasplaat. (C) De niet-reactieve glasplaat wordt op de afstandhouders geplaatst voor de vorming van 12,7 μm dikke hydrogel. D)De niet-reactieve glasplaat wordt voorzichtig verwijderd, waardoor de hydrogel aan de basisdekplaat blijft bevestigd. (E) De bereide hydrogel kan worden geïncubeerd in media voor cultuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

7. Hydrogel-vorming over microwell-arrays

1. Bacteriën zaaien in microwell arrays
   OPMERKING: 700 μL van 0,1 OD₆₀₀ celsuspensies werden gezaaid over de microwell array substraten, en de paryleen lift-off methode werd toegepast om cellen van de achtergrond te verwijderen met behulp van het protocol beschreven door Timm et al. ²².
2. Bereid de hydrogelprecursoroplossing door 5,6 μL PEG-o-NB-diacrylaat toe te voegen met 12,5 μL pH 8 fosfaat-gebufferde zoutoplossing ATGN en te mengen met 6,9 μL van de vierarmige PEG-thioloplossing.
3. Pipetteer 12,5 μL van de precursoroplossing op een niet-reactieve, geperfluoralkyleerde glasplaat en plaats twee stalen afstandhouders van 38 μm (zie materiaaltabel) aan twee tegenover elkaar liggende zijden van het met cellen geënt microwell array-substraat.
4. Keer de geperfluoralkyleerde glasplaat om met de druppel precursoroplossing en plaats de druppel in het midden van het microwell-substraat. Incubeer vervolgens gedurende 25 minuten bij RT voor hydrogelvorming.
5. Verwijder voorzichtig de glasplaat van het microwell-substraat. Het hydrogelmembraan moet aan het microwell-substraat blijven kleven. Ga verder met stap 6.1.9.

8. Materiaalvoorbereiding voor celextractie

1. PDMS houder voorbereiding
   1. Plak een stapel van tien coverslips van 18 x 18 mm aan elkaar en lijm deze stapel coverslips op de bodem van een petrischaaltje.
   2. Om PDMS-houders te fabriceren, mengt u PDMS-precursor en uithardingsmiddel in een verhouding van 10: 1 volumeverhouding in een plastic beker, ontgast u het mengsel in een vacuümsiccator en giet u het mengsel vervolgens in de petrischaal.
   3. Hard PDMS 90 min uit bij 80 °C. Knip vervolgens rond het afgeplakte blok om de PDMS-houder te verwijderen en plaats de PDMS-houder op een glazen schuif voor eenvoudiger gebruik voor microscopie.
2. Microsyringe en tubing voorbereiding
   1. Snijd 20 cm PTFE-slang (0,05 in I.D.) en bevestig het ene uiteinde van de slang aan een spuit van 100 μL microliter.
      OPMERKING: Vermijd voor extractie het gebruik van pipetten, omdat het trekken van de vrijgekomen cellen via een pipetpunt het hydrogeloppervlak kan beschadigen en tot verontreiniging kan leiden.

9. Hydrogel-degradatie met het patroonverlichtingsgereedschap

OPMERKING: De volgende stappen die in deze sectie worden beschreven, zijn identiek voor zowel bulkhydrogels als microwell-arrays, met uitzondering van de lichtblootstellingspatronen die worden beschreven in de stappen 9.6.4-9.6.6 en 9.6.7-9.6.10.

1. Zet de microscoop aan (zie Tabel met materialen). Schakel vervolgens het gereedschap voor patroonverlichting in (zie Materialentabel).
2. Schakel de 365 nm LED-lichtbron analoge en digitale besturingsmodule in. Schakel vervolgens de LED-lichtbronbesturingsmodule in.
3. Open de microscoopsoftware en de software voor het patroonverlichtingsgereedschap. Wanneer het hardwareconfiguratievenster wordt geopend, selecteert u de knop Laden.
   OPMERKING: Hier worden drie apparaten geladen. (Camera van derden, een besturingsmodule en het verlichtingsgereedschap met patroon)
4. Druk op de knop Start. Het softwarevenster voor lichtpatronen wordt nu geopend. Selecteer de eerste optie, de knop Apparaatbeheer, in de linkerzijbalk van het venster.
5. Kalibreer het gereedschap voor patroonverlichting.
   OPMERKING: Kalibratie moet worden uitgevoerd met hetzelfde microscoopobjectief en filter dat zal worden gebruikt voor blootstelling aan licht.
   1. Stel het microscoopobjectief in op 10x vergroting.
      OPMERKING: Deze vergroting zorgt voor voldoende werkafstand tussen de microscooplens en het monsteroppervlak. Het maakt het ook mogelijk om het ophaalproces in realtime door het beeldvenster te bewaken en op te nemen.
   2. Stel de microscooplens en het filter in op de instellingen die worden gebruikt voor blootstelling aan licht en plaats de kalibratiespiegel onder de microscoop.
   3. Druk in het venster Apparaatbeheer op het tabblad LED-bediening. Schakel LED #1 in en stel de lichtintensiteit in op het gewenste aantal. In standaard extractie-experimenten is dit ingesteld op 60%.
   4. Druk op het tabblad met de naam van het patroon van het verlichtingsgereedschap in het venster Apparaatbeheer. Druk vervolgens op de knop Raster weergeven.
      OPMERKING: Er wordt een rasterpatroon geprojecteerd op de kalibratiespiegel.
   5. Pas de microscoopfocus en camerabelichting aan om een hoge beeldkwaliteit van het raster te verkrijgen en draai de camera om de rasterlijnen parallel aan het raamkozijn van de camera uit te lijnen, indien nodig.
   6. Selecteer de knop Kalibratiewizard onder het tabblad met de naam van het patroon van het verlichtingsgereedschap en volg de instructies van de software in dit venster.
      OPMERKING: Er wordt een camera-instellingsvenster van derden geopend.
   7. Er wordt een venster kalibratietypeselectie geopend. Selecteer Automatische kalibratie en druk op Volgende.
   8. Wanneer het venster Aanpassing vóór kalibratie wordt geopend, volgt u de software-instructies en drukt u op de knop Volgende.
   9. Wanneer het venster Toewijzingsinformatie wordt geopend, slaat u deze kalibratie dienovereenkomstig op in de gewenste map. Dit wordt gedaan door de datum, microscoopnaam, objectieflens en filter in te voeren.
   10. Druk na de kalibratie op de knop Working Area Definition onder het tabblad met de naam van het patroonverlichtingsgereedschap om indien nodig het werkgebied van het patroonverlichtingsgereedschap te definiëren.
6. Sectie Sequentieontwerp voor patroonvoorbereiding.
   1. Druk op de knop Sequence Design in de linkerzijbalk van het softwarevenster. Druk vervolgens op de knop Profielvolgorde-editor.
   2. Wanneer het venster Profielreekseditor wordt geopend, selecteert u de optie Nieuw profiel onder de profiellijst.
      OPMERKING: Nu wordt een patrooneditorvenster geopend.
   3. Bereid het gewenste patroon voor op blootstelling aan licht door verschillende patroonvormen en -maten te kiezen of teken het patroon desgewenst handmatig.
   4. Voor cirkel- en gebroken kruispatronen voor de bulkhydrogel volgt u stap 9.6.5- 9.6.6
   5. Definieer voor cirkelpatronen een cirkel met een diameter van 30 μm over een doelbacteriekolonie om de hele kolonie te bedekken. Kies de vormvulkleur wit.
   6. Voor gebroken kruispatronen kiest u de rechthoekige vorm in het patroontekenvenster met afmetingen van 3 μm x 8 μm. Plaats vier rechthoeken met deze dimensie aan de randen van de doelkolonie, terwijl de helft van de patronen een overlay met de kolonie heeft.
   7. Voor cirkel- en ringpatronen voor de microwellarrays volgt u de stappen 9.6.8-9.6.10.
   8. Teken voor cirkelpatronen een cirkel met een diameter van 10 μm rond de omtrek van de put. Kies de vormvulkleur wit.
   9. Teken voor het ringpatroon een cirkel met een diameter van 20 μm, plaats deze over de put en kies de vormvulkleur wit.
   10. Teken een ander cirkelpatroon met een diameter van 10 μm met vulvormkleur zwart en plaats het rond de omtrek van de put.
7. Bewerk het patroon en wijzig de vormen op basis van de gewenste extractiemethode. Zorg ervoor dat het gewenste patroon zich binnen het werkgebied van het patroonverlichtingsgereedschap bevindt.
8. Plaats het monster in een PDMS-houder en pipetteer de gedefinieerde media bovenop het monster om uitdroging van het monster te voorkomen en een drageroplossing voor vrijgekomen cellen te bieden.
9. Vervang deze vervolgens door de kalibratiespiegel.
10. Pas de microscoopfocus aan om een scherp beeld te krijgen van de kolonies in de hydrogel. Inspecteer de kolonies om een kolonie van belang te identificeren.
11. Ontwerp hier de lichtpatronen terwijl de cameraweergave de kolonies in het monster toont om verschillende patronen voor celextractie te testen.
12. Sla het gedefinieerde patroon op. Nadat u het gedefinieerde patroon hebt opgeslagen, selecteert u de sectie Sessiebeheer.
13. Voeg in deze sectie onder het tabblad met de titel met de productnaam van het verlichtingsgereedschap met patroon de opgeslagen reeks toe.
14. Nadat u de reeks hebt toegevoegd, kiest u de optie om het patroon te simuleren om te bekijken en aan te passen aan de gewenste belichtingslocatie.
    OPMERKING: De locatie van het monster kan hier worden aangepast om ervoor te zorgen dat het patroon precies op het doelgebied wordt geprojecteerd.
15. Pas vervolgens de lichtintensiteit aan op 60% en de belichtingstijd op 40 s onder het tabblad LED-bediening en start het belichtingsproces.
16. Bewaak de hydrogeldegradatie in real-time en brightfield-modus om celafgifte te garanderen.
    OPMERKING: Voorkom bewegingen naar het monster tijdens blootstelling aan licht, omdat dit kan leiden tot degradatie van ongewenste delen van de hydrogel, wat resulteert in kruisbesmetting.

10. Cel ophalen

OPMERKING: De procedure voor het ophalen van cellen is identiek voor zowel bulkhydrogels als microwell-arrays.

1. Na 365 nm blootstelling aan licht en celafgifte, verzamel de cellen met behulp van een microliter spuit en microfluïdische slang(figuur 2).
   OPMERKING: Het ophalen van cellen moet onmiddellijk na blootstelling aan het patroon worden uitgevoerd. Dit zorgt voor gelokaliseerd celherstel voordat de vrijgekomen cellen zich van het bestraalde gebied verwijderen.
2. Verander de microscoop van brightfield naar FITC- of TRITC-filter om het blootgestelde gebied van het monster met het blote oog te visualiseren.
3. Zodra het blootgestelde gebied zich bevindt, plaatst u het uiteinde van de buis op de bestraalde plek. Verander vervolgens het microscoopfilter terug naar brightfield om het ophalen van cellen in realtime te volgen.
4. Gebruik de spuit die aan het andere uiteinde van de slang is bevestigd om de vrijgekomen cellen voorzichtig op te zuigen. Trek 200 μL van de oplossing op en breng de oplossing in een centrifugebuis van 1,5 ml voor DNA-analyse of plating.

Figuur 2: Schematische weergave van de extractiemethode voor het verzamelen van cellen die vrijkomen uit de hydrogel. Hier wordt, onmiddellijk na 365 nm UV-blootstelling, hydrogeldegradatie en celafgifte, de microscoop gebruikt om het hydrogelmonster te verlichten met licht van een TRITC-filter, wat resulteert in een felgroene vlek die het gebied bedekt waar celafgifte plaatsvond. Dit helpt de gebruiker bij het identificeren van de ruimtelijke locatie voor monsterverzameling. Na het visualiseren van dit gebied worden op deze plek opvangslangen aan een microliterspuit geplaatst en wordt het monster verzameld. Brightfield-microscopie bij 10x vergroting wordt gebruikt om het uiteinde van het buis- en hydrogeloppervlak in realtime te bewaken voor nauwkeurige celverzameling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

11. Genomische DNA-zuivering en DNA-kwaliteitsmeting

1. Gebruik dna-zuiveringskit (zie tabel met materialen)om DNA uit bacterie-isolaten te extraheren.
   1. Volg de specificaties van de fabrikant die worden beschreven in het handboek van de DNA-zuiveringskit²³ tot de laatste stap (stap 7), waarbij elutie met Buffer AE vereist is.
   2. Volg voor de elutiestap de specificaties van de fabrikant, met het verschil van het gebruik van 100 μL buffer AE in plaats van 200 μL.
   3. Herhaal de elutie eenmaal zoals beschreven in stap 11.1.2. Deze stap leidt tot een verhoogde totale DNA-opbrengst.
2. Dna-kwaliteit meten met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer (zie Materiaaltabel).
   1. Schakel de spectrofotometer in. Nadat het apparaat is geïnitialiseerd, selecteert u op de startpagina de optie dsDNA op het scherm.
   2. Til vervolgens de voetstukarm op en reinig de positie van het voetstuk met DI-water en pluisvrije doekjes.
   3. Pipetteer 2 μL van een blanco-oplossing, hier AE-buffer, op de voetstukpositie en breng de voetstukarm voorzichtig naar beneden en selecteer Leeg op het scherm.
   4. Til vervolgens het voetstuk op en reinig de positie van het voetstuk met DI-water om restmateriaal van de vorige meting te verwijderen.
   5. Plaats het monster (2 μL) op de voetstukpositie, breng de arm van het voetstuk naar beneden en selecteer de knop Meten op het scherm.
   6. Voer stap 11.2.4 en 11.2.5 opnieuw uit voor alle monsters.
   7. Zodra de meting is voltooid, selecteert u "Experimenten beëindigen" op het scherm. Plaats de flashdrive in het apparaat en druk op "Gegevens exporteren" op het scherm.

12. Bepaling van de levensvatbaarheid van cellen uit hydrogel- en microwell-extracten

1. Verdun de bacteriële suspensies met een verdunningsfactor van 10⁵ met behulp van een 96-well plaat.
2. Pipetteer 10 μL van de verdunde bacteriële suspensie en spot drie keer op ATGN-platen voor elke bacteriesuspensie.
3. Kantel de platen om de cellen op agaroppervlakken te verspreiden. Droog de ATGN-platen met de bacteriële suspensies aan de lucht.
4. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 48 uur. Tel en noteer de aantallen Colony Formation Units (CFU's). Tel alle drie de spreads van bacteriële suspensies op elke plaat.
   OPMERKING: Voer stappen 12.1-12.4 uit in een biologische veiligheidskast om verontreiniging van de plaat te voorkomen.

Results

Om het vermogen van UV-licht te onderzoeken om gecontroleerde hydrogeldegradatie voor celafgifte te veroorzaken, werden hydrogels eerst ingekapseld over thi geïsoleerde coverslips zonder dat er bacteriën aanwezig waren. Elke hydrogel werd blootgesteld aan drie replicerende cirkelpatronen van licht met verschillende intensiteiten en belichtingstijden. Het percentage geldegradatie werd berekend na blootstelling aan UV-licht bij elke lichtintensiteit en de blootstellingstijd werd vervolgens gekwantificeerd door hangertholgroepen te koppelen aan een fluoresceïne-5-maelimidekleurstof voor fluorescentiebeeldvorming^19,24. Een representatief voorbeeld van hoe deze twee parameters de afbraak van hydrogel beïnvloeden, is te zien in figuur 3. Zoals duidelijk is, biedt patroonlicht dat wordt geleverd door de patroonverlichtingstool ruimtelijk-temporele controle van hydrogeldegradatie met een resolutie die de afgifte van slechts een klein aantal cellen mogelijk maakt.

Figuur 3: Controle op de afbraak van hydrogel. Uv-lichtdosis en resulterende hydrogelafbraaksnelheid zijn afstembaar via de patroonverlichtingstool. (Inzet) Er werden twee verschillende lichtintensiteiten gekozen voor hydrogeldegradatie met patroon. Na blootstelling aan 365 nm UV-licht werden hydrogels gelabeld met fluoresceïne-5-maleimide voor fluorescentiebeeldvorming. Overgenomen (aangepast) met toestemming van Fattahi et al.¹⁹ Copyright 2020 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voor celextractie werden verschillende lichtpatronen gebruikt om de celafgifte te onderzoeken(figuur 4). Hier werden Agrobacterium-bacteriecellen ingekapseld in bulkhydrogels over thi geïsoleerde glazen coverslips en vervolgens gekweekt in kolonies op microschaal. Hydrogels werden vervolgens geïnspecteerd in brightfield-microscopie en gerichte microkolonies werden blootgesteld aan gevarieerde UV-lichtpatronen. Er werd waargenomen dat verschillende blootstellingspatronen de morfologie van de vrijgekomen cellen beïnvloedden. Dit is potentieel gunstig voor verschillende toepassingen. Het blootleggen van een ringpatroon rond de doelkolonie resulteert bijvoorbeeld in het vrijkomen van de hele kolonie die nog steeds is ingekapseld in een beschermende PEG-hydrogel en zonder directe blootstelling aan UV-licht(Figuur 4A),die cellen kan behouden en een gemakkelijke stroomafwaartse zuivering kan bieden. Door daarentegen een deel of de hele kolonie bloot te stellen aan UV-licht, kunnen cellen worden geëxtraheerd als geaggregeerde celclusters (figuur 4B) of als vrije, individuele cellen (figuur 4C).

Figuur 4: Controle over de morfologie van de geëxtraheerde cellen. (A) Gebruik van een ringpatroon om de hele celkolonie vrij te geven, beschermd in een PEG-matrix. (B) Gebruik van een gebroken kruispatroon voor celafgifte in aggregaten. (C) Gebruik van een kruispatroon om individuele cellen vrij te maken. Overgenomen (aangepast) met toestemming van Fattahi et al.¹⁹ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Cruciaal in het inkapselingsprotocol is zowel de celzaaidichtheid als de dikte van de hydrogel, omdat beide parameters het aantal cellen kunnen beïnvloeden dat ter observatie in de hydrogel is opgenomen. Om dit aan te tonen, werden A. tumefaciens-cellenmonsters ingekapseld in hydrogels van twee verschillende diktes met behulp van dunne afstandhouders (12,7 μm) of dikke afstandhouders (40 μm) gekweekt en afgebeeld volgens de vastgestelde protocollen. Dunnere hydrogels resulteerden in een microkoloniedichtheid van 90 kolonies/mm² in de hydrogel, waarbij minimale kolonieoverlapping werd waargenomen(figuur 5A). Hydrogeldiktes groter dan 12,7 μm resulteerden daarentegen in de vorming van overlappende kolonies in verticale richting(figuur 5B),wat kan resulteren in de extractie van meerdere kolonies. Overlappende kolonies kunnen kruisbesmetting veroorzaken tijdens de extractie vanwege de tweedimensionale aard van het lichtpatroon. Zo kan een topkolonie worden geviseerd, terwijl er ook een onderliggende kolonie mee wordt geëxtraheerd(figuur 5C). Daarom wordt het gebruik van afstandhouders van 12,7 μm aanbevolen voor hydrogelbereiding.

Figuur 5: De dikte van de hydrogel beïnvloedt de extractiezuiverheid. Doorgebruik te maken van afstandhouders met een dikte van 12,7 μm voor hydrogelvorming, worden kolonies gevormd binnen één 10x brandpuntsvlak. (B) Overlay van kolonies kan worden waargenomen bij 10x vergroting als afstandhouders met grotere diktes dan 12,7 μm worden gebruikt. (C) Kruisbesmetting kan optreden met een overlay van kolonies tijdens het vrijkomen van cellen: (i) een ringpatroon wordt gebruikt om een gerichte celkolonie vrij te geven, (ii) de beoogde celkolonie wordt losgemaakt van de hydrogel en (iii) een tweede, onderliggende kolonie wordt waargenomen tijdens de blootstelling aan licht onder de beoogde kolonie. Ook deze kolonie wordt verwijderd, met kruisbesmetting tot gevolg. Overgenomen (aangepast) met toestemming van Fattahi et al.¹⁹ Copyright 2020 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gezien de potentiële schade aan bacteriën met UV-licht, werd het effect van gevarieerde UV-lichtmicropatronen op de levensvatbaarheid van cellen verder bestudeerd met behulp van model, Gram-positieve bacteriën (B. subtilis) en model, Gram-negatieve bacteriën (E. coli). Elk werd ingekapseld in bulkhydrogels en gekweekt in kolonies op microschaal volgens standaardprotocollen, waarbij hun compatibiliteit met de hydrogel werd geverifieerd. Gerichte microkolonies van equivalente grootte (26 ± diameter van 1 μm) werden vervolgens blootgesteld aan een constante lichtdosis (168 mJ / mm²), hetzij in de vorm van cirkelpatronen die hele microkolonies blootstellen aan UV-licht of kruispatronen die alleen hydrogelranden afbreken om blootstelling aan licht aan cellen te minimaliseren. Cellen werden vervolgens teruggevonden en verguld om de CFU / ml te kwantificeren die van elke kolonie werd teruggevonden. Er werd geen significant verschil in celherstelniveau gevonden(figuur 6A). Om de zuiverheid van de geëxtraheerde cellen verder te onderzoeken, werd DNA geëxtraheerd uit E. coli-monsters en geanalyseerd met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer. Voor beide patronen vallen DNA-kwaliteitsniveaus binnen een A₂₆₀/ A_280-bereik tussen 1,8 en 2,0 (figuur 6B), wat in het ideale bereik ligt voor genomische sequencing²⁵. Dit toont aan dat de UV-patronen die worden gebruikt voor afgifte onder de beschreven omstandigheden een minimaal effect hebben op de hoeveelheid levensvatbare cellen die worden teruggewonnen uit de bulkhydrogels of op de genomische DNA-kwaliteit na extractie.

Figuur 6: Impact van verschillende lichtblootstellingspatronen op de levensvatbaarheid van cellen en de DNA-kwaliteit van bacteriën die vrijkomen uit bulkhydrogels. (A) Celherstelniveaus voor zowel E. coli als B. subtilis na extractie met behulp van kruispatronen en cirkelpatronen. Voor dit experiment werd extractie uitgevoerd uit bolvormige kolonies met dezelfde diameter (26 μm ± 1 μm) om ervoor te zorgen dat het aantal vrijgegeven cellen uit elke kolonie gelijkwaardig was. De geëxtraheerde oplossingen werden vervolgens verguld om de CFU / ml te berekenen die uit elk patroon werd verkregen. Statistische analyse toonde geen significant verschil in CFU/ml verkregen uit kruis- en cirkelpatronen voor zowel E. coli als B. subtilis (P-waarde > 0,05, n= 6 voor beide stammen). BSpectrofotometrische kwantificering van de DNA-kwaliteit voor geïsoleerde E. coli-cellen met behulp van kruis- en cirkelpatronen. Hier toonde statistische analyse geen significant verschil in DNA-kwaliteit voor de gebruikte patronen (P-waarde > 0,05, n = 6) (C) Brightfield-afbeeldingen van kolonies met gelijke diameters blootgesteld aan kruis- en cirkelpatronen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Microwell-arrays bieden een alternatieve, lab-on-a-chip screeninginterface die meer gecontroleerde screeningfuncties biedt in vergelijking met bulkhydrogels. Microwell-arrays maken het bijvoorbeeld mogelijk om bacteriën te zaaien in afzonderlijke kweekplaatsen waar het aantal cellen in het entmateriaal kan worden gecontroleerd. Geometrische kenmerken van microwells zoals diepte en diameter worden ook geregeld door middel van standaard microfabricagemethoden. Met deze voordelen zijn microwells nuttig geweest voor het bestuderen van bacteriegroei onder ruimtelijke opsluiting²⁶, en meest recent voor de ontdekking van symbiotische en antagonistische interacties tussen verschillende bacteriesoorten wanneer ze samen opgesloten zijn op microschaal¹⁸. Cellulaire extractie uit putten voor genomische analyse zoals 16S amplicon sequencing is van cruciaal belang voor deze toepassingen. Met behulp van hetzelfde hydrogelmateriaal kan UV-licht worden blootgesteld aan een put die interessante cellen bevat, hetzij als cirkel- ofringpatronen. Dit laatste zorgt alleen voor hydrogelafbraak aan de rand van de microwell om directe bestraling van cellen te voorkomen. Om dit aan te tonen, werden A. tumefaciens-cellen die mCherry tot expressie brachten in putten gezaaid, de hydrogel werd vervolgens aan de microwell-array bevestigd. Cellen werden gekweekt en vervolgens bestraald met cirkel- of ringpatronen. Het membraan werd vervolgens gekleurd met fluoresceïne-5-maleimidekleurstof. Tweekleurige fluorescentiebeelden onthulden dat zowel het membraan als de cellen in de putten worden verwijderd voor beide bestralingspatronen¹⁷. In tegenstelling tot het bulk hydrogel-formaat, is celextractie hier alleen waargenomen in de vorm van celclusters¹⁸.

Figuur 7: Representatieve confocale microscopiebeelden die de impact van lichtpatronen op celisolatie van microwell-arrays laten zien. (A) Microwells met een diameter van 40 μm die bacteriën (rood) bevatten na zaaien en kweken. (B) Belichting van licht met behulp van cirkel- en ringpatronen (blauw). (C) Verminderde rode fluorescentie toont aan dat cellen worden geëxtraheerd uit bestraalde putten. (D) Tweekleurig fluorescentiebeeld van membranen en bacteriën na bestraling, wat wijst op verwijdering van zowel de hydrogel (groen) als bacteriën (rood) uit doelputten. (E) Z-stack, tweekleurig fluorescentiebeeld van doelputten. De rode lijn in (D) geeft het xz-vlak aan dat is afgebeeld in (E) en de groene lijn in (E) geeft het xy-vlak aan dat is afgebeeld in (D). Monsters in afbeeldingen (C-E) werden gewassen voor verwijdering van vrijgegeven cellen, vervolgens gefixeerd en afgebeeld. Schaalbalk = 40 μm. Overgenomen (aangepast) met toestemming van van der Vlies et al.¹⁷. Copyright 2019 Amerikaanse chemische soceity. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de levensvatbaarheid van bacteriëncellen en DNA-kwaliteit na extractie in dit formaat te kwantificeren, werden B. subtilis- en E. coli-cellen gezaaid, gekweekt en vervolgens vrijgegeven uit microwell-arrays met behulp van cirkel- en ringpatronen(Figuur 8A,B). Vrijgegeven cellen werden vervolgens op ATGN-agarplaten geplateerd en de DNA-kwaliteit van de geëxtraheerde cellen werd gekwantificeerd. Om ervoor te zorgen dat er tijdens elke extractie een consistent aantal cellen aanwezig was, werden microwells met vergelijkbare fluorescerende intensiteiten (~ 6000 A.U.) en daarom een vergelijkbaar aantal cellen gericht op afgifte. Het aantal levensvatbare cellen geëxtraheerd met behulp van een cirkelpatroon verschilde niet significant van het aantal levensvatbare cellen geëxtraheerd met behulp van een ringpatroon voor beide bacteriën (Figuur 8C). Ook verschilden de DNA-kwaliteitsniveaus niet significant tussen de cirkel- en ringpatronen voor beide bacteriën(figuur 8D). Vandaar dat, vergelijkbaar met bevindingen in bulkhydrogels, de toepassing van UV-licht met de intensiteit en duur die hier zijn gespecificeerd, een verwaarloosbare invloed had op de levensvatbaarheid en DNA-kwaliteit van cellen die uit de microwell-arrays werden geëxtraheerd. Deze bevindingen tonen aan dat levensvatbare bacteriecellen selectief uit microwells kunnen worden gehaald met minimale schade voor downstream-analyse.

Figuur 8: Impact van verschillende lichtblootstellingspatronen op de levensvatbaarheid van cellen en de DNA-kwaliteit van bacteriën die vrijkomen uit microwell-arrays. (A,B) Voor zowel E. coli als B. subtiliswerden cirkelpatronen en ringpatronen gebruikt voor celextractie uit microwells van 10 μm. Cirkelpatroon met een diameter van 10 μm en ringpatroon met een binnendiameter van 10 μm en buitendiameter van 20 μm werden in dit experiment gebruikt voor celextractie. Microwells met dezelfde diameters werden gebruikt om ervoor te zorgen dat het aantal vrijgekomen cellen van elke microwell hetzelfde was. (C) De geëxtraheerde oplossingen werden vervolgens verguld om de kve/ml te berekenen die uit elk blootstellingspatroon werd verkregen. Statistische analyse toonde geen significant verschil in CFU/ml verkregen uit cirkel- en ringpatroon voor zowel E. coli als B. subtilis (P-waarde > 0,05, n = 6 voor beide stammen). (D) Spectrofotometrie werd gebruikt om de DNA-kwaliteit van zowel E. coli- als B. subtilis-cellen te meten met behulp van cirkel- en ringpatronen. Hier toonde statistische analyse geen significant verschil in de DNA-kwaliteit voor de gebruikte patronen (P-waarde > 0,05, n = 6 voor beide stammen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Ontwerp en fabricage van microwell arrays. (A) Standaard microfabricagetechnieken werden toegepast om microwell arrays op silicium wafers te fabriceren. (B) Elk substraat bestond uit 7 x 7 arrays van putten met een diameter van 10 μm met een diepte van 20 μm en een pitch van 30 μm. (C) Elke array bestond uit 225 microwells. Dit cijfer is gewijzigd van Barua et al.¹⁸. Copyright 2021 Frontiers Media. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Dit manuscript demonstreert het gebruik van fotodegradeerbare hydrogels voor het screenen en isoleren van bacteriën. Het materiaal en de aanpak maken een cultuur met hoge doorvoer, controle over groeimedia en groeiomstandigheden en schone en nauwkeurige celextractie op een eenvoudige en kosteneffectieve manier mogelijk. Extractie vereist alleen een fluorescerende microscoop in combinatie met het patroonverlichtingsgereedschap en kan op een sequentiële manier worden gedaan om meerdere celdoelen te isoleren. Elke extractie duurt 5-10 minuten om uit te voeren en tot 30 gerichte kolonies zijn verwijderd uit een enkele hydrogel. Een belangrijk voordeel van de aanpak is het aanpassingsvermogen aan een verscheidenheid aan verschillende testformaten, zoals hier wordt aangetoond met screening van zowel bulkhydrogels als microwell-arrays. Het scheidingsproces in beide formaten is met succes gebruikt om bacteriën te isoleren die uniek groeigedrag vertonen voor downstream genotypering na kweek en microscopische observatie, een kritisch vermogen voor het verbinden van celgenotype met fenotype. Tot op heden hebben genomische karakteriseringen van bacteriën geëxtraheerd uit deze interfaces 16S amplicon sequencing opgenomen om multi-species collecties van bacteriën uit omgevingsmicrobiomen te identificeren die emergent groeigedrag genereren¹⁸, en voor whole-genome sequencing om met succes genetische mutaties te identificeren die zeldzame groeiprofielen veroorzaken in cellen die aanwezig zijn in mutantenbibliotheken¹⁹.

Het gebruik van bulkhydrogels voor celscreening en isolatie is het meest eenvoudige en eenvoudige formaat. Bulk fotoafbreekbare hydrogels vormen zich snel (25 min) na het mengen van de voorlopers over transparante glazen coverslips om cellen in te kapselen in een 3D-celkweekmatrix die wordt afgebeeld met een standaard rechtopstaande of omgekeerde fluorescentiemicroscoop. De methode heeft dus het potentieel om translationeel te zijn naar gemeenschappelijke microbiologische laboratoria die geen microfabricagebronnen of expertise hebben. Een nadeel van dit formaat is dat cellen willekeurig georiënteerd zijn over de driedimensionale hydrogel. Daarom kunnen cellen uit het brandpuntsvlak verschijnen bij beeldvorming met hogere vergrotingsdoelstellingen en extractie kan moeilijk zijn als celkolonies te dicht bij elkaar zijn georiënteerd of als er een verticale overlay van kolonies is. Het afzetten van een dunne hydrogel (<13 μm) zoals beschreven is van cruciaal belang om dit nadeel te verminderen. Blootstelling aan gebroken kruislichtpatronen (figuur 4B) heeft hier de voorkeur, omdat dit patroon resulteert in cellen vrij van de hydrogel die minimale blootstelling aan UV-licht hebben en gemakkelijk kunnen worden teruggewonnen door plating.

Daarentegen biedt het microwell array-formaat een beter gecontroleerde interface, omdat bacteriecellen worden verdeeld in discrete microwells die dienen als kleine cultuur of co-culturen sites^17,18,26. Microwell dimensie, toonhoogte en dichtheid zijn nauwkeurig vervaardigd met behulp van standaard fotolithografische technieken. In vergelijking met bulkhydrogels kunnen bacteriën worden geëxtraheerd uit microwell-arrays met een hogere mate van specificiteit en een lagere kans op kruisbesmetting, omdat de cellen alleen aanwezig zijn op vooraf gedefinieerde locaties, niet willekeurig verspreid over de hydrogel. De concentratie en verhoudingen van bacteriecellen in de zaaioplossing kunnen ook worden gevarieerd om de hoeveelheid en samenstelling van het microwell-entmateriaal te regelen door middel van een zaaiproces dat is gekarakteriseerd in eerdere rapporten²⁶, waardoor de gebruiker flexibiliteit krijgt in het experimentele ontwerp van het scherm. Het belangrijkste nadeel van screening met het microwell array-formaat is de extra tijd en expertise die nodig is voor microfabricage. De fabricage van microwells kostte naar schatting ~ $ 10 per array, inclusief materiaalkosten en cleanroomkosten. Bovendien worden microwells-arrays traditioneel gemaakt van silicium, wat beeldvormingsproblemen kan veroorzaken omdat de substraten niet transparant zijn. Bovendien kan een grote hoeveelheid lichtverstrooiing van het siliciumoppervlak de beeldvorming binnen de microwells beperken en de patroonresolutie tijdens blootstelling aan hydrogel verminderen met UV-licht van het patroonverlichtingsgereedschap (te zien in figuur 8A,B). Soortgelijke microwells zijn vervaardigd op transparante kwartssubstraten om dit soort beperkingen aan te pakken²⁷; deze fabricage is echter aanzienlijk moeilijker. Blootstelling aan ringpatronen die de omtrek van de put verlichten, heeft hier de voorkeur om vrije cellen uit de putten vrij te maken en tegelijkertijd uv-blootstelling te minimaliseren.

Het meest voorkomende probleem dat in beide formaten optreedt, is het losmaken van de hydrogel van het onderliggende substraat tijdens het kweken als gevolg van hydrogelzwelling. Als dit een probleem is voor bulkhydrogels, moeten de aanwezigheid, dichtheid en uniformiteit van thiolgroepen in de chemische (MTPS) bevestigingslaag over het oppervlak van de basisglasafdekkingslip worden geverifieerd met behulp van een geschikte oppervlaktekarakteriseringstechniek (XPS, ATR-FTIR, AFM, enz.). Lage dichtheden van oppervlaktetholgroepen als gevolg van inefficiënte oppervlaktefunctionalisatie kunnen leiden tot een zwakke interactie tussen het substraat en de hydrogel. Als een laag niveau van oppervlaktetholatie optreedt, moet de stabiliteit van de MTPS-oplossing worden gecontroleerd. Bij de eerste reiniging van de glasplaat moet ervoor worden gezorgd dat er voorafgaand aan de MTPS-behandeling een schoon oppervlak ontstaat, en er moet voor worden gezorgd dat watervrij tolueen wordt gebruikt tijdens de MTPS-oppervlaktereactie (protocolsectie 4). In het geval van microwell-arrays worden oppervlakken niet ge thioleerd en hechten hydrogels zich in plaats daarvan door de gedeeltelijke vulling van de putten met de hydrogel, die de hydrogel verankert aan het siliciumsubstraat¹⁷. Als hydrogelloslating een probleem is in dit systeem, kunnen meer microwells of andere microschaalfuncties in de array worden geëtst om de hydrogel verder aan het substraat te verankeren om een sterkere hechting te bevorderen.

Een beperking van de techniek in beide formaten is de beperkte stabiliteit van de hydrogels in aanwezigheid van bacteriën. Er is opgemerkt dat sommige bacteriën, zoals A. tumefaciens, de hydrogel in de loop van 5-7 dagen^17,19kunnen afbreken, wat de experimenteertijd beperkt. Het huidige onderzoek naar de mechanismen van bacteriële afbraak is aan de gang; er wordt verondersteld dat de estergroepen die aanwezig zijn uit de diacrylaatmonomeren onderhevig zijn aan door bacteriën gemedieerde hydrolyse en/of enzymatische afbraak, zoals opgemerkt in andere systemen¹⁷. Het ontwikkelen van stabielere hydrogelchemie zal de tijd verlengen dat bacteriën in de hydrogel kunnen blijven en zal het scherm uitbreiden naar micro-organismen met langzamere groeisnelheden. Een tweede beperking is dat in beide formaten celterugwinning en -extractie plaatsvinden in een open omgeving, wat resulteert in relatief hoge extractievolumes (30-100 μL), die gevoelig kunnen zijn voor verontreiniging van buitenaf. Er moet dus voor worden gezorgd dat er voldoende cellen aanwezig zijn uit de doelkolonies, terwijl het volume van de extractieoplossing wordt geminimaliseerd. Om voldoende cellen te verkrijgen voor plating en herstel of voor extractie van DNA-materiaal, werd waargenomen dat in bulkhydrogels cellen lang genoeg moeten worden gekweekt om koloniediameters van ten minste 10 μm te bereiken. Om het vereiste volume voor celextractie te verlagen, werd waargenomen dat het gebruik van een microliterspuit en -slang (figuur 2) efficiënter was dan pipetteren. Met de buizen konden de isolaten nauwkeuriger van het afgiftepunt worden getrokken, waardoor minder oplossingsvolume nodig was en de kans op verontreiniging werd verlaagd.

Toekomstig werk omvat het begrijpen van het effect van hydrogel mechanische eigenschappen op celgroei, aangezien mechanische kenmerken van deze hydrogels goed worden gecontroleerd door de selectie van geschikte PEG-gebaseerde monomeerprecursoren van verschillende molecuulgewichten²⁸, en mechanische interacties spelen waarschijnlijk een belangrijke rol in het gedrag van bacteriën²⁹. Omdat de hydrogelmaterialen gemakkelijk kunnen worden opgenomen in een verscheidenheid aan verschillende systemen en apparaten, is de verdere ontwikkeling ook gericht op de integratie van dit materiaal in microfluïdische systemen. Dit zou de extractieoplossing reduceren tot femtoliter tot picoliter volumes, vergeleken met traditionele 30-100 μL volumes die momenteel nodig zijn in het open collectieformaat. Kleinere oplossingsvolumes zouden de potentiële besmetting aanzienlijk verminderen en de benadering van eencellige isolatie en karakterisering verplaatsen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Mercaptopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	175617-25G	> 95%
Alconox detergent powder	Alconox	1104
Ammonium sulfate	Fisher Chemical	A702-500	Certified ACS Granular
Autoclave SK300C	Yamato Scientific	18016
Bacillus subtilis 1A1135	Bacillus Genetic Stock Center	1A1135
Brightfield upright microscope	Olympus Corporation	BX51
Calcium chloride, anhydrous	Fisher Chemical	C614-500	For Desiccators Pellets, 4-20 Mesh
Centrifuge 5702	Eppendorf	5702
Citric acid monohydrate	Sigma-Aldrich	C1909-500G	ACS reagent, > 99.0%
D-Glucose (Dextrose)	VWR Amresco Life Science	0188-1KG
Dneasy Blood & Tissue Kit	Qiagen	69504	DNA purification kit
DOWSIL 184 silicone elastomer base	Dow Silicones Corporation		Opslagtemperatuur: -30-60 °C
DOWSIL 184 silicone elastomer curing agent	Dow Silicones Corporation		Opslagtemperatuur: < 32 C
EPOCH2 microplate spectrophotometer	BioTek Instruments	EPOCH2
Escherichia coli ATCC 25922	Thermo Fisher Scientific	R19020
Ethanol, anhydrous	Fisher Chemical	459844
Fisherbrand microscope cover glass	Fisher Scientific	12540A
Fisherfinest premium microscope slides plain	Fisher Scientific	12-544-4
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763-500ML	Bevat remmer, 30 wt% in H2O
Incu-Shaker Mini	Benchmark	E5-0014-01
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
Magnesium sulfate, 7-hydrate	Macron Fine Chemicals	6066-04	Avantor Performance Materials, Inc.
Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L	ACS reagent, > 99.8%
NanoDrop One spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-ONEC-W
Nitrogen, compressed	Matheson	UN1066
Oxygen plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001-HP
Pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene (4 arm-PEG)	NOF America Corporation	PTE-100SH	Sunbright-PTE-100SH
Phosphate buffered saline (PBS), 10X	VWR Amresco Life Science	K813-500ML	Bewaar tussen 15 °C–30 °C
Polydimethyl siloxane (PDMS) Slygard 184	Dow Corning	4019862
Polygon400	Mightex	DSI-D-000
Premium microscope slides	Fisher Scientific	12-544-4	25 x 75 x 1 mm
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-500G
Sodium chloride	Sigma Life Science	S5886-500G	Bioreagent, geschikt voor celcultuur
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045-500G	BioXtra, > 98%, pellets (watervrij)
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Sigma-Aldrich	71505-250G	BioUltra, voor moleculaire biologie, > 99.0% (T)
Stainless steel thickness gage	Precision Brand Products	77739
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	320501-2.5L
Toluene, anhydrous, 99.8%	Sigma-Aldrich	244511-1L	Anhydrous, > 99.8%
Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooctyl) silane (TPS), 97%	Sigma-Aldrich	448931-10G
Tryptic soy broth	Sigma-Aldrich	22092-500G	Voor microbiologie
Super Nuova Digital Hot Plate Stirrer	Thermo Scientific	S131825
Ultrasonic sonicator	Fischer Scientific	FS-110H