Methodenartikel

Directe en indirecte kweekmethoden voor het bestuderen van biologisch afbreekbare implantaatmaterialen in vitro

4.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63065

⸱

15 april 2022

 ,  ,  , 
1Materials Science and Engineering Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Stem Cell Center, University of California, Riverside

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We introduceren drie methoden van directe kweek, directe blootstellingscultuur en blootstellingscultuur voor het evalueren van de in vitro cytocompatibiliteit van biologisch afbreekbare implantaatmaterialen. Deze in vitro methoden bootsen verschillende in vivo cel-implantaat interacties na en kunnen worden toegepast om verschillende biologisch afbreekbare materialen te bestuderen.

Samenvatting

In de afgelopen decennia zijn biologisch afbreekbare materialen uitgebreid onderzocht voor biomedische toepassingen zoals orthopedische, tandheelkundige en craniomaxillofaciale implantaten. Om biologisch afbreekbare materialen voor biomedische toepassingen te screenen, is het noodzakelijk om deze materialen te evalueren in termen van in vitro celresponsen, cytocompatibiliteit en cytotoxiciteit. De normen van de Internationale Organisatie voor Standaardisatie (ISO) zijn op grote schaal gebruikt bij de evaluatie van biomaterialen. De meeste ISO-normen zijn echter oorspronkelijk vastgesteld om de cytotoxiciteit van niet-afbreekbare materialen te beoordelen, waardoor de waarde voor het screenen van biologisch afbreekbare materialen beperkt is.

Dit artikel introduceert en bespreekt drie verschillende kweekmethoden, namelijk directe kweekmethode, directe blootstellingscultuurmethode en blootstellingscultuurmethode voor het evalueren van de in vitro cytocompatibiliteit van biologisch afbreekbare implantaatmaterialen, waaronder biologisch afbreekbare polymeren, keramiek, metalen en hun composieten, met verschillende celtypen. Onderzoek heeft aangetoond dat kweekmethoden de celrespons op biologisch afbreekbare materialen beïnvloeden omdat hun dynamische afbraak spatiotemporale verschillen induceert op het grensvlak en in de lokale omgeving. In het bijzonder onthult de directe kweekmethode de reacties van cellen die rechtstreeks op de implantaten zijn gezaaid; de methode voor het kweken van directe blootstelling verduidelijkt de reacties van gevestigde gastheercellen die in contact komen met de implantaten; en de blootstellingscultuurmethode evalueert de gevestigde gastheercellen die niet in direct contact staan met de implantaten, maar worden beïnvloed door de veranderingen in de lokale omgeving als gevolg van degradatie van het implantaat.

Dit artikel geeft voorbeelden van deze drie kweekmethoden voor het bestuderen van de in vitro cytocompatibiliteit van biologisch afbreekbare implantaatmaterialen en hun interacties met beenmerg-afgeleide mesenchymale stamcellen (BMSCs). Het beschrijft ook hoe te oogsten, passeren, kweken, zaaien, fixeren, kleuren, karakteriseren van de cellen en het analyseren van postculturele media en materialen. De in vitro methoden die in dit artikel worden beschreven, bootsen verschillende scenario's van de in vivo omgeving na, waardoor de toepasbaarheid en relevantie van in vitro cytocompatibiliteitstests van verschillende biomaterialen voor verschillende biomedische toepassingen wordt verbreed.

Inleiding

Al tientallen jaren worden biologisch afbreekbare materialen uitgebreid bestudeerd en gebruikt in biomedische toepassingen zoals orthopedische1,2, dental3,4 en craniomaxillofaciale5 toepassingen. In tegenstelling tot permanente implantaten en materialen, worden biologisch afbreekbare metalen, keramiek, polymeren en hun composieten in de loop van de tijd geleidelijk afgebroken in het lichaam via verschillende chemische reacties in de fysiologische omgeving. Biologisch afbreekbare metalen zoals magnesium (Mg) legeringen1,6,7 en zink (Zn) legeringen8,9 zijn bijvoorbeeld veelbelovende materialen voor botfixatie-apparaten. Hun biologische afbreekbaarheid zou de noodzaak voor secundaire operaties om de implantaten na botgenezing te verwijderen, kunnen elimineren. Biologisch afbreekbare keramiek zoals calciumfosfaatcementen (CPC's) hebben een opwindend potentieel getoond voor de behandeling van osteoporotische wervelcompressiefracturen bij percutane kyphoplastie10. De CPC's bieden mechanische ondersteuning voor het gebroken wervellichaam en degraderen geleidelijk nadat de fractuur is genezen.

Biologisch afbreekbare polymeren, zoals sommige polysacchariden en polyesters, zijn ook op grote schaal onderzocht voor biomedische toepassingen. Chitosan hydrogel als biologisch afbreekbare polysaccharide heeft bijvoorbeeld zijn mogelijkheden getoond voor het voorkomen van infecties en het regenereren van huidweefsel11. Poly-L-melkzuur (PLLA), poly (glycolzuur) (PGA) en poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) zijn veel bestudeerde polyesters voor het fabriceren van 2D- of 3D-poreuze steigers voor weefselmanipulatietoepassingen12,13,14. Bovendien integreren composietmaterialen twee of meer fasen van metalen, keramiek en polymeren om geavanceerde functies te bieden voor een breed scala aan biomedische toepassingen15,16,17. PLGA- en calciumfosfaatcomposieten kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om biologisch afbreekbare steigers te fabriceren voor toepassingen zoals het repareren van schedelbotdefecten18. Deze biologisch afbreekbare steigers en implantaten kunnen de groei van cellen en weefsels ondersteunen en bevorderen en vervolgens geleidelijk in het lichaam afbreken in de loop van de tijd.

Zoals weergegeven in aanvullende tabel 1, kunnen verschillende biologisch afbreekbare materialen verschillende afbraakmechanismen, producten en snelheden hebben. Magnesiumlegeringen, zoals Mg-2 wt % Zn-0,5 wt % Ca (ZC21)1, Mg-4 wt% Zn-1 wt% Sr (ZSr41)19 en Mg-9 wt% Al-1 wt% Zink (AZ91)20, worden bijvoorbeeld afgebroken door te reageren met water, en hun afbraakproducten omvatten voornamelijk Mg2 + -ionen, OH-ionen, H2-gas en minerale afzettingen. De afbraaksnelheid voor biologisch afbreekbare metalen varieert afhankelijk van hun verschillende samenstellingen, geometrieën en degradatieomgevingen. Cipriano et al.19 rapporteerden bijvoorbeeld dat ZSr41-draden (Ø1,1 × 15 mm) 85% massa verloren, terwijl zuivere Mg-draden met dezelfde geometrie 40% massa verloren na 47 dagen in het scheenbeen van de rat te zijn geïmplanteerd. Biologisch afbreekbare keramische materialen zoals hydroxyapatiet (HA) en β-tricalciumfosfaat (β-TCP) kunnen afbreken via oplossingsgestuurde extracellulaire vloeistofoplossing of afbreken in kleine deeltjes en vervolgens afbreken via zowel extracellulaire vloeistofoplossing als celgemedieerde resorptieprocessen. De afbraakproducten van deze op calciumfosfaat gebaseerde keramiek kunnen Ca2+ ionen, (PO4)3-ionen, OH-ionen en minerale afzettingen21 omvatten. De afbraaksnelheid voor calciumfosfaatkeramiek wordt aanzienlijk beïnvloed door hun kristalstructuren. Van Blitterswijk et al.22 rapporteerden bijvoorbeeld dat HA met 40 vol.% microporiën geen massa verloor, terwijl β-TCP met 40 vol.% microporiën 30 ± 4% massa verloren na gedurende 3 maanden in het scheenbeen van konijnen te zijn geïmplanteerd. Polymeren zoals PLGA14,23 kunnen afbreken als gevolg van hydrolyse van de esterbindingen in aanwezigheid van water, en de afbraakproducten omvatten voornamelijk melkzuur en glycolzuren. Het kan een maand duren voor PLGA 50/50 en enkele maanden voordat PLGA 95/5 volledige degradatie heeft bereikt24.

Celrespons en cytocompatibiliteitstests zijn van cruciaal belang om deze biologisch afbreekbare implantaatmaterialen voor biomedische toepassingen te evalueren en te screenen. De huidige normen van de International Organization for Standardization (ISO), zoals ISO 10993-5:2009 "Biological evaluation of medical devices-Part 5 Tests for in vitro cytotoxicity", waren echter in eerste instantie ontworpen om de cytotoxiciteit van niet-afbreekbare biomaterialen zoals Ti-legeringen en Cr-Co-legeringen in vitro te beoordelen25. In het bijzonder heeft ISO 10993-5:2009 alleen betrekking op de in vitro cytotoxiciteitstests van het extract, direct contact en indirecte contacttests. Bij de extracttest wordt het extract bereid door monsters onder te dompelen in extractievloeistoffen zoals kweekmedia met serum en fysiologische zoutoplossingen onder een van de standaardtijd- en temperatuuromstandigheden. Het verzamelde extract of verdunning wordt vervolgens toegevoegd aan de celkweek om cytotoxiciteit te bestuderen. Voor de test met direct contact wordt direct contact tussen monster en cellen bereikt door het testmonster op de vastgestelde (verkleefde) cellaag te plaatsen. Bij de indirecte contacttest worden de kweekmedia die serum en gesmolten agar bevatten, gepipetteerd om de gevestigde cellen te bedekken. Het monster wordt vervolgens op de gestolde agarlaag geplaatst, met of zonder filter.

De ISO-normen hebben enkele beperkingen laten zien wanneer ze worden toegepast om biologisch afbreekbare materialen in vitro te evalueren. In tegenstelling tot niet-afbreekbare materialen, is het afbraakgedrag van biologisch afbreekbare materialen dynamisch en kan het op een ander moment of in verschillende omgevingsomstandigheden veranderen (bijv. Temperatuur, vochtigheid, mediasamenstelling en celtype). De extracttest evalueert alleen de cytotoxiciteit van de afbraakproducten van het materiaal en weerspiegelt niet het dynamische proces van monsterafbraak. Zowel directe als indirecte contacttests van de ISO-norm karakteriseren alleen de interacties tussen de gevestigde cellen en monsters. Bovendien bevinden de materialen en cellen zich in de indirecte contacttest in verschillende micro-omgevingen die de in vivo omgeving niet weerspiegelen en de dynamische afbraak van biologisch afbreekbare materialen niet opvangen.

Het doel van dit artikel is om de cytocompatibiliteitstestmethoden voor verschillende biologisch afbreekbare implantaatmaterialen te introduceren en te bespreken om de bovengenoemde beperkingen van de methoden beschreven in de huidige ISO-normen aan te pakken. De methoden die in dit artikel worden gepresenteerd, houden rekening met het dynamische afbraakgedrag van implantaatmaterialen en de verschillende omstandigheden van cel-materiaalinteracties in vivo. In het bijzonder biedt dit artikel drie cytocompatibiliteitstestmethoden, namelijk directe kweek, directe blootstellingscultuur en blootstellingscultuur voor verschillende biologisch afbreekbare materialen, waaronder biologisch afbreekbare polymeren, keramiek, metalen en hun composieten voor medische implantaattoepassingen.

Bij de directe kweekmethode worden cellen die in de kweekmedia zijn gesuspendeerd, direct op de monsters gezaaid, waardoor de interacties tussen nieuw gezaaide cellen en de implantaten worden geëvalueerd. In de directe blootstellingscultuur worden de monsters direct op de gevestigde cellaag geplaatst om de interacties van implantaten met gevestigde gastheercellen in het lichaam na te bootsen. In de blootstellingscultuur worden de monsters in hun respectieve putinzetstukken geplaatst en vervolgens geïntroduceerd in de kweekputten met gevestigde cellen, wat de reacties van gevestigde cellen op de veranderingen in de lokale omgeving karakteriseert die worden veroorzaakt door implantaatdegradatie wanneer ze geen direct contact hebben met implantaten. De methoden voor directe kweek en directe blootstelling evalueren de cellen die direct of indirect in contact komen met de implantaatmaterialen in dezelfde kweekput. De blootstellingscultuur kenmerkt de cellen indirect in contact met de implantaatmaterialen binnen een voorgeschreven afstand in dezelfde kweekput.

Dit artikel presenteert een gedetailleerde beschrijving van de cytocompatibiliteitstests voor verschillende biologisch afbreekbare materialen en hun interacties met modelcellen, dat wil zeggen van beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen (BMSCs). De protocollen omvatten het oogsten, kweken, zaaien, fixeren, kleuren en beeldvorming van de cellen, samen met analyses van postculturele materialen en media, die van toepassing zijn op een verscheidenheid aan biologisch afbreekbare implantaatmaterialen en een breed scala aan celtypen. Deze methoden zijn nuttig voor het screenen van biologisch afbreekbare materialen voor verschillende biomedische toepassingen in termen van celresponsen en cytocompatibiliteit in vitro.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of California at Riverside (UCR) voor het oogsten van cellen en weefsels. Een 12 weken oude vrouwelijke Sprague-Dawley (SD) rat wordt als voorbeeld getoond in de video. Jongere vrouwelijke en mannelijke ratten hebben de voorkeur.

1. Bereiding van de celkweek

OPMERKING: De drie kweekmethoden die in dit artikel worden beschreven, zijn algemeen toepasbaar voor verschillende celtypen die aanhangen. Hier zullen BMSC's geoogst van speenvogels van ratten worden geïntroduceerd als voorbeeld voor celkweekvoorbereiding. Afhankelijk van hun relevantie voor specifieke medische toepassingen, kunnen verschillende celtypen worden gebruikt, waaronder primaire cellen geoogst van dieren of menselijke donoren en cellijnen uit een cel / weefselbank.

  1. Bms'en oogsten van spenen van ratten
    OPMERKING: Het schematische diagram in figuur 1 toont de stappen om BMSC's te oogsten van speenvogels.
    1. Euthanaseer de Sprague Dawley (SD) rat door CO2-inademing .
    2. Verwijder de huid en spieren en bindweefsels om het dijbeen uit de geëuthanaseerde rat te ontleden. Plaats de femorale botten in een conische buis van 15 ml (polypropyleen) met celkweekmedium. Plaats de conische buizen op ijs tot het moment van het uitvoeren van celextractie.
      OPMERKING: Tibia kan ook worden gebruikt om BMSC's te oogsten. Het celkweekmedium is Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (P/S).
    3. Breng de botten over naar een petrischaaltje in de biologische veiligheidskast. Snijd de uiteinden van het bot met een chirurgisch mes en spoel het beenmerg in een conische buis van 50 ml (polypropyleen) door de beenmergholte te wassen met celkweekmedia met behulp van een spuit met een naald van 251/2 G.
      OPMERKING: Steek een spuit met een naald van 18 G in de media met beenmerg. Neem langzaam en voorzichtig de media op en doseer deze om het grote stuk merg uit elkaar te breken totdat er geen zichtbare cel / weefselagglomeraten aanwezig zijn.
    4. Filtreer de celsuspensie met behulp van een filter van 70 μm, gevolgd door centrifugering bij 126 × g (1.000 tpm) gedurende 5 minuten om de celkorrels te krijgen.
    5. Zuig de bovennatuurlijke media aan en vul aan met 10 ml verse media. Pipetteer voorzichtig op en neer om de cellen opnieuw te suspenderen met behulp van een serologische pipet van 10 ml.
    6. Pipetteer de suspensie direct aan de binnenkant van een T-75 kolf en voeg media toe om het volume tot 25 ml te brengen. Kweek de cellen in een incubator in een standaard steriele celkweekomgeving (d.w.z. 37 °C, bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 en 95% lucht).
    7. Spoel na 3-7 dagen de niet-schadelijke cellen weg door het oude medium aan te zuigen en aan te vullen met vers medium. Ga door met het kweken en voeden van de cellen met vers medium totdat ze klaar zijn voor celpassage, bevriezing of gebruik in een experiment.
  2. Cel onderhoud
    1. Verander het celkweekmedium regelmatig om cellulaire afvalproducten te verwijderen en vul de voedingsstoffen ongeveer om de andere dag aan totdat de cellen 90% -100% confluent zijn. Bij 90% confluentie, passage, bevriezing of gebruik de cellen in een experiment.
    2. Passerende cellen
      OPMERKING: Passaging, ook wel subculturing genoemd, is een term die van toepassing is wanneer cellen van de ene cultuur naar de andere worden overgebracht. Vers geoogste cellen bevinden zich in passagestadium 0 (P0). De in dit artikel beschreven hoeveelheden trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (trypsine-EDTA) en media zijn voor een T-75-kolf.
      1. Controleer de cellen onder een optische microscoop om te bevestigen dat de cellen voor 90% uit confluent bestaan.
      2. Zuig het medium op uit de celkolf.
      3. Doseer 10 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in de kolf met behulp van een serologische pipet. Schommel de kolf voorzichtig om de cellen met PBS te spoelen; aspirateer alle PBS.
        OPMERKING: Deze stap dient als een extra spoeling om ervoor te zorgen dat er geen dode cellen of cellulair afval worden overgedragen tijdens het passeren.
      4. Doseer 3 ml trypsine-EDTA in de celkolf rechtstreeks op het oppervlak van de cellen. Laat de kolf voorzichtig schommelen om ervoor te zorgen dat het hele oppervlak met de cellen wordt bedekt door de trypsine-EDTA.
      5. Plaats de celkolf met trypsine-EDTA gedurende 5 minuten in de incubator om de cellen los te maken.
      6. Controleer na 5 minuten in de incubator de cellen onder een optische microscoop om te bevestigen dat de cellen zijn losgemaakt. Als sommige cellen niet zijn losgemaakt, tikt u voorzichtig op de zijkant van de celkolf en controleert u de kolf opnieuw.
      7. Voeg 9 ml vers medium toe aan de celkolf om de trypsine-EDTA te verdunnen. Dit biedt meer toegankelijke eiwitten voor de trypsine-EDTA om aan te binden in plaats van de cellen te liegen.
      8. Pipetteer de cellen in media en trypsine-EDTA en doseer ze in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de cellen bij 126 × g (1.000 rpm) gedurende 5 minuten.
      9. Zonder de celkorrel te verstoren, zuigt u het medium op met trypsine-EDTA.
      10. Voeg 5-10 ml verse media toe aan de centrifugebuis en resuspend de cellen in het medium voorzichtig met een serologische pipet van 10 ml.
      11. Pipetteer de cellen die in medium uit de centrifugebuis zijn gesuspendeerd en splits het volume in 2-3 verse kweekkolven. Voeg voldoende medium toe om het totale mediumvolume op 25 ml voor elke kolf te brengen.
        OPMERKING: De split ratio tijdens subcultuur kan variëren afhankelijk van de celtypen en specifieke groeikenmerken.
      12. Controleer de cellen onder een optische microscoop en plaats ze terug in de couveuse.
    3. Cellen invriezen
      1. Controleer de cellen onder een optische microscoop om te bevestigen dat de cellen voor 90% uit confluent bestaan.
      2. Herhaal stap 1.2.2.2 tot en met 1.2.2.9.
      3. Voeg 900 μL vers medium toe aan de centrifugebuis met een micropipette van 100-1000 μL. Langzaam en voorzichtig resuspend cellen in medium met behulp van dezelfde micropipette.
      4. Breng de 900 μL celsuspensie over in een cryoviaal. Voeg 100 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toe.
      5. Plaats het cryoviaal zo snel mogelijk in een cilindrische schuimcontainer die is ontworpen om de temperatuurdaling te regelen (zie de tabel met materialen). Plaats de schuimcontainer in de -80 °C vriezer.
    4. Cellen ontdooien
      1. Ontdooi de bevroren cellen in het waterbad. Neem een steriele conische buis van 15 ml gevuld met 5 ml vers medium, plaats de cellen in de conische buis en centrifugeer bij 126 × g (1.000 tpm) gedurende 5 minuten.
      2. Aspirateer het medium dat DMSO bevat.
      3. Voeg 5-10 ml vers medium toe aan de conische buis van 15 ml cellen. Pipetteer langzaam en voorzichtig op en neer om de cellen opnieuw op te suspenderen.
      4. Pipetteer de cellen die in medium zijn gesuspendeerd uit de conische buis van 15 ml en doseer in een nieuwe T-75-kolf. Gebruik bij het doseren van cellen een veegbeweging om de cellen zo gelijkmatig mogelijk over de bodem van de celkolf te verdelen.
      5. Voeg voldoende vers medium toe om het totale medium volume op 25 ml te brengen voor elke T-75 kolf.
      6. Controleer de cellen onder een optische microscoop en plaats de celkolf terug in de couveuse.

2. Monstervoorbereiding en sterilisatie

  1. Monstervoorbereiding
    1. Gebruik met weefselkweek behandelde platen zoals 6, 12, 24, 48 of 96-well platen voor celkweekexperimenten die in dit artikel worden beschreven. Selecteer het type weefselkweekplaten en het volume van het medium in elke put op basis van verschillende experimentele ontwerpen, zoals de monsterdimensie.
  2. Steriliseer of desinfecteer alle biologisch afbreekbare monsters vóór de celkweek.
    OPMERKING: Desinfectie is acceptabel voor in vitro onderzoeken wanneer de monsters gevoelig zijn voor chemische en/of oppervlakteveranderingen onder bepaalde sterilisatieomstandigheden met hoge hitte, oxidatiemiddel en/of radicalen. Sterilisatie- of desinfectiemethoden voor verschillende monstertypen variëren afhankelijk van de verschillende eigenschappen van de materialen, zoals polymeren, metalen en keramiek. Het proces voor sterilisatie of desinfectie kan warmte, gas, straling, chemicaliën, hoge druk of een combinatie hiervan omvatten.
    1. Biologisch afbreekbare metalen
      1. Gebruik over het algemeen ultraviolette (UV) straling om biologisch afbreekbare metalen te desinfecteren voor in vitro studies.
        OPMERKING: Zhang et al. meldden bijvoorbeeld dat monsters van zuiver magnesium (Mg) en ZC21 Mg-legering gedurende 4 uur onder UV-straling werden gedesinfecteerd voordat ze in de celstudies werden gebruikt1. Voor in vivo studies moeten de monsters over het algemeen worden gesteriliseerd. Voor veel biologisch afbreekbare metalen zoals magnesium- of magnesiumlegeringen moet autoclaveren met stoom worden vermeden omdat deze monsters kunnen worden geoxideerd of gecorrodeerd in water6. Een kwartsschaal wordt aanbevolen voor UV-desinfectie omdat het een betere UV-transparantie biedt dan de meeste glazen en kunststoffen.
      2. Steriliseer Mg legeringsmonsters onder droge hitte in een oven of autoclaaf bij een temperatuurbereik van 100-200 °C.
        OPMERKING: Omdat sommige metaallegeringen nog steeds bij hoge temperaturen in de lucht op het oppervlak kunnen oxideren, kan straling met hoge intensiteit in sommige gevallen als alternatief worden gebruikt. Straling met een hoge intensiteit, zoals alfa- of gammastraling, moet echter worden vermeden bij het steriliseren van dunne metaalfolies. Het kan atoomverplaatsing in de materialen veroorzaken, waardoor de microstructuur van materialen verandert.
      3. Gebruik ethyleenoxide (EtO) gassterilisatie als alternatieve methode voor biologisch afbreekbare metalen die gevoelig zijn voor warmte en straling26.
    2. Biologisch afbreekbaar keramiek
      1. Over het algemeen desinfecteert biologisch afbreekbaar keramiek met UV-straling of 70% ethanoloplossing vóór in vitro studies.
        OPMERKING: Liu et al. meldden bijvoorbeeld dat de calciumfosfaatmonsters werden gedesinfecteerd via onderdompeling in 70% ethanol gedurende 1 uur en blootstelling aan UV-licht gedurende 12 uur aan elke kant voordat ze werden gebruikt in in vitro cytocompatibiliteitstests27.
      2. Gebruik autoclaven om biologisch afbreekbaar keramiek te steriliseren als hoge temperaturen en waterdamp hun composties en microstructuren niet beschadigen.
        OPMERKING: Sommige keramiek kan worden beïnvloed door autoclaveren. Faseverandering en oppervlakteruwing werden bijvoorbeeld gevonden wanneer yttria-gestabiliseerde zirkoniakeramiek gedurende 15 minuten bij 121 °C werd geautoclaveerd. Bovendien kunnen CPC's niet worden gesteriliseerd via autoclaveren met stoom, omdat de monsters zullen reageren met water.
      3. Gebruik alternatieve sterilisatiemethoden zoals Kobalt-60 straling voor de bovengenoemde yttria-gestabiliseerde zirkonia keramiek en CPC monsters28.
    3. Biologisch afbreekbare polymeren
      1. Over het algemeen desinfecteer biologisch afbreekbare polymeren met UV-straling of 70% ethanol voordat u ze in vitro in celstudies gebruikt.
        OPMERKING: Sommige polymeren kunnen chemische veranderingen ondergaan onder UV-straling. Voor sterilisatie kan gammastraling zoals kobalt-60-straling worden gebruikt. Zetmeelpoeders werden bijvoorbeeld gesteriliseerd onder kobalt-60-straling voordat ze werden gebruikt in in vitro celstudies29.
      2. Autoclaaf polymeer materialen die bestand zijn tegen hoge temperaturen en vocht.
        OPMERKING: Polymeren zoals polypropyleen kunnen bijvoorbeeld worden geautoclaveerd omdat ze autoclaverende temperaturen kunnen verdragen (d.w.z. 121-134 °C). Sommige polymeren zoals polycaprolacton (PCL) kunnen niet worden geautoclaveerd vanwege hun relatief lage smeltpunten (d.w.z. ongeveer 60 °C)30.
      3. Gebruik EtO-gas om polymere materialen te steriliseren die gevoelig zijn voor warmte- of stralingssterilisatie.

3. Celkweekmethoden

  1. Directe kweekmethoden
    OPMERKING: Het schematische diagram in figuur 2A toont de stappen van de directe kweekmethode. In dit artikel werden BMSC's gekweekt op een van Mg afgeleide plaat geplaatst in de putten van een met 12-putjes weefselkweek behandelde plaat als voorbeeld om de kweekmethode te illustreren.
    1. Volg de stappen die worden beschreven in de stappen 1.2.2.1-1.2.2.10 om de celsuspensie te verkrijgen.
    2. Gebruik een 90% confluentkolf om de celconcentratie in de celsuspensie te bepalen met behulp van een hemocytometer. Verdun de celsuspensie met vers medium tot een voorgeschreven celconcentratie die nodig is voor het celonderzoek in vitro.
      OPMERKING: De zaaidichtheid van cellen wordt bepaald door het experimentele ontwerp. Celdichtheden van 2.000-40.000 cellen/cm2 zijn bijvoorbeeld gebruikt in verschillende celstudies met biologisch afbreekbare materialen.
    3. Plaats de monsters (Mg-plaat) in het midden van de 12 goed behandelde weefselkweekplaten. Spoel achtereenvolgens de kweekplaten met 2 ml PBS en 2 ml DMEM om de osmotische druk onder steriele omstandigheden te kalibreren. Voeg 3 ml van de verdunde celsuspensie toe aan elke put aan de monsters van belang.
    4. Kweek de cellen in een incubator onder standaard celkweekomstandigheden gedurende 24 uur.
      OPMERKING: De kweektijd kan langer of korter zijn dan 24 uur, afhankelijk van het experimentele ontwerp.
  2. Directe blootstellingsculturen
    OPMERKING: Het schematische diagram in figuur 2B toont de stappen van de directe blootstellingscultuur.
    1. Zoals beschreven in stap 3.1.1 en 3.1.2, bereidt u de celsuspensie voor met de vereiste concentraties cellen op basis van het experimentele ontwerp voor verschillende celtypen en beoogde toepassingen.
    2. Spoel de kweekplaten achtereenvolgens met 2 ml PBS en 2 ml DMEM om de osmotische druk onder steriele omstandigheden te kalibreren. Voeg 3 ml van de verdunde celsuspensie toe aan elk putje. Kweek de cellen in de bevochtigde incubator onder standaard celkweekomstandigheden gedurende 24 uur of totdat de cellen 50-80% samenvloeiing bereiken.
      OPMERKING: Het samenvloeiingsniveau van de cel kan variëren voor verschillende celtypen en experimenteel ontwerp.
    3. Spoel na 24 uur de cellen in de putplaat met PBS met een pipet om zwevende dode cellen te verwijderen.
    4. Plaats de gedesinfecteerde of gesteriliseerde monsters direct op de aangehechte cellen. Voeg 3 ml vers medium toe aan elk putje.
    5. Kweek de cellen onder standaard celkweekomstandigheden gedurende nog eens 24 uur.
      OPMERKING: De kweektijd kan langer of korter zijn dan 24 uur, afhankelijk van het experimentele ontwerp.
  3. Blootstellingsculturen
    OPMERKING: Het schematische diagram in figuur 2C toont de stappen van de belichtingscultuurmethode.
    1. De eerste stappen voor het celpreparaat zijn hetzelfde als de blootstellingscultuur. Zoals beschreven in stap 3.1.1 en 3.1.2, bereidt u de celsuspensie voor met de gewenste cellen. Net als bij stap 3.2.1 en 3.2.2 zaait u de cellen in de putplaat met de gewenste dichtheid en kweekt u ze gedurende 24 uur in een incubator onder standaard celkweekomstandigheden.
    2. Spoel na 24 uur de aanhangende cellen met PBS om zwevende dode cellen te verwijderen, gevolgd door de toevoeging van 3 ml vers medium in elke put.
    3. Plaats daarna de monsters in de putinzetstukken met een membraanporiëngrootte van 0,4 μm en plaats de putinzetstukken met de monsters in elke put met de cellen.
    4. Kweek de cellen onder standaard celkweekomstandigheden gedurende nog eens 24 uur.
      OPMERKING: De kweektijd kan langer of korter zijn dan 24 uur, afhankelijk van het experimentele ontwerp.

4. Postculture karakterisering van cellen

OPMERKING: Voor directe kweek en directe blootstellingscultuur, fix, kleur, beeld en analyseer de cellen die zich hechten aan zowel putplaten als monsters. Analyseer voor blootstellingscultuur de cellen die zich aan de putplaten hebben gehecht.

  1. Celfixatie
    1. Verzamel het postcultuurmedium uit elke put in een overeenkomstige conische buis van 15 ml voor verdere analyse. Verzamel alle monsters na de kweek voor verdere analyse.
    2. Spoel de cellen die zich hechten op zowel monsters als putplaten 3 keer met PBS.
    3. Voeg 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA, 10% neutraal gebufferd formaline) toe aan elke putplaat. Plaats het deksel terug op de putplaat en laat de PFA 20 min reageren.
    4. Na 20 minuten aspiraleer je de PFA en doseer je deze in een afvalfles. Spoel de putplaat 3 keer af met PBS om de PFA te verwijderen en breng het afval over naar de afvalfles.
  2. Celkleuring
    1. Bereid de werkvoorraden van de kleuringsmiddelen voor volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: Alexa Fluor 488 Phalloidin wordt bijvoorbeeld gebruikt om F-actine te kleuren en 4′, 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) wordt gebruikt om celkernen te kleuren. De kleuringstijd kan worden verkort als de monsters snel afbreken in de kleuringsoplossingen.
    2. Voeg 200-400 μL verdund Alexa Fluor 488 falloïdinekleurmiddel toe aan elke put om de cellen op de putplaat en het monster te bedekken. Wikkel de putplaat in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen en laat de Alexa Fluor 488 Phalloidin gedurende 20 minuten reageren bij kamertemperatuur.
    3. Verzamel het Alexa Fluor 488 falloïdine kleurmiddel en doseer het in de bijbehorende afvalfles. Spoel de putplaat 3 keer met PBS om de overtollige Alexa Fluor 488 Phalloidin te verwijderen en doseer de gebruikte PBS in de bijbehorende afvalfles.
    4. Voeg 200-400 μL verdunde DAPI toe aan elke put om de cellen in de put en op het monster te bedekken. Wikkel de putplaat in aluminiumfolie en laat de DAPI 5 minuten reageren bij kamertemperatuur.
    5. Verzamel de DAPI en doseer deze in de bijbehorende afvalfles. Spoel de putplaat 3 keer af met PBS om de DAPI te verwijderen en doseer de gebruikte PBS in de bijbehorende afvalfles.
  3. Beeldvorming van cellen
    1. Stel na het kleuren de cellen in beeld met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Maak waar mogelijk fasecontrastbeelden van cellen naast fluorescentiebeelden. Stel de cellen op de biologisch afbreekbare monsters zo snel mogelijk of onmiddellijk na het kleuren af om mogelijke veranderingen veroorzaakt door de voortdurende afbraak van monsters te voorkomen of te verminderen. Bewaar de cellen in de putplaten in een bufferoplossing bij 2-8 °C na fixatie en stel de cellen zo snel mogelijk na kleuring in beeld om het verlies van fluorescentiesignalen te voorkomen.
    2. Voor directe kweek en directe blootstellingscultuur, twee soorten cellen in beeld brengen en evalueren: (1) de cellen op de monsters (in direct contact met de monsters) en (2) de cellen die zich hechten aan de putplaat rond de monsters (indirect contact met de monsters), zoals weergegeven in figuur 3A.
    3. Gebruik voor blootstellingscultuur, zoals weergegeven in figuur 3B, een beeldgids bij het maken van de fluorescentiebeelden van cellen om te bepalen of de celrespons anders zou zijn als reactie op de dynamische degradatiegradiënt van de monsters. Beeld en analyseer de cellen in het gebied binnen de binnenste ring (3,5 mm afstand van het midden) en de buitenste ring (7 mm afstand van het midden) afzonderlijk.
      OPMERKING: De afbeeldingsgids wordt gebruikt om de afstand tussen de cellen en monsters te definiëren.
    4. Neem voor elk monster en elke put in de kweekplaten willekeurig ten minste vijf afbeeldingen van elk interessegebied waar de cellen in direct contact of indirect contact staan met de monsters op een vooraf gedefinieerde afstand.
  4. Beeldanalyse
    1. Kwantificeer voor alle celbeelden verkregen uit stap 4.3 de celmorfologie door het celspreidingsgebied en de beeldverhouding te meten met behulp van software zoals ImageJ voor beeldanalyse.
    2. Tel het aantal cellen in elk afbeeldingsgebied. Bereken de celhechtingsdichtheid onder directe en indirecte contactomstandigheden als het aantal cellen per oppervlakte-eenheid.

5. Postculturele analyses van media en monsters

  1. Meet de pH van postcultureel medium.
    OPMERKING: Sommige monsters veranderen de pH-waarde van het medium tijdens hun afbraak. Biologisch afbreekbare metalen zoals magnesiumlegeringen verhogen bijvoorbeeld meestal de pH-waarde van het medium vanwege hun afbraak31. Biologisch afbreekbare polymeren zoals PLGA verlagen daarentegen vaak de pH-waarde van het medium wanneer ze worden afgebroken32. Het meten van de pH-waarde van postcultureel medium kan wijzen op de afbraak van deze monsters in vitro.
    1. Verzamel vóór de celfixatie het postculturele medium zoals in stap 4.1.1.
    2. Meet de pH-waarden van het postculturemedium in elke put onmiddellijk na het verzamelen met behulp van een vooraf gekalibreerde pH-meter.
      OPMERKING: De pH van de media kan in de loop van de tijd afwijken vanwege omgevingsomstandigheden zoals CO2-niveau en temperatuur, waarmee rekening moet worden gehouden.
  2. Analyseer de mediumsamenstellingen voor het afbraakgedrag van biologisch afbreekbare monsters. Voor sommige monsters die een kleurverandering van het medium veroorzaken, meet u de optische dichtheid (O.D.) waarde van het postcultuurmedium met behulp van een spectrofotometer of een microplaatlezer om het degradatiegedrag te bepalen. Als alternatief kunt u ultraviolet-zichtbare spectroscopie (UV-VIS) en Fouriertransformatie infraroodspectroscopie-verzwakte totale reflectie (FTIR-ATR) gebruiken om de afbraakproducten in het postcultuurmedium te analyseren.
    OPMERKING: Het meten van de afbraakproducten in het postkweekmedium is waardevol voor het begrijpen van het afbraakgedrag van de monsters. Een van de meest voorkomende benaderingen is het meten van de ionen van belang in het postculturele medium met behulp van een inductief gekoppelde plasma-optische emissiespectrometer (ICP-OES). De ICP-OES kan worden gebruikt om de samenstelling van postcultureel medium van metalen en keramiek te meten, maar is mogelijk niet geschikt voor polymeren. Polymeren bestaan meestal uit koolstof, waterstof en zuurstof, en nauwkeurige kwantificering van deze elementen is moeilijk voor ICP-OES.
    1. Na stap 5.1.2 voor pH-meting verzamelt en verdunt u het medium met behulp van een gewenste verdunningsfactor voor optimale metingen van ionconcentraties.
    2. Meet de concentraties van de interessante ionen in het postculturele medium met behulp van een ICP-OES.
  3. Postculturele analyse van monsters
    OPMERKING: Na in vitro celonderzoek kunnen de biologisch afbreekbare monsters veranderen in afmeting, massa, oppervlaktemorfologie, microstructuur en samenstelling. Postculture-analyse van monsters helpt het afbraakmechanisme van monsters te begrijpen.
    1. Maak na de celkweek de foto's van de monsters om mogelijke veranderingen in monsterdimensie, kleur, morfologie en andere zichtbare kenmerken te laten zien.
    2. Droog of droog de postcultuurmonsters en meet de massa, dimensie en volume van het monster om eventuele veranderingen in massa, dimensie en volume te kwantificeren.
    3. Gebruik een scanning elektronenmicroscoop (SEM) om de microstructuur en morfologie van de monsters te karakteriseren. Gebruik energiedispersieve röntgenspectroscopie (EDX) en röntgendiffractie (XRD) om de samenstelling en fase van de afbraakproducten op de monsters te karakteriseren. Gebruik FTIR-ATR om de chemische binding op de monsteroppervlakken te detecteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 4 toont de representatieve fluorescentiebeelden van BMSCs onder directe en indirecte contactomstandigheden met behulp van verschillende kweekmethoden. Figuur 4A,B toont de BMSCs onder directe en indirecte contactomstandigheden na dezelfde 24-uurs directe kweek met ZC21 magnesiumlegeringen1. De ZC21 legeringen bestaan uit 97,5 wt% magnesium, 2 wt% zink en 0,5 wt% calcium. De cellen die geen direct contact hebben met...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Verschillende celkweekmethoden kunnen worden gebruikt om de in vitro cytocompatibiliteit van biomaterialen die van belang zijn voor verschillende aspecten van toepassingen in vivo te evalueren. Dit artikel demonstreert drie in vitro kweekmethoden, d.w.z. directe kweek, directe blootstellingscultuur en blootstellingscultuur, om verschillende in vivo scenario's na te bootsen waarbij biologisch afbreekbare implantaatmaterialen in het menselijk lichaam worden gebruikt. De directe kweekmeth...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

De auteurs waarderen de financiële steun van de Amerikaanse National Science Foundation (NSF CBET award 1512764 en NSF PIRE 1545852), de National Institutes of Health (NIH NIDCR 1R03DE028631), de University of California (UC) Regents Faculty Development Fellowship en Committee on Research Seed Grant (Huinan Liu) en UC-Riverside Dissertation Research Grant (Jiajia Lin). De auteurs waarderen de Central Facility for Advanced Microscopy and Microanalysis (CFAMM) aan de UC-Riverside voor het gebruik van SEM /EDS en Dr. Perry Cheung voor het gebruik van XRD-instrumenten. De auteurs waarderen ook Thanh Vy Nguyen en Queenie Xu voor gedeeltelijke bewerking. De auteurs willen ook Cindy Lee bedanken voor het opnemen van de vertelling voor de video. Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen in dit artikel zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van de National Science Foundation of de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 mL serologische pipetVWR490019-704
12-well platen behandeld voor weefselkweekThermo Fisher Scientific353043
15 mL conische buis (Polypropyleen)VWR89039-666
18 G naaldBD305196
25½ G naaldBD305122
4',6-diamidino-2- fenylindooldilactaat (DAPI)InvitrogenD3571
50 mL conische buis (Polypropyleen)VWR89039-658
70 μm nylon zeefFisher Scientific50-105-0135
Alexa Flour 488-phalloidinLife technologiesA12379
Biologische veiligheidskastLABCONCOClass II, Type A2
CentrifugeEppendorfRotor F-35-6-30, Centrifuge5430
Duidelijke versmolten kwarts ronde schaalAdValue TechnologyFQ-4085
CO2 incubatorSANYOMCO-19AIC
CoolCell-vriescontainerCorning432000schuimcontainer ontworpen om temperatuurdaling te reguleren
CryovialThermo Fisher Scientific5000-1020
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Dulbecco's gemodificeerd Eagles medium (DMEM)Sigma-AldrichD5648
EDX-analysesoftwareOxford InstrumentsAztecSynergy
Energiedispersieve röntgenspectroscopie (EDX)FEI50mm2 X-Max50 SDD
Foetaal runderserum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.SH30910
FluorescentiemicroscoopNikonEclipse Ti
FormaldehydeVWR100496-496
HemacytometerHausser Scientific3520
ImageJ-softwareNational Institutes of Health en het Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)
Inductiegekoppelde plasma
optische emissiespectrometrie (ICP-OES)		PerkinElmerOptima 8000
Optische microscoopVWRVistaVision
Penicilline/streptomycine (P/S)Thermo Fisher Scientific, Inc.,15070063
pH-meterVWRmodel SB70P
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)VWR97062-730
Scanning elektronenmicroscoop (SEM)FEINova NanoSEM 450
Chirurgische mesjesVWR76353-728
WeefselkweekkolvenVWRT-75, MSPP-90076
Transwell-inzetstukkenCorning3460
Trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur oplossing (Trypsine-EDTA)Sigma-AldrichT4049
Röntgendiffractie-instrument (XRD)PANalyticalEmpyrean Series 2

Referenties

  1. Zhang, C., et al. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr Alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science & Engineering. 6 (1), 517-538 (2019).
  2. Xu, C., et al. A green biocompatible fabrication of highly porous functional ceramics with high strength and controllable pore structures. Journal of Materials Science & Technology. 32 (8), 729-732 (2016).
  3. Asgari, M., et al. Biodegradable metallic wires in dental and orthopedic applications: a review. Metals. 8 (4), 212(2018).
  4. Shi, Y., Liu, J., Yu, L., Zhong, L. Z., Jiang, H. B. β-TCP scaffold coated with PCL as biodegradable materials for dental applications. Ceramics International. 44 (13), 15086-15091 (2018).
  5. Wu, C. -C., et al. A self-reinforcing biodegradable implant made of poly (ɛ-caprolactone)/calcium phosphate ceramic composite for craniomaxillofacial fracture fixation. Journal of Cranio-Maxillofacial Surgery. 44 (9), 1333-1341 (2016).
  6. Jiang, W., et al. In vitro evaluation of MgSr and MgCaSr alloys via direct culture with bone marrow derived mesenchymal stem cells. Acta Biomaterialia. 72, 407-423 (2018).
  7. Zhang, C., et al. Magnesium-based biodegradable microelectrodes for neural recording. Materials Science and Engineering: C. 110, 110614(2020).
  8. Jia, B., et al. In vitro and in vivo studies of Zn-Mn biodegradable metals designed for orthopedic applications. Acta Biomaterialia. 108, 358-372 (2020).
  9. Yang, H., et al. Alloying design of biodegradable zinc as promising bone implants for load-bearing applications. Nature Communications. 11 (1), 1-16 (2020).
  10. Liu, H., et al. Injectable, biomechanically robust, biodegradable and osseointegrative bone cement for percutaneous kyphoplasty and vertebroplasty. International Orthopaedics. 42 (1), 125-132 (2018).
  11. Anjum, S., Arora, A., Alam, M., Gupta, B. Development of antimicrobial and scar preventive chitosan hydrogel wound dressings. International Journal of Pharmaceutics. 508 (1-2), 92-101 (2016).
  12. Barroca, N., et al. Electrically polarized PLLA nanofibers as neural tissue engineering scaffolds with improved neuritogenesis. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167, 93-103 (2018).
  13. Liu, Y., et al. Polydopamine-modified poly (l-lactic acid) nanofiber scaffolds immobilized with an osteogenic growth peptide for bone tissue regeneration. RSC Advances. 9 (21), 11722-11736 (2019).
  14. Liu, H., Webster, T. J. Enhanced biological and mechanical properties of well-dispersed nanophase ceramics in polymer composites: from 2D to 3D printed structures. Materials Science and Engineering: C. 31 (2), 77-89 (2011).
  15. Xu, C., et al. Bioinspired mechano-sensitive macroporous ceramic sponge for logical drug and cell delivery. Advanced Science. 4 (6), 1600410(2017).
  16. Xu, C., Bai, Y., Yang, H., Yang, L. Mechanically modulated, ultra-high precision logic delivery of molecules by bio-inspired macroporous ceramic sponge. MRS Advances. 2 (19-20), 1125-1130 (2017).
  17. Zhang, N., Xu, C., Azer, A., Liu, H. Dispersibility and characterization of polyvinyl alcohol-coated magnetic nanoparticles in poly (glycerol sebacate) for biomedical applications. Journal of Nanoparticle Research. 21 (12), 1-11 (2019).
  18. Kim, S. S., et al. A poly (lactide-co-glycolide)/hydroxyapatite composite scaffold with enhanced osteoconductivity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 80 (1), 206-215 (2007).
  19. Cipriano, A. F., et al. Degradation of bioresorbable Mg-4Zn-1Sr intramedullary pins and associated biological responses in vitro and in vivo. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (51), 44332-44355 (2017).
  20. Surmeneva, M. A., et al. Bone marrow derived mesenchymal stem cell response to the RF magnetron sputter deposited hydroxyapatite coating on AZ91 magnesium alloy. Materials Chemistry and Physics. 221, 89-98 (2019).
  21. Sheikh, Z., et al. Mechanisms of in vivo degradation and resorption of calcium phosphate based biomaterials. Materials. 8 (11), 7913-7925 (2015).
  22. Klein, C., Driessen, A., De Groot, K., Van den Hooff, A. Biodegradation behavior of various calcium phosphate materials in bone tissue. Journal of Biomedical Materials Research. 17 (5), 769-784 (1983).
  23. Lanao, R. P. F., Leeuwenburgh, S. C., Wolke, J. G., Jansen, J. A. Bone response to fast-degrading, injectable calcium phosphate cements containing PLGA microparticles. Biomaterials. 32 (34), 8839-8847 (2011).
  24. Vey, E., et al. Degradation kinetics of poly (lactic-co-glycolic) acid block copolymer cast films in phosphate buffer solution as revealed by infrared and Raman spectroscopies. Polymer Degradation and Stability. 96 (10), 1882-1889 (2011).
  25. Standard, I. Biological evaluation of medical devices-Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity. Geneve, Switzerland: International Organization for Standardization. , (2009).
  26. Liu, X., Zhou, W., Wu, Y., Cheng, Y., Zheng, Y. Effect of sterilization process on surface characteristics and biocompatibility of pure Mg and MgCa alloys. Materials Science and Engineering: C. 33 (7), 4144-4154 (2013).
  27. Liu, H., Yazici, H., Ergun, C., Webster, T. J., Bermek, H. An in vitro evaluation of the Ca/P ratio for the cytocompatibility of nano-to-micron particulate calcium phosphates for bone regeneration. Acta Biomaterialia. 4 (5), 1472-1479 (2008).
  28. Liu, H., et al. Enhancing effects of radiopaque agent BaSO4 on mechanical and biocompatibility properties of injectable calcium phosphate composite cement. Materials Science and Engineering: C. 116, 110904(2020).
  29. Xu, C., et al. A versatile three-dimensional foam fabrication strategy for soft and hard tissue engineering. Biomedical Materials. 13 (2), 025018(2018).
  30. Speranza, V., Sorrentino, A., De Santis, F., Pantani, R. Characterization of the polycaprolactone melt crystallization: complementary optical microscopy, DSC, and AFM studies. The Scientific World Journal. , 720157(2014).
  31. Cipriano, A. F., et al. Anodization of magnesium for biomedical applications-Processing, characterization, degradation and cytocompatibility. Acta Biomaterialia. 62, 397-417 (2017).
  32. Li, H., Chang, J. pH-compensation effect of bioactive inorganic fillers on the degradation of PLGA. Composites science and technology. 65 (14), 2226-2232 (2005).
  33. Xu, C., Hung, C., Cao, Y., Liu, H. H. Tunable crosslinking, reversible phase transition, and 3D printing of hyaluronic acid hydrogels via dynamic coordination of innate carboxyl groups and metallic ions. ACS Applied Bio Materials. 4 (3), 2408-2428 (2021).
  34. Cortez Alcaraz, M. C., et al. Electrophoretic deposition of magnesium oxide nanoparticles on magnesium: processing parameters, microstructures, degradation, and cytocompatibility. ACS Applied Bio Materials. 2 (12), 5634-5652 (2019).
  35. Rutherford, D., et al. Synthesis, characterization, and cytocompatibility of yttria stabilized zirconia nanopowders for creating a window to the brain. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 108 (3), 925-938 (2020).
  36. Tian, Q., Deo, M., Rivera-Castaneda, L., Liu, H. Cytocompatibility of magnesium alloys with human urothelial cells: a comparison of three culture methodologies. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (9), 1559-1571 (2016).
  37. Nguyen, T., Cipriano, A., Guan, R. G., Zhao, Z. Y., Liu, H. In vitro interactions of blood, platelet, and fibroblast with biodegradable magnesium-zinc-strontium alloys. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2974-2986 (2015).
  38. Jiang, W., Lin, J., Chen, A. H., Pan, J., Liu, H. A portable device for studying the effects of fluid flow on degradation properties of biomaterials inside cell incubators. Regenerative Biomaterials. 6 (1), 39-48 (2019).
  39. Tian, Q., et al. Responses of human urothelial cells to magnesium-zinc-strontium alloys and associated insoluble degradation products for urological stent applications. Materials Science and Engineering: C. 96, 248-262 (2019).
  40. Wetteland, C. L., Liu, H. Optical and biological properties of polymer-based nanocomposites with improved dispersion of ceramic nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 106 (10), 2692-2707 (2018).
  41. Wetteland, C. L., Nguyen, N. -Y. T., Liu, H. Concentration-dependent behaviors of bone marrow derived mesenchymal stem cells and infectious bacteria toward magnesium oxide nanoparticles. Acta Biomaterialia. 35, 341-356 (2016).
  42. Aoi, W., Marunaka, Y. The importance of regulation of body fluid pH in the development and progression of metabolic diseases. Advances in Medicine and Biology. 77, 177-189 (2014).
  43. Wang, H. Hydroxyapatite degradation and biocompatibility. , The Ohio State University. (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In vitro cytocompatibiliteitdirecte kweekmethodeexpositiekweekmethodebeenmergstamcellenceladhesiedichtheidscanning elektronenmicroscopieenergiedispersieve r ntgenanalysemagnesiumionconcentratieISO biomateriaalnormen

Gerelateerde artikelen