Methodenartikel

Interfase Fluorescentie in situ Hybridisatie van beenmerguitstrijkjes van multipel myeloom

DOI:

10.3791/63083

⸱

15 april 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Wuhan National Laboratory for Optoelectronics, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het verbeteren van het succes van interfase fluorescentie in situ hybridisatiedetectie op beenmerguitstrijkjes van patiënten met multipel myeloom.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) detectie is een onmisbare methode in genetische risicostratificatie bij multipel myeloom (MM), wat een van de meest voorkomende hematologische maligniteiten is. Het identificerende kenmerk van MM is geaccumuleerde kwaadaardige plasmacellen in het beenmerg. FISH-rapporten voor MM richten zich voornamelijk op gezuiverde of geïdentificeerde klonale plasmacellen, in plaats van alle kerncellen, door te sorteren met anti-CD138 magnetische kralen of te markeren met cytoplasmatische immunoglobuline lichte keten κ of λ. Beenmerg interfase kernen worden meestal verkregen uit verse beenmergcellen. Voor een bevredigende verrijking van plasmacelmonsters zijn echter grote hoeveelheden vers heparine-anti-gecoaguleerd beenmerg nodig, die niet kunnen worden verkregen in het geval van moeilijke beenmergextractie of een droge beenmergkraan. Hierin stellen we een nieuwe methode vast om het succes van FISH-detectie op bevlekte of niet-gekleurde beenmerguitstrijkjes te verbeteren. Beenmerguitstrijkjes zijn gemakkelijker te verkrijgen dan anticoaguleerde beenmergspecimens.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multipel myeloom (MM) is een kwaadaardige plasmacelziekte (PC) met een sterke biologische heterogeniteit en grote individuele verschillen in klinische werkzaamheid, met overlevingsperioden variërend van maanden tot decennia. Cytogenetische kenmerken zijn belangrijke prognostische indicatoren van MM. Het risicostratificatiesysteem en geïndividualiseerde behandelingen op basis van genetische kenmerken zijn onderwerpen van intense interesse geworden in klinisch onderzoek naar MM1. De afwijkingen van pc's getest in een fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) paneel van beenmerg (BM) omvatten del 13q14 (RB1), del 17p13 (TP53), t(4;14) (IGH/FGFR3), t(11;14) (IGH/MYEOV), t(14;16) (IGH/MAF), t(14:20) (IGH/MAFB), 1q21 (CKS1B) gain/amplification en 1p (CDKN2C) deletie.

Standaard metafasecytogenetica moet worden opgenomen in de eerste beoordeling van MM-patiënten. Hoewel conventionele G-gestreepte karyotypering het voordeel biedt van een hele chromosoomanalyse, leidt de lage opbrengst van deze methode tot veel vals negatieve resultaten2. Traditioneel worden pc's beschouwd als grotendeels niet in staat om te splitsen omdat ze de eindproducten zijn van B-lymfocytendifferentiatie. Dit maakt het moeilijk om gesplitste afbeeldingen te verkrijgen. Verbeterde cytogenetische analyse in MM met langetermijnculturen (6 dagen) en stimulatie van culturen door cytokines kan een veelbelovende methode zijn voor het identificeren van cytogenetische afwijkingen bij nieuw gediagnosticeerde MM-patiënten3. Zelfs wanneer de kweektijd werd verlengd tot 6 dagen, werden cytogenetische afwijkingen echter nauwkeurig gemeld bij 30% -50% van de MM-patiënten4. Bovendien wordt MM gekenmerkt door complexe cytogenetische aberraties die de prognostische heterogeniteit weerspiegelen. De resolutie van traditionele chromosoombandtechnologie is echter laag, wat gemakkelijk kan leiden tot gemiste detectie van chromosomale afwijkingen in MM.

Interfase FISH, bij voorkeur na CD138-positieve magnetische kraalgebaseerde PC-sortering of markering met cytoplasmatische immunoglobuline lichte keten κ/λ, is onmisbaar bij de analyse van MM5,6. Een CD138-positief geselecteerd monster wordt sterk aanbevolen voor de geoptimaliseerde opbrengst van tumorcellen. Nauwkeurige kwantificering van cytogenetische afwijkingen vereist echter ten minste 4 ml antistollings BM voor pc-sortering. Bovendien verhogen de combinaties van CD138 immunomagnetische kraalsortering met FISH of cytoplasmatische κ / λ lichte keten immunoglobuline met FISH-testen (cIg-FISH) tal van experimentele kosten en zijn tijdrovend.

Meestal wordt de PC-ratio eerst beoordeeld aan de hand van het morfologisch onderzoek van gekleurde BM-uitstrijkjes of BM-biopsiesecties7,8. BM-monsters van de hoogste kwaliteit (eerste mergaspiraatmonsters) worden gebruikt voor morfologische tests, terwijl die welke voor FISH of andere detectie worden verzonden, vaak de secundaire aspiraatmonsters zijn met hoge verdunningsverhoudingen met perifeer bloed.

Al in de jaren 1990 toonden meerdere studies aan dat BM-uitstrijkjes direct kunnen worden gebruikt voor interstitiële FISH-onderzoeken, wat een betrouwbare en herhaalbare methode is gebleken9. Een elegante studie op basis van celmorfologie en esterasecytochemie in combinatie met FISH van perifeer bloed en BM-uitstrijkjes bevestigde de grote klinische betekenis ervan voor het ophelderen van chromosomale afwijkingen bij patiënten met granulocytaire en lymfatische leukemie10.

Hierin bieden we een nieuwe methode voor het verbeteren van het succes van interfase FISH-detectie bij MM-patiënten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd uitgevoerd volgens de principes van de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de ethische commissie van het Zhongnan-ziekenhuis van de Universiteit van Wuhan (nr. 2019065). De monsters werden verzameld bij een MM-patiënt op de afdeling Hematologie, Zhongnan Hospital van de Wuhan University (China).

1. Bereiding van de BM-uitstrijkjes

  1. Plaats de eerste 0,2 ml BM-oplossing op een schone glazen wegwerpschuif.
  2. Verdeel de BM-uitstrijkjes tot uniforme dikte met scherpe staarten door de BM snel te verwijderen. Droog vervolgens op natuurlijke wijze.
  3. Bedek de BM-folies met 1 ml Wright-Giemsa-oplossing gedurende ongeveer 10 s bij kamertemperatuur.
  4. Voeg 1 ml fosfaatbuffer toe aan de dia's.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de verfoplossing niet uitdroogt of van de dia's afstroomt.
  5. Meng de kleurstofoplossing voorzichtig en houd deze gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
  6. Spoel de glaasjes af met schoon water en droog ze in lucht op kamertemperatuur.
  7. Gebruik forward light microscopie om kwaadaardige pc's te detecteren. De pc's moeten goed verspreid zijn.

2. VIS voorbewerking van de BM-uitstrijkjes

  1. Bedek het gehybridiseerde gebied met een fixatieve oplossing gedurende 10 minuten om de pc's te verkleuren en te repareren.
    1. Om een verse fixatieve oplossing te bereiden, mengt u methanol met ijsazijn in een volumeverhouding van 3:1.
  2. Spoel de glijbaan af met gedeïoniseerd water (dH2O) en droog het in lucht bij kamertemperatuur.
  3. Verwarm een pot met 2x SSC buffer voor op 56 °C in een waterbad. Verdun de buffer voor gebruik vers tot 20x SSC.
    1. Om 20x SSC te bereiden, mengt u 176 g natriumchloride en 88 g natriumcitraat grondig met 800 ml dH2O. Meet de pH en stel deze in op pH 5,3 ± 0,2. Voeg vervolgens dH2O toe om het uiteindelijke volume op 1 L te brengen.
  4. Was het voorbereide BM-uitstrijkje gedurende 10 minuten in de voorverwarmde 2x SSC-buffer, daarna dompel het bij kamertemperatuur in gedeïoniseerd water.
  5. Droog het uitstrijkje uit in een ethanolgradiënt (70%, 85% en 100% ethanol, elk gedurende 1 minuut). Droog het uitstrijkje gedurende 10 minuten aan de lucht.

3. BM uitstrijkje FISH en wassen

OPMERKING: Alle stappen werden uitgevoerd in een donkere kamer om fluorescentie te voorkomen.

  1. Voeg het TP53/centromeer van chromosoom 17 (CEP17) sondemengsel toe aan het hybridisatiegebied en bedek het met een coverslip. Druk zachtjes met een fijn puntig pincet om luchtbellen van onderaf te verwijderen.
  2. Sluit alle zijden van de afdekplaat af met rubbercement om een goede dichtheid te garanderen.
  3. Na het stollen van het rubbercement plaatst u de schuif op een automatische FISH-machine. Voer denaturatie uit bij 78 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door hybridisatie bij 37 °C 's nachts.
  4. Pak de glijbaan uit de FISH-machine. Gebruik een fijn puntig pincet om het rubbercement voorzichtig te verwijderen.
  5. Dompel de glijbaan ongeveer 1 of 2 minuten onder in 2x SSC bij kamertemperatuur om de afdekplaat eraf te wassen.
  6. Was de schuif in 68 °C voorverwarmde 0,4x SSC/0,3% NP-40 buffer in een waterbad gedurende 2 min.
    1. Bereid 0,4x SSC/0,3% NP-40-oplossing door 20 ml 20x SSC (pH 5,3) grondig te mengen met 950 ml dH2O. Voeg vervolgens 3 ml NP-40 toe en meng grondig totdat het volledig is opgelost. Meet de pH en stel in op 7,0-7,5 met NaOH. Voeg vervolgens dH2O toe om het uiteindelijke volume van de totaaloplossing op 1 l te brengen.
  7. Was de glijbanen met 2x SSC gedurende 1 min in een waterbad van 37 °C. Zet rechtop in het donker om 10 min goed te drogen.
  8. Voeg 10 μL DAPI toe aan het gehybridiseerde gebied en bedek met een coverslip.

4. FISH-analyse en beeldvorming

  1. Bekijk de gehybridiseerde dia met behulp van een geschikte filterset op een fluorescentiemicroscoop.
  2. Gebruik een monochromatisch blauw fluorofoor optisch filter om de fluorescentie-intensiteit van de celkern te observeren. Maak celkernbeelden onder een DAPI-filterset.
  3. Gebruik een chromosoom centromeersonde om te laten zien hoeveel chromosomen een cel bevat. Label CEP17 met groene fluorescentie. Gebruik een spectrumgroen fluorofoor optisch filter om de locatie van CEP17 te observeren. Neem een CEP17-signaalbeeld onder de groene filterset.
  4. Label het TP53-gen met oranje fluorescentie. Gebruik een spectrum oranje fluorofoor optisch filter om TP53 te observeren. Neem een TP53-signaalbeeld onder deze set.
  5. Voeg deze drie beelden samen en onderzoek ze op numerieke afwijkingen.
    OPMERKING: In een normale interfasecel worden twee oranje en twee groene signalen waargenomen in een kern met blauwe fluorescentie, wat wijst op één paar normaal chromosoom 17 (figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij de eerste morfologische beoordeling van een nieuw gediagnosticeerde MM-patiënt bleek 15% van de pc's in een BM-uitstrijkje grotere en donkerdere kernen te hebben, samen met grotere hoeveelheden cytoplasma dan normale pc's (figuur 2A). De eerste buis heparine anti-gecoaguleerde BM gedetecteerd door de immunofenotype techniek onthulde slechts 2,3% van de monoklonale afwijkende pc's. CD138 immunomagnetische kraal sortering in combinatie met FISH of de cIg-FISH techniek is essentieel voor he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De toepassing van FISH op genetische risicostratificatie in MM is essentieel. Het kritieke deel van FISH-rapporten zijn niet alle kerncellen, maar klonale pc's die specifiek zijn gezuiverd of geïdentificeerd door te sorteren met anti-CD138 magnetische kralen of te markeren met cytoplasmatische immunoglobuline lichte keten κ of λ. Interphase FISH na PC-sortering of cIg-FISH bleek significant te zijn in de diagnose van MM vanwege het relatief lagere aandeel pc's in de BM. Deze methoden hebben echter enkele tekortkomingen, ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit project werd ondersteund door het Innovatiefonds van WNLO 2018WNLOKF023.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
automatic FISH machineLeica  CorporationS500-24FINAL Assy Thermobrite 240V
DAPIAbbott Molecular Inc.06J49-001DAPI Counterstain
FISH Analysis SoftwareIMSTAR  CorporationIMSTARFISH Analysis Software
FISH ProbeAbbott Molecular Inc.05N56-020Vysis Locus Specifc Identifer TP53 / CEP 17 FISH Probe Kit
Fixed volume pipetteEppendorf China Ltd.M33768H10  microliter
Fluorescence MicroscopeOlympus CorporationBX53Forward Fluorescence Microscope
Karyotype Analysis SoftwareIMSTAR  CorporationIMSTARKaryotype Analysis Software
Light MicroscopeOlympus  CorporationBX41Forward Light Microscope
NP-40Abbott Molecular Inc.07J05-001NP-40
Plastic staining dyeing rackGuangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.RSJ-501 24 slides
Plastic staining dyeing tankGuangzhou Kaixiu Trading Co., Ltd.RSJ-516 24 slides
Rubber CementMarabu GmbH & Co. KGFixoGum Rubber Cement
SSCAbbott Molecular Inc.02J10-03220×SSC
Water bathShanghai Boxun Medical Bio-Instrument Co., Ltd.DK-8DMultiple Temperature Water bath

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sonneveld, P., et al. Treatment of multiple myeloma with high-risk cytogenetics: a consensus of the International Myeloma Working Group. Blood. 127, 2955-2962 (2016).
  2. Radbruch, A., et al. Competence and competition: the challenge of becoming a long-lived plasma cell. Nature Reviews Immunology. 6, 741-750 (2006).
  3. Lai, J. L., et al. Improved cytogenetics in multiple myeloma: a study of 151 patients including 117 patients at diagnosis. Blood. 85 (9), 2490-2497 (1995).
  4. Hallek, M., Bergsagel, P. L., Anderson, K. C. Multiple myeloma: increasing evidence for a multistep transformation process. Blood. 91, 3-21 (1998).
  5. Munsh, N. C., et al. Consensus recommendations for risk stratification in multiple myeloma: report of the International Myeloma Workshop Consensus Panel 2. Blood. 117, 4696-4700 (2011).
  6. Gole, L., et al. cIg-FISH On Patients with Multiple Myeloma - A Modified and Simple Technique Easily Incorporated Into Routine Clinical Service. Blood. 120, 4792-4792 (2012).
  7. Lee, S. H., Erber, W., Porwit, A., Tomonaga, M., Peterson, L. I. C. S. I. Hematology, ICSH guidelines for the standardization of bone marrow specimens and reports. International Journal of Laboratory Hematology. 30, 349-364 (2008).
  8. Štifter, S., et al. Combined evaluation of bone marrow aspirate and biopsy is superior in the prognosis of multiple myeloma. Diagnostic Pathology. 5, 30(2010).
  9. Huegel, A., Coyle, L., McNeil, R., Smith, A. Evaluation of interphase fluorescence in situ hybridization on direct hematological bone marrow smears. Pathology. 27, 86-90 (1995).
  10. Jacobsson, B., Bernell, P., Arvidsson, I., Hast, R. Classical morphology, esterase cytochemistry, and interphase cytogenetics of peripheral blood and bone marrow smears. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1303-1309 (1996).
  11. Dunning, K., Safo, A. The ultimate Wright-Giemsa stain: 60 years in the making. Biotechnic & Histochemistry. 86, 69-75 (2011).
  12. Woronzoff-Dashkoff, K. K. The wright-giemsa stain. Secrets revealed. Clinics in Laboratory Medicine. 22, 15-23 (2002).
  13. McPherson, R. A., Pincus, M. R. Henry's Clinical diagnosis and Management by Laboratory Methods E-book. Elsevier Health Sciences. , (2017).
  14. Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Interfase FISHbeenmerguitstrijkjeplasmacellengenetische risicostratificatiefluorescentiemicroscopieTP53 detectiechromosoom 17 sondeCD138 sorteringcytoplasmatisch immunoglobuline

Gerelateerde artikelen