Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Uracil-DNA Glycosylase Assay door Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis

3.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63089

⸱

22 april 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Een niet-gelabelde, niet-radio-isotopische methode om uracil-DNA glycosylase activiteit te testen werd ontwikkeld met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie voor directe apurine / apyrimidinische site-bevattende productanalyse. De test bleek vrij eenvoudig, specifiek, snel en gemakkelijk te gebruiken voor DNA-glycosylasemeting.

Samenvatting

Uracil-DNA glycosylase (UDG) is een belangrijk onderdeel in de base excisie reparatie route voor de correctie van uracil gevormd door hydrolytische deaminering van cytosine. Het is dus cruciaal voor het behoud van de genoomintegriteit. Een zeer specifieke, niet-gelabelde, niet-radio-isotopische methode werd ontwikkeld om UDG-activiteit te meten. Een synthetische DNA-duplex met een site-specific uracil werd gesplitst door UDG en vervolgens onderworpen aan Matrix-assisted Laser Desorption / Ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) analyse. Er werd een protocol opgesteld om het apurine/apyrimidinische site (AP) product in DNA te bewaren zonder strengbreuk. De verandering in de m/z-waarde van het substraat naar het product werd gebruikt om uracilhydrolyse door UDG te evalueren. Een G:U-substraat werd gebruikt voor UDG-kinetische analyse die de Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s en Kcat = 9,31 s-1 opleverde. Toepassing van deze methode op een uracilglycosylaseremmer (UGI)-test leverde een IC50-waarde van 7,6 pM op. De UDG-specificiteit met behulp van uracil op verschillende posities binnen enkelstrengs en dubbelstrengs DNA-substraten toonde verschillende splitsingsefficiënties. Deze eenvoudige, snelle en veelzijdige MALDI-TOF MS-methode zou dus een uitstekende referentiemethode kunnen zijn voor verschillende monofunctionele DNA-glycosylasen. Het heeft ook het potentieel als een hulpmiddel voor DNA-glycosylaseremmer screening.

Inleiding

Hoewel uracil een normale base is in RNA, is het een veel voorkomende en zeer mutagene laesie in genomisch DNA. Uracil kan ontstaan door spontane/enzymatische hydrolytische deaminering van een deoxycytidine. In elke levende cel vindt deze deaminering 100-500 keer per dag plaats onder fysiologische omstandigheden1,2. Als deze veranderingen niet worden gerepareerd, kan er een verandering in de samenstelling van de DNA-sequentie optreden, waardoor mutatie ontstaat. Omdat uracil in DNA de voorkeur geeft aan paring met dATP tijdens replicatie, als cytosine deaminateert naar uracil, in twee replicatiegebeurtenissen, zal er een nieuwe G: C naar A: T overgangsmutatie zijn in de helft van het nageslacht DNA3.

Onder de cellulaire strategieën om de genetische stabiliteit te behouden, is base excision repair (BER) een essentieel mechanisme dat beschadigde basen, zoals uracil, in DNA4 herstelt. BER is een zeer evolutionair geconserveerd proces. Er zijn twee algemene BER-routes: de korte-patch pathway die leidt naar een reparatiekanaal van een enkel nucleotide en de long-patch pathway die een repair tract van ten minste twee nucleotiden produceert5. BER is een gecoördineerd mechanisme dat in verschillende stappen plaatsvindt. De eerste stap in BER is de enzymatische hydrolyse van de beschadigde nucleotidebasis door een schadespecifiek DNA-glycosylase om een apurine / apyrimidinische (AP) tussenliggende plaats te genereren6. Dit wordt gevolgd door de splitsing van de suiker-fosfaat ruggengraat op de AP-site door een endonuclease, opschoning van de DNA-uiteinden door een lyase, gap-vulling door een DNA-polymerase en het afdichten van de laatste nick door een ligase5.

Uracil-DNA glycosylase (UDG) hydrolyseert het uracil uit uracil-bevattend DNA voor BER in Escherichia coli. Conventionele UDG-testen met behulp van radioactief gelabeld DNA met verschillende scheidingstechnieken6,7,8,9,10,11,12,13 zijn meestal tijdrovend, arbeidsintensief, met dure etiketteringsreagentia, gecompliceerde procedures en vereisen intensieve training en oefening om de risico's van blootstelling aan radioactieve materialen te verminderen. Fluorometrische oligonucleotide assays zijn ontwikkeld als vervanging voor radio-isotoop labeling14, naast moleculaire bakens en Förster resonantie energieoverdracht technologie15,16,17,18,19,20. Voor alle bovengenoemde methoden is echter specifieke etikettering vereist. Onlangs zijn labelvrije biosensoren getest21,22,23 en colorimetrische methoden op basis van de vorming van een G-quadruplex24,25,26. Meerdere A: U-paren of speciaal ontworpen sequenties in de sondes bemoeilijken echter de definitie van enzymeenheden.

MALDI-TOF MS is een technologie die van groot nut kan zijn bij DNA-analyse. Ontwikkelde toepassingen omvatten single-nucleotide polymorfisme genotypering27,28, gemodificeerde nucleotideanalyse29 en DNA-reparatie intermediaire identificatie30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS moet gemakkelijk worden gebruikt voor DNA-glycosylaseanalyse om AP-site-bevattende DNA-producten te detecteren. AP-sites in DNA zijn echter gevoelig voor strengbreuk onder veel experimentele omstandigheden33. Een UDG-test wordt hier gepresenteerd met behulp van MALDI-TOF MS om de productie van AP-locaties rechtstreeks te meten zonder significant strengbreukgeluid. Deze labelvrije methode is gemakkelijk om mee te werken en heeft een hoog potentieel voor de farmaceutische toepassing van DNA-glycosylaseremmerscreening.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van substraat/sjabloon

  1. Ontwerp uracil substraat/sjabloon duplex met een gebalanceerd G+C gehalte van ~50 ± 10% en minimale smelttemperatuur van 50 °C voor het duplexgebied.
    OPMERKING: Eén nucleotideverschil tussen 18 nt substraten en 19 nt sjablonen (tabel 1 en figuur 1) helpt een betere ms-signaalinterpretatie en de juiste gloeiing. De sjabloonstreng dient als aanvullend DNA om A-U- of G-U-mismatches te genereren (tabel 1), maar kan ook worden gebruikt als referentiesignaal in MS-metingen. Het gebruik van HPLC-gezuiverde synthetische oligonucleotiden is bevredigend voor deze studie.
  2. Los DNA op in 1 mM EDTA en 10 mM Tris-HCl (pH 8,0 bij 25 °C) (TE) in een concentratie van 100 μmol/L als bouillon en bewaar bij -20 °C. Verdun deze voorraad van 20 μL met TE tot een eindvolume van 800 μL (25-voudige verdunning tot 4 μmol/L). Meet de absorptie van de DNA-oplossing in een UV-zichtbare spectrofotometer bij λ = 260 nm om de toegewezen concentratie van de fabrikant te garanderen. Bijvoorbeeld: A260 = 0,204 voor 4 μmol/L U+9 en A260 = 0,192 voor 4 μmol/L T1 (tabel 1).
  3. Voer MALDI-TOF MS-analyse (secties 4-6) uit voor oligonucleotidekwaliteitscontrole door unieke pieksignalen te inspecteren bij aangewezen m/z-waarden en door te controleren of de signaal-ruisverhouding >100 is (figuur 1B en figuur 1D).

2. DNA-glycosylasetest

  1. Gebruik een G:U-substraat van T1/U+9 duplex (tabel 1 en figuur 1A) voor de glycosylasereactie, bijvoorbeeld in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml, voeg 70 μl H2O, 10 μl 10x UDG-reactiebuffer, 5 μl T1-voorraad en 5 μl U+9-voorraad toe (stap 1.2.).
    OPMERKING: Kies het juiste type micropipette en volg de instructies van de fabrikant om het vereiste volume te verwerken. Gebruik bijvoorbeeld een pipet van 2 μL om 0,1-2 μL vloeistof af te geven, gebruik een pipet van 10 μL om 2-10 μL vloeistof af te geven en gebruik een pipet van 100 μL om 20-100 μL vloeistof af te geven om de nauwkeurigheid en precisie van de resultaten te garanderen. Het beschreven volume van het reagensmengsel is voor 10 assays; pas het volume aan voor het gewenste aantal reacties. De 1x UDG-reactiebuffer bevat 1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol en 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 bij 25 °C). Zie de tabel met materialen voor de bron van 10x UDG-reactiebuffer.
  2. Sluit de buis veilig af; incubeer in een waterbad gedurende 30 minuten bij 65 °C, vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 °C en ten slotte gedurende 3 minuten op ijs om een goede gloeiing van het substraat / sjabloon duplex te garanderen.
  3. Voeg in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml 49 μl ijskoude 1x UDG-reactiebuffer en 1 μl UDG (5.000 eenheden /ml; zie de materialentabel), verdunnend tot 0,1 eenheden / μL. Maak seriële verdunningen met 1x UDG-buffer tot de gewenste enzymconcentraties van 0,05, 0,02 of 0,01 eenheden / μL. Houd de verdunde UDG altijd op ijs.
    OPMERKING: In een reactie van 10 μL kunnen 0,1 eenheden UDG in 3 minuten meer dan 30 pmol uracil uit een T1/U+9 duplex splijten.
  4. Voeg in een steriele microcentrifugebuis van 1,5 ml 9,0 μl substraatmengsel uit stap 2.2 toe en verwarm de buis voor tot 37 °C. Voeg 1,0 μL van de verdunde UDG uit stap 2.3 toe. Gebruik een timer om de reactie te timen en veeg op de buis om de inhoud te mengen.
    OPMERKING: Voor een eenheidsdefinitietest is de incubatietijd 30 min. Gebruik voor een kinetische test een tijdsverloopanalyse van 0,5, 1, 2, 3, 5 minuten om de initiële snelheid te verkrijgen. Voor een UGI-remmingstest, time de reactie gedurende 15 minuten.
  5. Centrifugeer de buizen met het reactiemengsel gedurende 3-5 s bij 3.200 × g bij omgevingstemperatuur. Breng de reactie vervolgens onmiddellijk over op 37 °C.
  6. Beëindiging van de reactie
    1. Bereid oplossingen voor van 0,25 M HCl en 0,23 M Tris basis. Voeg in een reageerbuis van 15 ml 10 ml van een oplossing van 1 mM EDTA en 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 bij 25 °C) toe om 1x UDG-reactiebuffer na te bootsen. Verzuren met 1 ml van 0,25 M HCl en controleer met een pH-meter of de pH ~2 ± 0,5 is. Neutraliseer met 1 ml van 0,23 M Tris-basis en controleer met een pH-meter op een uiteindelijke pH van 6,5 ± 0,5.
      OPMERKING: Het gebruik van pH-teststrips is een snelle en eenvoudige manier om de pH-waarden van het reagensmengsel opnieuw te bevestigen.
    2. Voeg 1 μL van 0,25 M HCl toe om het 10 μL reactiemengsel te verzuren om het enzym te inactiveren en plaats het gedurende 6 minuten op ijs. Voeg 1 μL van 0,23 M Tris base toe om de DNA-producten te neutraliseren om te voorkomen dat de AP-site breekt door langdurige blootstelling aan zuur. Voeg 13 μL TE toe om het volume van het productmengsel te vergroten voor matrixchipoverdracht en plaats het vervolgens op ijs.
      OPMERKING: Het AP-product is chemisch instabiel en moet binnen 2 dagen door MALDI-TOF MS worden geanalyseerd. Na langdurige opslag gedurende meer dan een week treedt de accumulatie van een aanzienlijk deel van de strengbreuken op als gevolg van β/δ eliminatiereacties van de AP-producten (figuur 1D-G).
  7. Breng alle 25 μL UDG-reactieproducten over van microcentrifugebuizen naar een 384-well microtiterplaat.
    OPMERKING: Hoge concentraties kationen, zoals natrium of kalium in buffers, veroorzaken interferentie in de MALDI-TOF MS-analyse en vereisen dus ontzouting. Omdat E. coli UDG-reactiebuffer zeer lage concentraties kationen bevat, is ontzouting niet nodig. Wijzig dit protocol echter om andere DNA-glycosylasereacties te meten die metaalkationen bevatten die ontzouting vereisen zoals eerder beschreven35.

3. Breng UDG-reactieproducten over naar een matrixchip

  1. Open de deur van de nanoliterdispenser (zie de tabel met materialen) en laad de 384-well microtiterplaat vanaf stap 2.7 op de plaathouder van het dek.
  2. Plaats de matrixchiparray in de overeenkomstige verkennerplaatpositie. Plaats de geladen scoutingplaat op het verwerkingsdek van de nanoliterdispenser en sluit de deur.
  3. Raak de run-knop op het overdrachtsscherm aan en wacht tot het instrument begint met het doseren van monsters van de 384-well microtiterplaat naar de matrixchip.
  4. Gebruik de tabbladoptie Vision om het beeld van de chip en de doseervolumes voor elke plek tijdens het doseren weer te geven. Zorg ervoor dat het gevlekte volume op de chip in het bereik van 5-10 nL ligt.

4. Stel de testparameters in op de massaspectrometer

  1. Gebruik het toepassingsprogramma (zie de tabel met materialen) om een .xlsx bestand met de voorspelde signaal m/z-waarde voor te bereiden voor het importeren.
    OPMERKING: De instellingen in FILE I.xlsx (tabel 2) zijn voorbeeldinstellingen voor de UDG-assay van G:U-substraat in sectie 2.
  2. Gebruik het toepassingsprogramma om een nieuwe UDG-test te maken en te definiëren door met de rechtermuisknop op de optie Import Assay Group in Designer Format te klikken en het .xlsx bestand te selecteren in de vervolgkeuzelijst (bijvoorbeeld FILE I.xlsx uit stap 4.1).
  3. Klik met de rechtermuisknop op de knop Klant:Project:Plaat en klik bovenaan de vervolgkeuzelijst om een nieuwe testplaat vast te stellen. Typ in het dialoogvenster een bestandsnaam (bijvoorbeeld CTT20210620 voor de labcode en testdatum) en selecteer in de vervolgkeuzelijst plaattype het type plaat met 384 bronnen en druk op OK. Zoek naar een lege plaat aan de rechterkant van het scherm.
  4. Klik op de optie Assay ; selecteer de test (bijvoorbeeld FILE I.xlsx) in de vervolgkeuzelijst.
  5. Als u de geselecteerde test (bijvoorbeeld FILE I.xlsx) wilt toewijzen aan elke positie van de monstervlek op de plaat, verplaatst u de cursor naar elke positie van de lege plaat, klikt u om het putje te markeren en klikt u met de rechtermuisknop om Plex toevoegen te selecteren.
  6. Gebruik een desktop- of laptopcomputer om een werklijst op te stellen in .xlsx indeling zonder koptekst (bijvoorbeeld 0620.xlsx van tabel 3) voor alle voorbeelden op de chip uit stap 2.7. Klik op de knop Nieuw voorbeeldproject toevoegen ; selecteer het bestand (bijvoorbeeld 0620.xlsx) in de vervolgkeuzelijst om de werklijst te importeren.
  7. Zoek naar alle testvoorbeeldcodes in de werklijst (bijvoorbeeld van 0620.xlsx) aan de linkerkant van het scherm. Klik op de voorbeeldcode in de werklijst en klik met de rechtermuisknop op de overeenkomstige positie van de plaat om de tests aan elke positie te koppelen.

5. Werking van de massaspectrometer

  1. Gebruik het toepassingsprogramma om de massaspectrometer (zie de tabel met materialen) te koppelen aan de monsterchip (uit sectie 3) die moet worden geanalyseerd.
  2. Klik op de standaardinstelling. Typ in het dialoogvenster een bestandsnaam uit stap 4.3 (bijvoorbeeld CTT20210620); in de experimentnaam, typ de chip-id in de chipcode en sla de instellingen op.
  3. Start het besturingsprogramma van de massaspectrometer (zie de tabel met materialen).
  4. Druk op de in/uit-knop van de massaspectrometer en laat het dek uitschuiven. Haal de chiphouder eruit en steek de monsterchip uit stap 3.4 in de chiphouder. Plaats de geladen spaanhouder op het verlengde dek en druk op de in/uit-knop om de samplechip in het instrument te laten komen.
  5. Dubbelklik op het pictogram Aanschaffen van het toepassingsprogramma. Klik in het venster Acquire op het tabblad Auto Run om het instrument te starten en massaspectra te verkrijgen van de monsters op de chip.

6. Massaspectra bekijken en de gegevens analyseren

  1. Voer het data-analyseprogramma uit (zie de tabel met materialen).
  2. Blader door de databasestructuur en selecteer de chip-id uit stap 5.2. Klik om een doelput op de chip te markeren en klik op het spectrumpictogram om het massaspectrum weer te geven.
  3. Klik met de rechtermuisknop om Aanpassingsdialoogvenster te kiezen om een specifiek spectrumbereik bij te snijden in een nieuw venster. Klik op de X-as om de boven- en ondergrens van m/z in te voeren en druk op OK om het opgegeven bereikspectrum weer te geven, inclusief de signalen van belang.
    OPMERKING: De hoeveelheid DNA is evenredig met de piekintensiteit bij elke m/z-waarde-eenheid.
  4. Meet de piekhoogte van de m/z-waarden van de signalen die overeenkomen met U-substraat, AP-product en sjabloon. Klik op de piek en bekijk de piekhoogte in de linkerbovenhoek van het scherm.
    OPMERKING: Een spectrum van 1.600 breedte / 1.200 eenheden is een redelijke afmeting voor inspectie op een computerscherm en voor het bijhouden van gegevens.
  5. Als u het spectrum wilt opslaan voor archivering, klikt u met de rechtermuisknop op Exporteren en selecteert u JPEG-bestandstype in de vervolgkeuzelijst. Klik op Bestemming en Bladerschijf om het opslagapparaat in de vervolgkeuzelijst te selecteren (bijv. Flash disc E:). Typ de bestandsnaam (bijvoorbeeld 0620_1-2.jpg) en klik op Exporteren.
  6. Druk indien nodig een geëxporteerd JPEG-bestand af en meet de piekhoogte handmatig met een liniaal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Sjablonen en substraten
Met synthetische oligonucleotiden met U in het midden (U+9) in combinatie met een G-sjabloon als voorbeeld (figuur 1A), kan een blanco controle van equimolaire hoeveelheden sjabloon- en uracilbevattend substraat worden gebruikt voor kwaliteitscontrole van synthetische oligonucleotidezuiverheid (figuur 1B; de signalen komen overeen met de aangewezen m /z en de lage achtergrondruis). Voor de MS-data-analyse zijn de piekh...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel biedt een gedetailleerde procedure voor het gebruik van een UDG MALDI-TOF MS-testmethode om AP-bevattende DNA-producten direct te detecteren. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat uracil-bevattende substraten labelvrij, schaalbaar, gemakkelijk om mee te werken zijn en meer flexibiliteit bieden in substraatontwerp.

De door de leverancier aanbevolen fenol/chloroform-extractie van UDG maakt inactivatie van het enzym mogelijk om afbraak van product-DNA te voorkomen. Het ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken de NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) en het NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, Taiwan, R.O.C. [subsidienummer MOST109-2314-B-002 -186 naar K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 naar S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 naar W.-h.F.]. H.-L.C. is een ontvanger van een doctoraatsbeurs van de National Taiwan University. Financiering voor open access charge: Ministerie van Wetenschap en Technologie, R.O.C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base)J.T bakerProtocol 1,2
Geautoclaveerd gedeïoniseerd waterMILLIPOREProtocol 1,2
EDTAJ.T BakerProtocol 1,2
HandschoenenAQUAGLOVEProtocol 1,2,3
Zoutzuur (HCl)SIGMAProtocol 1,2
IJsemmerTaiwan.IncProtocol 2
Pipettippunten met lage retentie(0,5-10 µL)extra geneProtocol 1,2
Pipettippunten met lage retentie(1.250 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
Pipettippunten met lage retentie(200 µL)national scientific supply co, Inc.Protocol 1,2
MassARRAY Agena Bioscience, CAProtocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY NanodispenserAAT Bioquest, Inc.RS1000Protocol 3
MicrocentrifugeKubotaProtocol 2
MicrocentrifugeClubioProtocol 2
Microcentrifugebuis (1,5 mL)National scientific supply co, Inc.Protocol 2
MicrocentrifugebuisjesrekTaiwan.IncProtocol 1,2
Micropipet (P1000)GilsonProtocol 1,2
Micropipet (P2)GilsonProtocol 1,2
Micropipet (P10)GilsonProtocol 1,2
Micropipet (P100)GilsonProtocol 1,2
Micropipet (P200)GilsonProtocol 1,2
Micropipet (SL2)RaininProtocol 1,2
OligonucleotidenIntegrated DNA Technologies (Singapore)Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1)AAT Bioquest, Inc.Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Natriumhydroxide (NaOH)WAKOProtocol 2
SpectroCHIP array Agena Bioscience, CA#01509Protocol 3, 5
TimerTaiwan.IncProtocol 2
Typer 4.0 software Agena Bioscience, CA#10145Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reactiebuffer (10x)New England Biolabs, MAB0280SProtocol 2
Uracil Glycosylase InhibitorNew England Biolabs, MAM0281SProtocol 2
Uracil-DNA GlycosylaseNew England Biolabs, MAM0280LProtocol 2
UV-VISBLE spectrofotometer UV-1601SHIMADZUProtocol 1
WaterbadZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc)Protocol 2

Referenties

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741(2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochemistry. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O'Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155(2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039(2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862(2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochemistry. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028(2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894(2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

MALDI-TOF-massaspectrometriebase-excisie-reparatiedetectie van AP-sitesDNA-reparatiemechanismenuracilhydrolyseglycosylaseremmer-screeningsynthetische DNA-duplexenzymactiviteitsassay
Uracil-DNA Glycosylase Assay door Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.