Methodenartikel

Live-3D-cel immunocytochemie Assays van pediatrische diffuse middellijn glioom

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63091

⸱

11 november 2021

 ,  ,  , 
1Department of Onco-hematology, Gene and Cell Therapy, Bambino Gesù Children's Hospital, IRCCS, 2Oncology Service, Children's Health Queensland Hospital and Health Service, 3Child Health Research Centre, The University of Queensland

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie presenteert een protocol van live-3D-cel immunocytochemie toegepast op een pediatrische diffuse midline glioom cellijnlijn, nuttig om in real-time de expressie van eiwitten op het plasmamembraan te bestuderen tijdens dynamische processen zoals 3D-celinvasie en migratie.

Samenvatting

Celmigratie en invasie zijn specifieke kenmerken van Diffuse Midline Glioma (DMG) H3K27M-mutante tumoren. We hebben deze functies al gemodelleerd met behulp van driedimensionale (3D) celgebaseerde invasie- en migratietests. In deze studie hebben we deze 3D-assays geoptimaliseerd voor live-cell immunocytochemie. Een antilichaamlabelreagens werd gebruikt om in realtime de expressie van het adhesiemolecuul CD44 te detecteren, op het plasmamembraan van migrerende en binnendringende cellen van een DMG H3K27M primaire patiënt-afgeleide cellijn. CD44 is geassocieerd met kankerstamcelfenotype en tumorcelmigratie en -invasie en is betrokken bij de directe interacties met de extracellulaire matrix van het centrale zenuwstelsel (CZS). Neurosferen (NS) uit de DMG H3K27M-cellijn werden ingebed in de basale membraanmatrix (BMM) of geplaatst op een dunne coatinglaag van BMM, in aanwezigheid van een anti-CD44-antilichaam in combinatie met het antilichaametiketteringsreagens (ALR). De live-3D-cell immunocytochemische beeldanalyse werd uitgevoerd op een live-cell analyse-instrument om de totale CD44-expressie kwantitatief te meten, specifiek op de migrerende en binnendringende cellen. De methode maakt het ook mogelijk om in real-time de intermitterende expressie van CD44 op het plasmamembraan van migrerende en binnendringende cellen te visualiseren. Bovendien leverde de test ook nieuwe inzichten op in de potentiële rol van CD44 in de mesenchymale naar amoeboïde overgang in DMG H3K27M-cellen.

Inleiding

Het vermogen van tumorcellen om te ontwijken en zich te verspreiden door het omliggende weefsel is een kenmerk van kanker1. In het bijzonder is tumorcelmotiliteit een kenmerkend kenmerk van kwaadaardige tumoren, of het nu gaat om een gemetastaseerd tumortype zoals borst2 of colorectale kanker3 of een lokaal invasief type zoals diffuus glioom 4,5.

Beeldvorming speelt een centrale rol in het onderzoek naar vele aspecten van tumorcelfenotypen; Live-cell imaging heeft echter zeker de voorkeur bij het bestuderen van dynamische cellulaire processen zoals migratie en invasie, wanneer veranderingen in morfologie en cel-celinteractie 6,7 optreden en in de loop van de tijd gemakkelijker kunnen worden onderzocht. Voor live-cell imaging kunnen verschillende optische microscopiesystemen worden gebruikt, van fasecontrast tot confocale fluorescerende microscopen, en beeldacquisitie uitgevoerd over een korte of lange periode op een omgekeerde microscoop uitgerust met een kamer voor temperatuur- en CO2-regeling, of in high-content beeldanalysesystemen met ingebouwde kamers, of als alternatief in beeldsystemen die in de incubator kunnen zitten zonder de cellen gedurende de hele duur te hoeven verstoren van het experiment. De keuze van het gebruikte systeem wordt vaak bepaald door een aantal factoren, zoals de benodigde resolutie, de lengte van de totale acquisitietijd en tijdsintervallen, het gebruikte vattype en de doorvoer van de test (enkele kamer of multi-well plaat), de gevoeligheid van de gebruikte cellen (kostbare en / of zeldzame cellen) en fototoxiciteit van de cellen als fluoroforen aanwezig zijn.

Met betrekking tot fluorescerende beeldvorming in live-modus kan dit worden bereikt door cellen te transduceren voor de expressie van fluorescerende eiwitten, hetzij voor stabiele expressie of als een induceerbaar systeem8, door transiënte celtransfectie, of door celkleurstoffen te gebruiken die nu beschikbaar zijn voor live-cell labeling7, voor live-cell tracking en voor het labelen van subcellulaire organellen9.

Een nuttige benadering is onlangs ontwikkeld voor live-cell immunocytochemie, waarbij een antilichaam dat een oppervlaktemarker naar keuze herkent, kan worden gebonden aan een etiketteringsreagens, en na toevoeging aan de kweekmedia kunnen cellen die de specifieke marker tot expressie brengen gemakkelijk in realtime worden afgebeeld door live-cell imaging. De visualisatie en kwantificering van markerexpressie met behulp van een dergelijk systeem kan gemakkelijk worden bereikt wanneer cellen worden gekweekt in tweedimensionale (2D) cultuuromstandigheden10.

In deze studie hebben we protocollen geoptimaliseerd voor live-3D-cel immunocytochemische invasie en migratie van pediatrische diffuse midline glioma (DMG) patiënt-afgeleide cellen11,12. DMG zijn zeer agressieve hersentumoren die kinderen treffen, voor de overgrote meerderheid geassocieerd met de drivermutatie K27M in histon H3-varianten. DMG ontstaat in de hersenstam en de middellijngebieden van het centrale zenuwstelsel (CZS) en wordt gekenmerkt door een zeer infiltratief karakter. Van deze invasieve capaciteit is aangetoond dat deze ten minste gedeeltelijk wordt gemedieerd door de intratumor heterogeniteit en de kankerstamachtige kenmerken van DMG-cellen7.

Om onze testen te illustreren, werd een antilichaamlabelreagens (ALR) gebruikt in combinatie met een antilichaam voor CD44. CD44 is een transmembraan glycoproteïne en adhesiemolecuul uitgedrukt op stamcel- en andere celtypen, geassocieerd met kankerstamcelfenotype en tumorcelmigratie en invasie13. De protocollen omvatten de monstervoorbereiding, de beeldacquisitie in brightfield- en fluorescerende modus en de analyse op een live-cell analyse-instrument dat het mogelijk maakte om kwantitatief in realtime de algehele CD44-expressie op het DMG-celmembraan te meten tijdens 3D-invasie en migratie. De testen maakten het ook mogelijk om het intermitterende fluorescerende signaal van CD44 op individuele cellen te visualiseren tijdens het migreren en binnendringen. Interessant is dat ook een effect van het anti-CD44-antilichaam werd waargenomen, dat mogelijk als een blokkerend antilichaam fungeerde, ook de celmigratie en invasie leek te verminderen en een omschakeling van het invasiepatroon van een collectief mesenchymaal-achtig naar een meer eencellig amoeboïde-achtig fenotype induceerde.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissies voor menselijk onderzoek van de instellingen.

OPMERKING: Deze studie werd uitgevoerd met behulp van Incucyte S3 en/of SX5 Live-Cell Analysis Instrument (aangeduid als live cell analysis instrument).

1. Generatie van reproduceerbare tumorsferoïden

OPMERKING: Het protocol (sectie 1) beschreven door Vinci et al. 2015 7,12, werd gebruikt zoals hieronder vermeld, met enkele wijzigingen:

  1. Verzamel de DMG H3K27M-mutante neurosferen (NS) en centrifugeer op 170 x g gedurende 10 minuten (min) bij kamertemperatuur (RT).
  2. Incubeer de NS met 500 μL van de accutase-oplossing gedurende 3 minuten bij 37 °C om ze te breken.
  3. Neutraliseer de accutase-oplossing met tumorstamcel (TSM) medium7 en centrifugeer de celsuspensie op 355 x g gedurende 5 minuten bij RT.
  4. Resuspendie van de celkorrel in 1 ml TSM-medium en tel vervolgens de cellen met behulp van een celtelkamer.
  5. Verdun de celsuspensie om 2,5-5 x 103cellen/ml te verkrijgen en zaai 100 μL/goed in ultralage aanhechtingsplaten (ULA) 96-well rondbodemplaten (zie materiaaltabel). Gebruik een juiste celdichtheid om individuele NS van ~ 300 μm diameter te verkrijgen, 4 dagen na het zaaien van de cel (250-500 cellen / put voor zeer agressieve glioomcellen).
  6. Bevestig de NS-vorming visueel met behulp van een omgekeerde microscoop 4 dagen na het zaaien van de cel.

2. Voorbereiding van het ALR/antilichaamcomplex en opstelling voor de invasietest

OPMERKING: Voor de antilichaametiketteringsprocedure wordt het antilichaametiketteringskleurstoffenprotocol10 voor live-cell immunocytochemie gebruikt met enkele wijzigingen, zoals hieronder vermeld. Voor de invasietest wordt het eerder beschreven protocol gevolgd door Vinci et al.2015 12 .

  1. Overweeg het aantal putten (bijvoorbeeld 60 putten) om het volume dat nodig is voor elk reagens te analyseren en te berekenen. Neem ook de putjes op voor de negatieve controle (monsters met ALR maar zonder antilichaam).
  2. Voeg 100 μL steriel water toe aan de ALR om het reagens te hydrateren (eindconcentratie = 0,5 mg/ml). Pipetteer om de oplossing te mengen.
    OPMERKING: Het reagens is lichtgevoelig; Blijf daarom in het donker. Aliquot het overgebleven reagens en bewaar bij -80 °C (vermijd bevriezen en ontdooien).
  3. Meng het antilichaam met de ALR in het TSM-medium (of geschikte celgroeimedia voor de cellijn van keuze) in een ronde bodem multi-well plaat of in een amberkleurige buis en bescherm tegen licht.
  4. Bereid voldoende hoeveelheid van het medium voor om 25 μL/put af te geven bij 3x de eindtestconcentratie. Incubeer bij RT gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: Een 1:3 molaire verhouding van antilichaam tot ALR wordt aanbevolen, met een uiteindelijke (1x) concentratie van het testantilichaam <1,5 μg/ml. Voor de experimenten in dit protocol wordt een anti-humaan CD44 muizenantilichaam gebruikt (startconcentratie 86 μg/ml) bij een eindconcentratie van 0,1 μg/ml (3x concentratie = 0,3 μg/ml). Voeg de reagentia in de volgende volgorde toe: i) antilichaam; ii) ALR; iii) TSM-medium. Meng door pipetteren.
  5. Verdun het achtergrondsuppressorreagens (BSR) in TSM-medium (of geschikte celgroeimedia voor de cellijn naar keuze) tot 1,5 mM (3x) om aan het einde van de test een eindconcentratie van 0,5 mM te verkrijgen.
  6. Voer de invasietest rechtstreeks uit in de ULA 96-put ronde bodemplaat waar cellen aanvankelijk werden gezaaid. Controleer de NS visueel met een omgekeerde microscoop voordat u begint.
  7. Verwijder voorzichtig en langzaam 75 μL/put van het medium, vermijd het aanraken van de bodem van de put waar de NS zit. Controleer de aanwezigheid van de NS visueel.
  8. Voeg voorzichtig 25 μL van de BSR toe aan elk putje.
  9. Voeg voorzichtig 25 μL van het ALR/antilichaamcomplex toe aan elk putje. Wacht 2 of 3 minuten om het ALR/antilichaamcomplex te laten mengen met het medium.
  10. Controleer visueel met een omgekeerde microscoop om er zeker van te zijn dat elke NS zich centraal op de bodem van de put bevindt. Vermijd de vorming van bubbels. Als er een bubbel aanwezig is, verwijder deze dan met een naald.
  11. Leg de plaat op ijs en wacht 5 minuten om de bodem van de plaat koud te laten worden.
  12. Doseer met een voorgekoelde p200-tip 75 μL/put basale membraanmatrix (BMM), plaats de pipetpunt op de binnenwand van de put en vermijd het aanraken van de bodem van de put. Vermijd de vorming van bubbels en verwijder met een steriele naald de bestaande.
    LET OP: Zorg ervoor dat je de BMM bij 4 °C van de avond ervoor hebt ontdooid.
  13. Laat de plaat 5 minuten op het ijs staan om de BMM te laten mengen met het medium. Controleer visueel met een omgekeerde microscoop de aanwezigheid van de NS en of ze centraal in de put liggen. Zo niet, centrifugeer de plaat dan gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 180 x g .
  14. Breng de plaat over in het analyse-instrument voor levende cellen (materiaaltabel) dat in de incubator is geplaatst bij 37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid.

3. Voorbereiding van het ALR/antilichaamcomplex en opstelling voor de migratietest

OPMERKING: Voor de antilichaametiketteringsprocedure wordt het etiketteringskleurstoffenprotocol10 voor live-cell immunocytochemie gebruikt.

  1. Overweeg het aantal putten om het volume dat nodig is voor elk reagens te analyseren en te berekenen. Neem ook de putten op die nodig zijn voor de negatieve controles. Controleer de NS visueel met een omgekeerde microscoop voordat u begint.
  2. Gebruik platen met een vlakke bodem van 96 putten. Voer de coatingprocedure uit zoals beschreven door Vinci et al., 201314. Voor dit onderzoek wordt de BMM gebruikt als dunne coating.
  3. Zodra de coating klaar is, verwijdert u de overtollige BMM-coating met een p200-tip die de punt in de rand van de put plaatst en de bodem niet raakt. Als u met meerdere putten werkt, gebruikt u een pipet met meerdere kanalen.
  4. Snijd een p200-punt, neem 50 μL van het celmedium + NS uit elke geselecteerde put en breng deze over naar een gecoate platte bodemput. Controleer de aanwezigheid en de positie van de NS in elke put visueel.
    LET OP: Elke NS moet centraal in de put liggen. Vermijd het leunen op de punt aan de rand van de put tijdens de overdracht, maar laat het medium centraal in de put vallen zonder de bodem aan te raken. Overweeg voor sterk migrerende cellen een hoger aantal replicaties dan de standaard drie replicaties. Dit komt omdat wanneer NS te dicht bij de rand van de put zit, de migrerende cellen een kleiner deel van de put kunnen bedekken.
  5. Rehydrateer de ALR zoals hierboven beschreven (stappen 2.2-2.3).
    OPMERKING: Reagens is lichtgevoelig. Zie hierboven voor goede behandelingsprocedures.
  6. Meng het antilichaam met ALR in de juiste complete celgroeimedia in een multi-well plaat met ronde bodem of in een amberkleurige buis en bescherm tegen licht. Bereid voldoende hoeveelheid voor om 50 μL/put af te geven bij 3x de eindtestconcentratie. Incubeer bij RT gedurende 15 minuten.
    OPMERKING: Voeg de reagentia toe in de volgorde zoals hierboven aangegeven (stap 2.4).
  7. Volg dezelfde procedure als beschreven in stap 2.5.
  8. Voeg voorzichtig 50 μL van de BSR toe aan elk putje.
  9. Voeg voorzichtig 50 μL van het ALR/antilichaam toe aan elk putje. Wacht 2 of 3 minuten om de reagentia te laten mengen en controleer visueel met behulp van een omgekeerde microscoop om ervoor te zorgen dat de meeste replicerende NS zich centraal in de put bevinden.
  10. Vermijd de vorming van bubbels en verwijder bestaande bubbels met behulp van een naald. Breng de plaat voorzichtig over in het analyse-instrument voor levende cellen dat in de incubator is geplaatst bij 37 °C, 5% CO2, 95% vochtigheid.

4. Live-cell analyse instrument instelling voor beeldacquisitie

  1. Scan de platen met behulp van het live-cell analyse-instrument (voor specificaties, zie tabel met materialen) met scanintervallen vanaf tijdpunt nul (t0) van de invasie- en migratietests die respectievelijk na stap 2.14 zijn ingesteld. en 3.10. tot 96 uur.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u het analyse-instrument voor levende cellen onmiddellijk na het begin van de invasie- en migratietest kunt verwijderen. Afhankelijk van het tumortype kunnen cellen al binnen 1 uur na de testopstelling beginnen binnen te dringen of migreren van de NS.
  2. Selecteer in de software van het live-celanalyse-instrument de optie Schedule to Acquire. Klik op het tabblad + en selecteer de optie Scannen op schema.
  3. Klik in het softwarevenster Vaartuig maken of herstellen op de optie Nieuw.
  4. Selecteer de specifieke toepassing in het live-cell analyse-instrument voor de invasie- en migratie-acquisitie. Selecteer Spheroid scan type, 4x objective, Phase+Brightfield en Green image kanalen voor de invasie assay. Selecteer Dilution Cloning scan type, 4x objective en Phase and Green voor de migratietest.
  5. Selecteer het plaattype en definieer de te scannen putten door ze te markeren op de plaatkaart.
  6. Stel de scanfrequentie in (voor de experimenten in dit protocol was de scanfrequentie 15 minuten voor invasie en 30 minuten voor migratie).
  7. Klik op Toevoegen aan schema en start de scan.

5. Live-cell analyse instrument instelling voor beeldanalyse

  1. Selecteer het tabblad Nieuwe analysedefinitie maken.
  2. Selecteer Spheroid Invasion of Basic Analyzer-toepassing voor respectievelijk invasie en migratie op het tabblad.
  3. Selecteer de juiste invasie- en migratiekanalen (voor Invasie: Fase +Brightfield-Groen; voor Migratie: Fasegroen) in het afbeeldingskanaal.
  4. Selecteer enkele representatieve afbeeldingen uit 3-4 putten om een voorbeeld te bekijken en de analyse-instelling te verfijnen.
  5. Voor de invasietest past u op het tabblad Analysedefinitie de toepassingsinstellingen in de Brightfield - en Green-kanalen aan met de volgende instelling om een nauwkeurige segmentatie te genereren tussen de Whole Spheroid en Invading Cells (zie Figuur 5; blauw masker):
    Brightfield Segmentatie: Hele Sferoïde gevoeligheid = 50; Binnendringende celgevoeligheid = 100; Opschonen = standaard.
    Hele sferoïde filters: stel alle parameters in als standaard.
    Invading Cells Filters: stel alle parameters in als standaard.
    Groene segmentatie: straal = 900.
  6. Voor migratietest past u de toepassingsinstellingen in de kanalen Fase en Groen aan om een nauwkeurige segmentatie tussen de samenvloeiings- en groene cellen te genereren (zie Figuur 5, gele en roze maskers) met de volgende instelling:
    Fase: stel alle parameters als standaard in.
    Groene segmentatie: straal = 300; Drempel = 1000
    Opruimen: Gaten vullen = 400; Filters = standaard.
    Whole Well: stel alle parameters als standaard in.
  7. Controleer of de analyse-instellingen correct zijn voor de NS door willekeurig op meerdere putten te klikken. De segmentatie moet de sferoïde omlijnen. Zo niet, pas dan de instelling dienovereenkomstig aan.
  8. Selecteer de putten en tijdpunten die u wilt analyseren.
  9. Sla de analysedefinitie op en klik op Voltooien.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Live-3D-Cell Immunocytochemistry protocol voor invasie en migratie is samengevat in een eenvoudige en reproduceerbare workflow in figuur 1. Door de DMG-cellen in ULA 96-well rondebodemplaten te zaaien, worden reproduceerbare NS-groottes verkregen en gebruikt in de weergegeven stappen. Wanneer de NS de ideale grootte van ~300 μm hebben bereikt (ongeveer 4 dagen na het zaaien) worden de invasie12 en migratie14 testen gestart. De toevoeging van he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De live-3D-cel immunocytochemie die we hier hebben aangenomen voor pediatrische DMG-invasie en migratie kan gemakkelijk worden aangepast, ook voor andere zeer invasieve tumorceltypen, waaronder borst- en darmkankercellijnen.

Anders dan eerder uitgevoerde live-2D-cel immunocytochemie assays10, wordt bij het werken in 3D voorgesteld om aandacht te besteden aan enkele kritieke stappen. In het bijzonder wordt voor de invasietest die we beschrijven, geadviseerd om de ALR / ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen relevante banden of financiële betrokkenheid bij een organisatie of entiteit met een financieel belang in of financieel conflict met het onderwerp of de materialen die in het manuscript worden besproken.

Dankbetuigingen

We willen Dr. Silvia Soddu en Dr. Giulia Federici (Unit of Cellular Networks and Molecular Therapeutic Targets, IRCCS-Regina Elena National Cancer Institute, Rome, Italië) bedanken voor de toegang tot het IncuCyte S3 Live Cell Imaging System in de voorlopige opzet van het beeldvormingsprotocol. Bovendien danken we Bernadett Kolozsvari voor het technische advies. De studie werd ondersteund door de Children with Cancer UK-beurs (16-234) en het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid Ricerca Corrente. M Vinci is een Children with Cancer UK Fellow. R Ferretti is een ontvanger van de Fondazione Veronesi Fellowship (2018 en 2019). De auteurs erkennen Fondazione Heal voor hun steun en de Children's Hospital Foundation voor het financieren van de Queensland Children's Tumor Bank.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96 Well TC-Treated MicroplatesCorning3595maat 96 wells, polystyreen plaat, platte bodem
AccutaseEurocloneECB3056Doplossing voor neurosfeer dissociatie
Burker kamerMv medicalFFL16034celtellingskamer
CD-44 (156-3C11)Cell Signaling Technology3570Muis mAb IgG2a
Corning Matrigel MatrixCorning356237Basale Membraan Matrix (BMM), Fenol Rood-vrij, LDEV-vrij
Fabfluor-488 Antibody Labeling DyeIncucyte4743Antilichaam labelreagens (ALR): Muis IgG2a 488 antilichaam voor Live-Cell Immunocytochemie
Incucyte S3 en/of SX5 Live-Cell Analyse InstrumentSartorius-Het Incucyte S3 en/of SX5 Instrument wordt gebruikt voor real-time celmonitoring en surveillance, celgezondheid en levensvatbaarheid, migratie en invasie, plus een breed scala aan fenotypische cel-gebaseerde assays.
Omgekeerd Microscoop-elke omgekeerde microscoop
Opti-Green Background Suppressor ReagentIncucyte6500-0045Backgroung suppressor reagens (BSR)
Tumor stamcel (TSM) medium--groeicelmedium (zie referentie in de tekst voor details)
Ultra-Low Attachment Multiple Well PlateCorning Costar7007maat 96 well, ronde bodem helder

Referenties

  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Weigelt, B., Peterse, J. L., van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nature Reviews Cancer. 5 (8), 591-602 (2005).
  3. Magrì, A., Bardelli, A. Does early metastatic seeding occur in colorectal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 16 (11), 651-653 (2019).
  4. Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
  5. Caretti, V., et al. Subventricular spread of diffuse intrinsic pontine glioma. Acta Neuropathologica. 128 (4), 605-607 (2014).
  6. Pericoli, G., et al. Integration of multiple platforms for the analysis of multifluorescent marking technology applied to pediatric GBM and DIPG. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6763(2020).
  7. Vinci, M., et al. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nature Medicine. 24 (8), 1204-1215 (2018).
  8. Shuen, W. H., Kan, R., Yu, Z., Lung, H. L., Lung, M. L. Novel lentiviral-inducible transgene expression systems and versatile single-plasmid reporters for in vitro and in vivo cancer biology studies. Cancer Gene Therapy. 22 (4), 207-214 (2015).
  9. Huang, C. C., et al. Autophagy-regulated ROS from xanthine oxidase acts as an early effector for triggering late mitochondria-dependent apoptosis in cathepsin s-targeted tumor cells. PLoS One. 10 (6), 0128045(2015).
  10. Prudner, B. C., et al. Arginine starvation and docetaxel induce c-Myc-driven hENT1 surface expression to overcome gemcitabine resistance in ASS1-negative tumors. Clinical Cancer Research. 25 (16), 5122-5134 (2019).
  11. Ferretti, R., et al. Tumor cell invasion into Matrigel: optimized protocol for RNA extraction. Biotechniques. 70 (6), 327-335 (2021).
  12. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52686(2015).
  13. Chen, C., Zhao, S., Karnad, A., Freeman, J. W. The biology and role of CD44 in cancer progression: therapeutic implications. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 64(2018).
  14. Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods in Molecular Biology. 986, 253-266 (2013).
  15. Taylor, K. R., et al. Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma. Nature Genetics. 46 (5), 457-461 (2014).
  16. Mount, C. W., et al. Potent antitumor efficacy of anti-GD2 CAR T cells in H3-K27M. Nature Medicine. 24 (5), 572-579 (2018).
  17. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system: A summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
  18. Czabanka, M., et al. Junctional adhesion molecule-C mediates the recruitment of embryonic-endothelial progenitor cells to the perivascular niche during tumor angiogenesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1209(2020).
  19. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  20. Panková, K., Rösel, D., Novotný, M., Brábek, J. The molecular mechanisms of transition between mesenchymal and amoeboid invasiveness in tumor cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (1), 63-71 (2010).
  21. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), 1639-1651 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D celassayslive cell imagingcelmigratiecelinvasieCD44 expressieimmunocytochemische assaymesenchymale amoebo de transitieneurosfeer invasieantilichaamlabeling

Gerelateerde artikelen