Methodenartikel

Het genereren van zelfassemblerende organoïden voor het menselijk hart afgeleid van pluripotente stamcellen

DOI:

10.3791/63097

⸱

15 september 2021

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Division of Developmental and Stem Cell Biology, Michigan State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een protocol om ontwikkelingsrelevante menselijke hartorganoïden (hHO's) efficiënt te maken met behulp van menselijke pluripotente stamcellen door zelforganisatie. Het protocol is gebaseerd op de sequentiële activering van ontwikkelingssignalen en produceert zeer complexe, functioneel relevante menselijke hartweefsels.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen om de ontwikkeling van het menselijk hart in gezondheid en ziekte te bestuderen, wordt sterk beperkt door het vermogen om de complexiteit van het menselijk hart in vitro te modelleren. Het ontwikkelen van efficiëntere orgaanachtige platforms die complexe in vivo fenotypen kunnen modelleren, zoals organoïden en organen-op-een-chip, zal het vermogen om de ontwikkeling en ziekte van het menselijk hart te bestuderen verbeteren. Dit artikel beschrijft een protocol om zeer complexe menselijke hartorganoïden (hHO's) te genereren door zelforganisatie met behulp van menselijke pluripotente stamcellen en stapsgewijze ontwikkelingswegactivering met behulp van kleine molecuulremmers. Embryoïde lichamen (EB's) worden gegenereerd in een 96-well plaat met ronde bodem, ultra-lage bevestigingsputten, waardoor de suspensiecultuur van geïndividualiseerde constructies wordt vergemakkelijkt.

De EB's ondergaan differentiatie in hHO's door een driestaps Wnt-signaleringsmodulatiestrategie, die een initiële Wnt-routeactivering omvat om het lot van het cardiale mesoderm te induceren, een tweede stap van Wnt-remming om definitieve cardiale afstammingslijnen te creëren en een derde Wnt-activeringsstap om pro-epicardiale orgaanweefsels te induceren. Deze stappen, uitgevoerd in een 96-well formaat, zijn zeer efficiënt, reproduceerbaar en produceren grote hoeveelheden organoïden per run. Analyse door immunofluorescentie beeldvorming van dag 3 tot dag 11 van differentiatie onthult eerste en tweede hartveldspecificaties en zeer complexe weefsels in hHO's op dag 15, inclusief myocardiaal weefsel met regio's van atriale en ventriculaire cardiomyocyten, evenals interne kamers bekleed met endocardiaal weefsel. De organoïden vertonen ook een ingewikkeld vasculair netwerk door de hele structuur en een externe bekleding van epicardiaal weefsel. Vanuit functioneel oogpunt kloppen hHO's robuust en vertonen ze een normale calciumactiviteit zoals bepaald door Fluo-4 live imaging. Over het algemeen vormt dit protocol een solide platform voor in vitro studies in menselijke orgaanachtige hartweefsels.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aangeboren hartafwijkingen (CHD's) zijn het meest voorkomende type aangeboren afwijking bij de mens en treffen ongeveer 1% van alle levendgeborenen1,2,3. Onder de meeste omstandigheden blijven de redenen voor CHD's onbekend. Het vermogen om menselijke hartmodellen in het laboratorium te maken die sterk lijken op het zich ontwikkelende menselijke hart, vormt een belangrijke stap voorwaarts om de onderliggende oorzaken van CHD's bij mensen rechtstreeks te bestuderen in plaats van in surrogaatdiermodellen.

De belichaming van in het laboratorium gekweekte weefselmodellen zijn organoïden, 3D-celconstructies die lijken op een orgaan dat van belang is voor de celsamenstelling en fysiologische functie. Organoïden zijn vaak afgeleid van stamcellen of voorlopercellen en zijn met succes gebruikt om vele organen te modelleren, zoals de hersenen4,5, nier6,7, darm8,9, long10,11, lever12,13 en pancreas14,15 , om er maar een paar te noemen. Recente studies zijn naar voren gekomen die de haalbaarheid aantonen van het creëren van zelfassemblerende hartorganoïden om de hartontwikkeling in vitro te bestuderen. Deze modellen omvatten het gebruik van embryonale stamcellen van muizen (mESCs) om vroege hartontwikkeling te modelleren16,17 tot atrioventriculaire specificatie18 en menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) om multi-kiemlaag cardiale endoderm organoïden19 en gekamerde cardioïden20 met zeer complexe cellulaire samenstelling te genereren.

Dit artikel presenteert een nieuw 3-staps WNT-modulatieprotocol om zeer complexe hHO's op een efficiënte en kosteneffectieve manier te genereren. Organoïden worden gegenereerd in 96-well platen, wat resulteert in een schaalbaar, high-throughput systeem dat eenvoudig kan worden geautomatiseerd. Deze methode is gebaseerd op het creëren van hPSC-aggregaten en het activeren van ontwikkelingsstappen van cardiogenese, waaronder mesoderm- en cardiale mesodermvorming, eerste en tweede hartveldspecificatie, pro-epicardiale orgaanvorming en atrioventriculaire specificatie. Na 15 dagen differentiatie bevatten hHO's alle belangrijke cellijnen in het hart, goed gedefinieerde interne kamers, atriale en ventriculaire kamers en een vasculair netwerk in de organoïde. Dit zeer geavanceerde en reproduceerbare hartorganoïde systeem is vatbaar voor het onderzoeken van structurele, functionele, moleculaire en transcriptomische analyses in de studie van hartontwikkeling en ziekten en farmacologische screening.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hPSC cultuur en onderhoud

OPMERKING: De door de mens geïnduceerde PSC's (hiPSC's) of menselijke embryonale stamcellen (hESCs) moeten gedurende ten minste 2 opeenvolgende passages na het ontdooien worden gekweekt voordat ze worden gebruikt om EB's te genereren voor differentiatie of verdere cryopreservatie. hPSC's worden gekweekt in PSC-medium (zie de tabel met materialen) op keldermembraan-extracellulaire matrix (BM-ECM)-gecoate 6-well kweekplaten. Bij het uitvoeren van mediumveranderingen op hPSC's in 6-putplaten, voegt u het medium rechtstreeks toe aan de binnenkant van de put in plaats van direct bovenop de cellen om ongewenste celloslating of stress te voorkomen. Gebruikers moeten op hun hoede zijn voor het voorverwarmen van PSC-media die niet bij 37 °C mogen worden opgewarmd; alle PSC-media die in dit protocol werden gebruikt, waren thermostabiel.

  1. Om de putplaten te coaten met de BM-ECM, ontdooit u één aliquot van de BM-ECM (bewaard bij -20 °C volgens de instructies van de fabrikant) op ijs en mengt u 0,5 mg van de BM-ECM met 12 ml koud Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM)/F12 medium (bewaard bij 4 °C). Verdeel 2 ml van het DMEM/F12-BM-ECM-mengsel over elke put van een 6-putplaat en incubeer bij 37 °C gedurende ten minste 2 uur.
  2. Om de cellen te ontdooien, ontdooit u eerst de hPSC cryovial in een kraal of waterbad van 37 °C gedurende 1-2 minuten totdat slechts een kleine hoeveelheid ijs zichtbaar is. Breng de ontdooide cellen over in een centrifugebuis en voeg langzaam 8-9 ml van het PSC-medium toe, aangevuld met 2 μM van de ROCK-remmer thiazovivin (Thiaz), en centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten. Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel in het PSC-medium aangevuld met 2 μM Thiaz. Verdeel de cellen in het kweekmedium in 1-2 putten, afhankelijk van de cryoviaire celconcentratie en -cultuur bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 24 uur voordat het PSC-medium wordt vervangen.
  3. Verander het medium op de cellen met intervallen van 48 uur. Voer was- en mediumveranderingen uit met respectievelijk DMEM/F12 (1 ml/put) en het PSC-medium (2 ml/put).
    OPMERKING: Wasbeurten helpen bij het verwijderen van celafval en puin, terwijl verse mediaveranderingen cellen voorzien van een vernieuwde bron van voedingsstoffen.
  4. Passeer de cellen op subconfluentie (60-80% confluent) door het medium aan te zuigen en vervolgens elke put te wassen met 1 ml 1x Dulbecco's fosfaat-gebufferde oplossing (geen calcium, geen magnesium; DPBS). Zuig de DPBS aan en voeg 1 ml van het dissociatiereagens voor hPSC's toe (zie de tabel met materialen), gevolgd door de aspiratie van alles behalve een dunne film van het reagens na 10 s.
  5. Incubeer gedurende 2-5 minuten met de dunne film van het dissociatiereagens voor hPSC's totdat er openingen tussen cellen ontstaan.
    OPMERKING: De tijd om de dissociatie te stoppen is cellijnafhankelijk.
  6. Voeg 1 ml van het PSC-medium aangevuld met 2 μM Thiaz (PSC medium+Thiaz) toe aan de put en tik zachtjes op de plaat om celloslating te induceren. Pipetteer de losgemaakte cellen in het medium 1-2 keer om grote kolonies op te breken en resuspend de cellen in PSC medium + Thiaz in een 1:6 goed verhouding (cellen van 1 goed geresuspendeerd in 12 ml kweekmedium). Plaats de cellen opnieuw op BM-ECM-gecoate putten.

2. Generatie van 3D zelfassemblerende menselijke hartorganoïden

  1. Embryoïde lichaam (EB) vorming:
    OPMERKING: Het is noodzakelijk om waarneembare gedifferentieerde cellen te beperken voorafgaand aan embryoïde lichaamsvorming. Twee tot drie putten van een 6-putplaat met een samenvloeiing van 60-80% leveren voldoende cellen op voor een enkele 96-putplaat van organoïden. Alle media moeten worden gealiquoteerd en verwarmd in een kraal- of waterbad van 37 °C voordat het medium verandert om temperatuurschok voor de EB's of organoïden tot een minimum te beperken (dit omvat geen celdissociatiereagentia). Zie figuur 1A,B.
    1. Dag -2
      1. Om EB's te maken, wast u op dag -2 sub-confluent hPSC's (60-80% confluent) met DPBS gedurende ten minste 10 s om celresten te wassen en de DPBS aan te zuigen.
      2. Om de cellen los te maken en ze vrij te geven in een eencellige toestand, voegt u gedurende 3-6 minuten 1 ml celdissociatiereagens bij kamertemperatuur (zie de tabel met materialen) toe aan elke put. Tik zachtjes op de plaat ~ 5 keer per minuut om loslating te veroorzaken tijdens het controleren onder de microscoop. Voeg 1 ml PSC medium+Thiaz toe om de reactie te stoppen.
      3. Om de cellen te verzamelen en eventuele resterende aggregaten op te breken, pipetteer je de media 2-3 keer op en neer in de put om een eencellige suspensie te genereren. Breng de eencellige suspensie over in een centrifugebuis en draai gedurende 5 minuten bij 300 × g.
      4. Om de gewenste celconcentratie te verkrijgen, gooit u het supernatant weg en resuspendeert u de cellen in 1 ml PSC-medium + Thiaz. Tel de cellen met behulp van een celteller of hemocytometer en verdun de cellen in PSC-medium + Thiaz tot een concentratie van 100.000 cellen / ml.
      5. Om de cellen voor EB-vorming te verdelen, gebruikt u een meerkanaalspipet om 100 μL (10.000 cellen) toe te voegen aan elke put van een ultralage bevestigingsplaat met 96 putten met ronde bodem. Centrifugeer de plaat bij 100 × g gedurende 3 min en incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C, 5% CO2.
    2. Dag -1
      1. Verwijder voorzichtig 50 μL medium uit elke put en voeg 200 μL vers PSC-medium toe, verwarmd tot 37 °C om een eindvolume van 250 μL per put te bereiken. Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C, 5% CO2.
        OPMERKING: Verwijder en voeg het medium voorzichtig toe aan de zijkant van de put om te voorkomen dat de EB's aan de onderkant van de put worden verstoord. Vanwege de delicate aard van de EB's en de suspensiecultuur, is het noodzakelijk om een klein volume vloeistof in elke put achter te laten bij het veranderen van het medium om te voorkomen dat de EB's worden verstoord.
  2. Human Heart Organoid (hHO) Differentiatie:
    OPMERKING: Alle media moeten worden opgewarmd in een kraal- of waterbad van 37 °C voordat de media worden vervangen. Verwijder en voeg voorzichtig medium toe aan de zijkant van de put om te voorkomen dat de zich ontwikkelende organoïden op de bodem van de put worden verstoord. Wasbeurten zijn niet nodig tussen mediaveranderingen om agitatie te minimaliseren en de geleidelijke verwijdering van remmers en groeifactoren mogelijk te maken. RPMI met 2% B-27 supplement (Tabel van Materialen) werd gebruikt in het hele differentiatieprotocol. B-27 supplement bevat insuline tenzij gespecificeerd (insuline-vrij in dagen 0-5). Zie figuur 1C.
    1. Dag 0
      1. Om differentiatie naar een mesoderm-afstamming te initiëren, verwijdert u 166 μL medium uit elke put (~ 2/3e van het totale putvolume) en voegt u 166 μL RPMI 1640 met insulinevrij B-27-supplement, 6 μM CHIR99021, 1,875 ng / ml botmorfogenetisch eiwit 4 (BMP4) en 1,5 ng / ml Activine A toe voor een uiteindelijke putconcentratie van 4 μM CHIR99021, 1,25 ng/ml BMP4 en 1 ng/ml Activine A. Incubateer gedurende 24 uur bij 37 °C, 5% CO2.
    2. Dag 1
      1. Verwijder 166 μL medium uit elke put en voeg 166 μL verse RPMI 1640 toe met insulinevrij B-27 supplement. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C, 5% CO2.
    3. Dag 2
      1. Om cardiale mesodermspecificatie te induceren, verwijdert u 166 μL medium uit elke put en voegt u 166 μL RPMI 1640 toe met insulinevrij B-27-supplement en 3 μM Wnt-C59 voor een uiteindelijke putconcentratie van 2 μM Wnt-C59. Incubate gedurende 48 uur bij 37 °C, 5% CO2.
    4. Dag 4
      1. Verwijder 166 μL medium uit elke put en voeg 166 μL verse RPMI 1640 toe met insulinevrij B-27 supplement. Incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C, 5% CO2.
    5. Dag 6
      1. Verwijder 166 μL medium uit elke put en voeg 166 μL RPMI 1640 toe met B-27 supplement. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C, 5% CO2.
    6. Dag 7
      1. Om pro-epicardiale differentiatie te induceren, verwijdert u 166 μL medium uit elke put en voegt u 166 μL verse RPMI 1640 met B-27-supplement en 3 μM CHIR99021 toe voor een uiteindelijke putconcentratie van 2 μM CHIR99021. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C, 5% CO2.
      2. Verwijder 166 μL medium uit elke put en voeg 166 μL verse RPMI 1640 met B-27 supplement toe. Incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C, 5% CO2.
        OPMERKING: Extra voorzichtigheid is geboden bij deze tweede mediumverandering op dag 7, omdat de organoïden meer vatbaar zijn voor beweging vanwege de mediaveranderingen.
      3. Voer vanaf dag 7 tot de verzameling of overdracht voor analyses of experimenten elke 48 uur mediumveranderingen uit door 166 μL medium uit elke put te verwijderen en 166 μL verse RPMI 1640 met B-27-supplement toe te voegen.
        OPMERKING: Organoïden zijn klaar voor analyse en experimenten op dag 15, tenzij eerdere ontwikkelingsstadia van belang zijn. Ze kunnen na dag 15 worden gekweekt voor langdurige kweek- of rijpingsexperimenten.

3. Organoïde analyse

  1. Overdracht van hele organoïden (levend of vast)
    OPMERKING: Voor live organoïde overdracht, zorg ervoor dat pipetpunten die worden gebruikt steriel zijn.
    1. Snijd de punt van een P200 pipetpunt 5-10 mm van de puntopening af, wat resulteert in een brede opening van ~ 2-3 mm diameter.
    2. Steek de punt recht in de put met ronde bodem met de organoïde, zodat de pipet volledig verticaal is (loodrecht op de plaat). Zorg ervoor dat de pipetzuiger al helemaal is ingedrukt voordat u de punt in het medium steekt.
    3. Laat de pipetzuiger langzaam los en neem voldoende medium (100-200 μL) in om de organoïde te verzamelen.
    4. Breng de organoïde in medium over naar de doelbestemming (bijv. voor fixatie, live beeldvorming, elektrofysiologische opname, nieuwe plaatcultuur).
  2. Organoïden fixeren
    OPMERKING: Het bevestigen en kleuren van organoïden kan worden gedaan in de 96-well kweekplaat of microcentrifugebuizen. Paraformaldehyde (PFA) mag alleen in een zuurkast worden gehanteerd.
    1. Voor fixatie in microcentrifugebuizen, breng levende organoïden over naar afzonderlijke buizen met 1-8 organoïden per buis.
      OPMERKING: Niet meer dan 8 organoïden per buis.
    2. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk medium uit de buis zonder de organoïden aan te raken.
    3. Voeg 4% PFA toe aan elke buis of put (300-400 μL per microcentrifugebuis en 100-200 μL per put van een 96-well plaat). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30-45 min.
      OPMERKING: Incubatietijden van meer dan 1 uur kunnen antigeenherstelstappen vereisen en worden niet aanbevolen.
    4. Gooi de PFA veilig weg zonder de organoïden te storen. Voer 3 wasbeurten uit met DPBS aangevuld met 1,5 g/L glycine (DPBS/Gly), met hetzelfde volume dat wordt gebruikt voor de 4% PFA, en wacht 5 minuten tussen de wasbeurten. Verwijder DPBS/Gly en ga verder met immunostaining of andere analyses of voeg DPBS toe en bewaar bij 4 °C voor toekomstig gebruik gedurende maximaal 2 weken.
      OPMERKING: Het langer dan 2 weken bewaren van vaste organoïden kan leiden tot weefselafbraak en besmetting en wordt niet aanbevolen.
  3. Immunofluorescente kleuring op geheel
    1. Voeg 100 μL blokkerende/permeabilisatieoplossing (10% normaal ezelserum + 0,5% runderserumalbumine (BSA) + 0,5% Triton X-100 in 1x DPBS) toe aan elke put of buis met de vaste organoïden. Incubeer een nacht bij kamertemperatuur op een shaker.
      OPMERKING: Niet meer dan 8 organoïden per buis.
    2. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk van de blokkerende oplossing en gooi deze weg zonder de organoïden aan te raken. Voer 3 wasbeurten uit met DPBS en wacht 5 minuten tussen de wasbeurten.
    3. Bereid de primaire antilichaamoplossing (1% normaal ezelserum + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 in 1x DPBS) met de gewenste primaire antilichamen in de aanbevolen concentraties. Incubeer bij 4 °C gedurende 24 uur op een shaker.
    4. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk van de antilichaamoplossing en gooi deze weg zonder de organoïden aan te raken. Voer 3 wasbeurten uit met DPBS en wacht 5 minuten tussen de wasbeurten.
    5. Bereid secundaire antilichaamoplossing (1% normaal ezelserum + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 in 1x DPBS) met de gewenste secundaire antilichamen in de aanbevolen concentraties. Als de antilichamen fluorescerend zijn gelabeld, incubeer dan bij 4 °C in het donker (bijvoorbeeld bedekt met aluminiumfolie) gedurende 24 uur op een shaker.
    6. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk van de antilichaamoplossing en gooi deze weg zonder de organoïden aan te raken. Voer 3 wasbeurten uit met DPBS en wacht 5 minuten tussen de wasbeurten.
    7. Bereid dia's voor met kralen (90-300 μm in diameter) gemonteerd in een montagemedium (zie de tabel met materialen) in de buurt van de randen van de dia waar de coverslip met de organoïden zal worden geplaatst.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om het montagemedium rond de kralen te laten drogen voordat u verder gaat; dit voorkomt dat de kralen bewegen. Zie figuur 2.
    8. Breng de gekleurde organoïden met behulp van een gesneden pipetpunt over op de dia, tussen de kralen, zodat er afstand ontstaat om contact tussen de organoïden te voorkomen eenmaal op de dia. Gebruik de hoek van een opgerold laboratoriumdoekje om overtollige vloeistof rond de organoïde voorzichtig te verwijderen.
    9. Bedek de organoïden met montage-clearing medium (fructose-glycerol clearing oplossing is 60% (vol/vol) glycerol en 2,5 M fructose)37 met behulp van 120-150 μL van het montage-clearing medium per dia.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een gesneden pipetpunt te gebruiken bij het werken met het montage-clearing medium omdat het erg stroperig is.
    10. Beweeg de coverslip over de dia met de organoïden bedekt met montage-clearing oplossing en druk langzaam de coverslip over de dia, zodat de organoïden zich tussen de gemonteerde kralen bevinden.
    11. Sluit de omtrek van de deklip op de dia af met nagellak van de bovenste laag. Laat de glijbaan in het donker bij kamertemperatuur 1 uur drogen. Bewaren bij 4 °C in het donker voor langdurige opslag.
  4. Calciumtransiënte beeldvorming in levende hartorganoïden
    OPMERKING: Volgens de instructies van de fabrikant werd Fluo4-AM gereconstitueerd in dimethylsulfoxide (DMSO) tot een uiteindelijke concentratie van de voorraadoplossing van 0,5 mM. Fluo4-AM werd direct toegevoegd aan de organoïde put in de 96-well plaat.
    1. Voer 2 wasbeurten uit op de organoïden met behulp van RPMI 1640 medium.
      1. Verwijder 166 μL van het gebruikte medium uit de put.
      2. Voeg 166 μL opgewarmd RPMI 1640 medium toe, verwijder 166 μL medium en voeg 166 μL vers RPMI 1640 medium toe.
        OPMERKING: De wasbeurten worden gedaan om afvalmateriaal en celresten te verwijderen. Tweederde van het medium wordt tijdens de wasbeurten uit de putten verwijderd om te voorkomen dat de organoïden aan de onderkant van de put vóór de functionele test worden verstoord.
    2. Voeg Fluo4-AM medium toe aan de organoïden.
      1. Voeg Fluo4-AM gereconstitueerd in DMSO toe aan RPMI 1640 met B-27-supplement om een 1,5 μM-oplossing te bereiden.
      2. Verwijder 166 μL medium uit de put.
      3. Voeg 166 μL van 1,5 μM Fluo4-AM toe in RPMI 1640 met B-27 supplement voor een uiteindelijke putconcentratie van 1 μM. Incubeer bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 30 min.
    3. Voer 2 wasbeurten uit zoals in stap 3.4.1.
    4. Voeg 166 μL RPMI 1640 met B-27 supplement toe aan de put.
    5. Breng met behulp van een gesneden punt van een P200-pipetpunt de organoïde over naar een petrischaal met glazen bodem (bijv. 8-well chambered cover glass met # 1,5 high-performance coverglas) met 100-200 μL medium.
      OPMERKING: Zie rubriek 3.1 over het overbrengen van hele organoïden.
    6. Beeld de organoïden leven onder een microscoop met een temperatuur- en CO2-gestuurde kamer bij 37 °C, 5% CO2.
    7. Neem verschillende 10-20 s-video's op verschillende locaties op de organoïde op en toon de toename en afname van fluorescentie-intensiteitsniveaus als het calcium de cellen binnenkomt en verlaat.
      OPMERKING: Voor opnamen met een hoge resolutie wordt aanbevolen om op te nemen met een snelheid van 10 fps of sneller; 50 fps wordt aanbevolen.
    8. Analyseer de video's met behulp van beeldanalysesoftware (bijv. ImageJ) door interessante gebieden te selecteren en intensiteitsniveaus in de loop van de tijd te meten.
    9. Normaliseer de intensiteitsopnamen met ΔF/F0 vs. tijd in milliseconden en plot.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om zelforganiserende hHO in vitro te bereiken, hebben we differentiatieprotocollen aangepast en gecombineerd die eerder zijn beschreven voor 2D-monolaagdifferentiatie van cardiomyocyten21 en epicardiale cellen22 met behulp van Wnt-routemodulatoren en voor 3D-precardiale organoïden16 met behulp van de groeifactoren BMP4 en Activine A. Met behulp van het 96-well plate EB- en hHO-differentiatieprotocol dat hier wordt beschreven en getoond in

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recente ontwikkelingen in van menselijke stamcellen afgeleide cardiomyocyten en andere cellen van cardiale oorsprong zijn gebruikt om de ontwikkeling van het menselijk hart22,24,25 en ziekte26,27,28 te modelleren en als hulpmiddelen om therapeutica29,30 en toxische agentia

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute van de National Institutes of Health onder de awardnummers K01HL135464 en R01HL151505 en door de American Heart Association onder awardnummer 19IPLOI34660342. We willen de MSU Advanced Microscopy Core en Dr. William Jackson van de MSU Department of Pharmacology and Toxicology bedanken voor toegang tot confocale microscopen, de IQ Microscopy Core en de MSU Genomics Core voor sequencingdiensten. We willen ook alle leden van het Aguirre Lab bedanken voor hun waardevolle opmerkingen en advies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antilichamen
Alexa Fluor 488 Donkey anti- muisInvitrogenA-212021:200
Alexa Fluor 488 Donkey anti- konijnInvitrogenA-212061:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- muisInvitrogenA-212031:200
Alexa Fluor 594 Donkey anti- konijnInvitrogenA-212071:200
Alexa Fluor 647 Donkey anti- geitInvitrogenA328491:200
HAND1Abcamab196622Konijn; 1:200
HAND2Abcamab200040Konijn; 1:200
NFAT2Abcamab25916Konijn; 1:100
PECAM1DSHBP2B1Konijn; 1:50
TNNT2Abcamab8295Muis; 1:200
THY1Abcamab133350Konijn; 1:200
TJP1InvitrogenPA5-19090Geit; 1:250
VIMAbcamab11256Geit; 1:250
WT1Abcamab89901Konijn; 1:200
Media en Reagentia
AccutaseInnovative Cell TechnologiesNC9464543celdissociatiereagens
Activine AR&D Systems338AC010
B-27 Supplement (Minus Insulin)GibcoA1895601insulinevrije celkweeksupplement
B-27 SupplementGibco17504-044celkweeksupplement
BMP-4GibcoPHC9534
Rundvlees Serum AlbumineBioworld50253966
CHIR-99021Selleck442310
D-(-)-FructoseMillipore SigmaF0127
DAPIThermo Scientific622481:1000
Dimethyl SulfoxideMillipore SigmaD2650
DMEM/F12Gibco10566016
Essential 8 Flex Medium KitGibcoA2858501pluripotente stamcel (PSC) medium bevattend 1% penicillin-streptomycin
Fluo4-AMInvitrogenF14201
GlycerolMillipore SigmaG5516
GlycineMillipore Sigma410225
Matrigel GFRCorningCB40230Basmambraan extracellulair matrix (BM-ECM)
Normal Donkey SerumMillipore SigmaS30-100mL
ParaformaldehydeMP BiomedicalsIC15014601Poeder opgelost in PBS Buffer – gebruik op 4%
Penicilline-StreptomycineGibco15140122
FosfaatbufferoplossingGibco10010049
Fosfaatbufferoplossing (10x)Gibco70011044
Polybead MicrosferenPolysciences, Inc.7315590 µm
ReLeSRStem Cell TechnologiesNC0729236dissociatiereagens voor hPSC's
RPMI 1640Gibco11875093
ThiazovivinMillipore SigmaSML1045
Triton X-100Millipore SigmaT8787
Trypan Blauw OplossingGibco1525006
VECTASHIELD Vibrance Antifade Montage MediumVector LaboratoriesH170010
WNT-C59SelleckNC0710557
Overig
1.5 mL MicrocentrifugebuisjesFisher Scientific02682002
15 mL FalconbuisjesFisher Scientific1495970C
2 mL Cryogene Vloeibare FlessenCorning13-700-500
50 mL Reagens ReservoirsFisherbrand13681502
6-Well Flat Bottom Celkweek PlatenCorning0720083
8 Well kamerdeksel Glas met #1.5 hoge prestatiedekglasCellvisC8-1.5H-N
96-well Heldere Ultra Lage Aanhechting MicroplatenCostar07201680
ImageJNIHBeeldverwerkingssoftware
KimwipesKimberly-Clark Professional06-666laboratoriumdoekjes
Micro DekglasVWR48393-24124 x 50 mm Nr. 1.5
Microscope SlidesFisherbrand1255015
Moxi Cell CounterOrflo Technologies MXZ001
Moxi Z Cell Count Cassette – Type MOrflo TechnologiesMXC001
Multikanaals PipettenFisherbrandFBE120030030-300 µL
Olympus cellVivoOlympusVoor Caclium Beeldvorming, analyse met Imagej
Sorvall Legend X1 CentrifugeThermoFisher Scientific75004261
Thermal MixerThermoFisher Scientific13-687-717
Top Coat NagellakSeche ViteKan gekocht worden bij elke supermarkt

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
  2. Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), 20593(2020).
  3. Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
  4. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  5. Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
  6. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  7. Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514(2020).
  8. Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569, 66-72 (2019).
  9. Mithal, A., et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 11, 215(2020).
  10. Porotto, M., et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids. mBio. 10 (3), 00723(2019).
  11. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, 05098(2015).
  12. Mun, S. J., et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).
  13. Vyas, D., et al. Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro. Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).
  14. Dossena, M., et al. Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11, 94(2020).
  15. Georgakopoulos, N., et al. Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids. BMC Developmental Biology. 20 (1), 4(2020).
  16. Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9, 3140(2018).
  17. Rossi, G., et al. Capturing cardiogenesis in gastruloids. Cell Stem Cell. 28 (2), 230-240 (2021).
  18. Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nature Communications. 11 (1), 4283(2020).
  19. Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).
  20. Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).
  21. Bao, X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).
  22. Bao, X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions. Nature Biomedical Engineering. 1, 0003(2016).
  23. Lewis-Israeli, Y., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12, 5142(2021).
  24. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  25. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  26. Hashem, S. I., et al. Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).
  27. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  28. Stroud, M. J., et al. Luma is not essential for murine cardiac development and function. Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).
  29. Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
  30. Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).
  31. Braam, S. R., et al. Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).
  32. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  33. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2017).
  34. Bertero, A., et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory. Nature Communications. 10 (1), 1538(2019).
  35. Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. Developmental Biology. 6th edition. , Sinauer Associates. Sunderland (MA). 591-610 (2000).
  36. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
  37. Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease. Biomolecules. 1277, (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Human Heart OrganoidsPluripotent Stem CellsSelf Assembling OrganoidsWnt Signaling ModulationEmbryoid BodiesCardiac Mesoderm DifferentiationImmunofluorescence ImagingCalcium ImagingCardiomyocyte SpecificationVascular Network Formation

Gerelateerde artikelen