Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Classificatie van neurale stamcelactiveringstoestand in vitro met behulp van autofluorescentie

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63110

⸱

12 april 2024

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Wisconsin-Madison, 2Morgridge Institute for Research, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft strategieën voor het identificeren en verrijken van de celtoestand in neurale stamcelculturen van primaire volwassen muizen door middel van autofluorescentiebeeldvorming met behulp van i) een confocale microscoop, ii) een fluorescerend geactiveerde celsorteerder om intensiteitsbeeldvorming uit te voeren, of iii) een multifotonenmicroscoop om fluorescentiebeeldvorming uit te voeren.

Samenvatting

Neurale stamcellen (NSC's) delen en produceren pasgeboren neuronen in de volwassen hersenen via een proces dat volwassen neurogenese wordt genoemd. Volwassen NSC's zijn voornamelijk in rust, een omkeerbare celtoestand waarin ze de celcyclus (G0) hebben verlaten en toch blijven reageren op de omgeving. In de eerste stap van neurogenese bij volwassenen ontvangen slapende NSC's (qNSC's) een signaal en worden ze geactiveerd, waardoor ze de rust verlaten en opnieuw de celcyclus binnenkomen. Het begrijpen van de regulatoren van NSC-rust en rust-exit is dus van cruciaal belang voor toekomstige strategieën gericht op neurogenese bij volwassenen. Ons begrip van NSC-rust wordt echter beperkt door technische beperkingen bij het identificeren van slapende NSC's (qNSC's) en geactiveerde NSC's (aNSC's). Dit protocol beschrijft een nieuwe benadering om qNSC's en aNSC's gegenereerd in in vitro culturen te identificeren en te verrijken door NSC-autofluorescentie af te beelden. Ten eerste beschrijft dit protocol hoe een confocale microscoop kan worden gebruikt om autofluorescerende markers van qNSC's en aNSC's te identificeren om de NSC-activeringstoestand te classificeren met behulp van autofluorescentie-intensiteit. Ten tweede beschrijft dit protocol hoe een fluorescerende geactiveerde celsorteerder (FACS) moet worden gebruikt om de NSC-activeringstoestand te classificeren en monsters voor qNSC's of aNSC's te verrijken met behulp van autofluorescentie-intensiteit. Ten derde beschrijft dit protocol hoe een multifotonenmicroscoop kan worden gebruikt om fluorescentiebeeldvorming (FLIM) uit te voeren met een resolutie van één cel, de NSC-activeringstoestand te classificeren en de dynamiek van ruste-uitgang te volgen met behulp van zowel autofluorescentie-intensiteiten als fluorescentielevensduur. Dit protocol biedt dus een toolkit voor het oplossen van een resolutie met één cel voor het bestuderen van NSC-rust en rustuitgang.

Inleiding

NSC's creëren pasgeboren neuronen gedurende het hele leven in veel organismen in een proces dat volwassen neurogenese wordt genoemd 1,2. Om pasgeboren neuronen te produceren, moet eerst een qNSC worden geactiveerd, die de celcyclus binnengaat om de populatie uit te breiden en neurale voorlopercellen te produceren 3,4,5,6. Hoewel er veel bekend is over NSC-rust, wordt ons vermogen om de drijfveren en regulatoren van NSC-rust volledig te identificeren beperkt door technische beperkingen die bestaan om qNSC's en hun overgang naar activering te isoleren en te identificeren. Autofluorescentiebeeldvorming is eerder succesvol geweest bij het bestuderen van veranderingen in de celtoestand in veel verschillende celtypen, zoals microglia en T-cellen, door metabole remodellering op te lossen, die de optische eigenschappen van autofluorescerende metabole cofactoren zoals nicotinamide-adenine-dinucleotidefosfaat (NAD(P)H) en flavine-adenine-dinucleotide (FAD) beïnvloedt7,8. NSC's hermodelleren hun metabolische netwerken aanzienlijk terwijl ze rust ondergaan exit 9,10,11,12,13,14. Om van deze verschillen te profiteren, werd NSC-autofluorescentie onlangs gebruikt om de NSC-activeringstoestand te identificeren en te verrijken door verschuivingen in autofluorescentie te detecteren die worden toegeschreven aan de metabole remodellering die optreedt wanneer NSC's rust verlaten15. Beeldvorming van autofluorescentie biedt verschillende technische voordelen: i) het vereist geen toevoeging van exogene labels, die het gedrag van cellen kunnen beïnvloeden; ii) het kan eencellige gegevens met hoge resolutie leveren over de NSC-activeringstoestand; en iii) het vereist niet de vernietiging van de cel 7,16. Dit protocol schetst drie strategieën voor het benutten van NSC-autofluorescentie om NSC-rust- en geactiveerde celtoestanden te bestuderen15.

Onlangs bleken NSC's geïsoleerd uit 6 weken oude mannelijke muizen uit de subgranulaire zone van de hippocampus, gekweekt en reversibel in rust gebracht in vitro 10,13,17,18,19,20,21, verhoogde niveaus van punctate autofluorescentie (PAF) te vertonen die tussen 400-600 nm exciteren en tussen 500-700 nm uitzenden. Dit signaal was specifiek voor qNSC's in vergelijking met geactiveerde, fietsende NSC's15. Het vermogen om deze twee populaties visueel te scheiden zonder het gebruik van extra antilichaammarkers of reporters is nuttig voor veel experimentele vragen over de aard van qNSC's en rustuitgangen. Daarom beschrijft dit protocol eerst strategieën om de PAF in qNSC's af te beelden met behulp van een confocale microscoop, die kan worden gebruikt om de NSC-activeringstoestand te identificeren. Ten tweede beschrijft dit protocol strategieën om de PAF te detecteren met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en beschrijft het verder hoe te sorteren op basis van dit signaal om qNSC's of aNSC's te verrijken. Deze strategieën bieden één meting die kan worden gebruikt om NSC's te clusteren en te scheiden op basis van de celstatus.

Om een methode met een hogere resolutie te ontwikkelen voor het scheiden van NSC's, niet alleen in verschillende toestanden, maar ook tijdens de overgang door rustuitgang naar volledige activering, werd fluorescentiebeeldvorming gedurende de levensduur (FLIM) uitgevoerd met behulp van een multifotonenmicroscoop om de levensduur van NAD(P)H (kanaal 1 genoemd) autofluorescentie en groene autofluorescentie (kanaal 2 genoemd; die zowel FAD-autofluorescentie als PAF in qNSC's detecteert) samen met hun intensiteit in beeld te brengen. Deze benadering maakt gebruik van het feit dat de optische eigenschappen van moleculen in de cel afhankelijk zijn van hun fysische eigenschappen16,22. Bijvoorbeeld, NAD(P) (NAD en NADP zijn optisch niet van elkaar te onderscheiden, en daarom wordt NAD(P) gebruikt om naar beide soorten te verwijzen) is niet autofluorescerend in geoxideerde toestand, maar is autofluorescerend in gereduceerde toestand (NAD(P)H)23. Verder kunnen aanvullende fysische eigenschappen van autofluorescerende moleculen, zoals hun bindingsstatus aan enzymen, worden geëxtrapoleerd door beeldvorming van de fluorescentielevensduur uit te voeren 7,22,24. NAD(P)H heeft bijvoorbeeld een kortere fluorescentielevensduur wanneer het niet gebonden is aan een enzym22. Aangezien autofluorescerende moleculen zoals NAD(P)H, dat betrokken is bij honderden metabolische reacties, anders worden gebruikt door cellen die verschillende toestanden of celgedrag doorlopen, kunnen deze verschuivingen worden gedetecteerd en gekwantificeerd met behulp van een multifotonenmicroscoop die de autofluorescentielevensduur detecteert23. Samen met de abundantie, of intensiteit, van de autofluorescentie, leveren deze metingen multidimensionale informatie om NSC's te scheiden in de ene of de andere celtoestand en door de dynamische overgangen tussen toestanden. Ten derde beschrijft dit protocol het uitvoeren, analyseren en interpreteren van FLIM en intensiteitsmetingen van kanaal 1 (NAD(P)H) en kanaal 2 (PAF) signalen met behulp van een multifotonenmicroscoop. Samenvattend beschrijft dit protocol een live-cell, labelvrije toolkit voor het bestuderen van NSC-rust die single-cell-gegevens met hoge resolutie over de NSC-toestand biedt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures in dit protocol zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Wisconsin-Madison.

1. Een confocale microscoop gebruiken om PAF in qNSC's en aNSC's af te beelden om de NSC-celtoestand te identificeren

  1. Genereer qNSC's en aNSC's in vitro uit primaire NSC-culturen.
    1. Kweek NSC's gezuiverd uit volwassen muizenhersenen in een proliferatief medium voor expansie (Tabel 1)18,20,21. In vitro NSC-culturen zijn dus standaard aNSC's.
    2. Om qNSC's te genereren, gebruikt u het volgende protocol om aNSC's op gecoat glaswerk te plaatsen en ze vervolgens te behandelen met qNSC-medium om gedurende 3 dagen rust te induceren.
    3. Bereid glaswerk voor met een brekingsindex die geschikt is voor onderdompeling in olie, objectieven voor het hechten van NSC's, door eerst te coaten met een oplossing van poly-L-ornithine (PLO; 10 mg/ml in water voor plastic, 50 mg/ml in water voor glas) die voldoende is om de bodem van de schaal te bedekken (voor een beeldvormingscuvet van 1cm2 , gebruik ~150 μL) gedurende 1 uur bij 37 °C in ddH2O.
    4. Verwijder de PLO-oplossing en was 3 keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    5. Smeer in met een laminineoplossing (5 mg/ml) die voldoende is om de bodem van de schaal te bedekken (voor een beeldvormingscuvet van 1 cm2 , gebruik ~150 μL) in PBS en incubeer minimaal 3 uur bij 37 °C, of 's nachts.
    6. Verwijder de laminine-oplossing en voeg vervolgens een kweekmedium toe dat voldoende is om de bodem van de schaal te bedekken (gebruik ~150 μL voor een beeldvormingscuvet van 1cm2 ).
    7. Bereid de cellen voor op trypsinisatie door aNSC's (ze kunnen beginnen als monolagen of neurosferen) te centrifugeren bij 120 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur (RT, ~25 °C).
    8. Trypsiniseer gepelleteerde aNSC's van de vorige stap in 100 μL trypsinemix gedurende 5 minuten bij 37 °C en blus vervolgens de trypsinisatie met 200 μL trypsineremmermix (Tabel 1).
    9. Laat de NSC's 2 minuten zitten en trituer ze vervolgens mechanisch door 10 keer op en neer te pipetteren.
    10. Voeg 5 ml aNSC-medium toe en draai de cellen gedurende 4 minuten op 120 x g .
    11. Resuspendeer de NSC's in 1 ml aNSC-medium en plaat de cellen op 10%-20% confluentie in aNSC-medium. Plaats bijvoorbeeld ~5.000 cellen in een putje van een 1 cm2 beeldvormende cuvettenput met 150 μL medium.
    12. Nadat aNSC's 24 uur de tijd hebben gekregen om zich aan het oppervlak van de schaal te hechten, verwijdert u het aNSC-medium en vervangt u het door qNSC-medium dat voldoende is om de bodem van de schaal te bedekken (voor een beeldvormingscuvet van 1 cm2 gebruik u ~150 μL; Tabel 1- zoals eerder beschreven 10,13,17,18) in putten waarin rust zal worden geïnduceerd.
    13. Vervang aNSC en qNSC medium minstens eens in de 2 dagen. Na 3 dagen in qNSC-medium zijn NSC's in rust en kunnen ze worden gebruikt voor beeldvormingsexperimenten.
  2. Gebruik een confocale microscoop om live qNSC's en aNSC's in vitro af te beelden.
    OPMERKING: Elke microscoop heeft zijn eigen software; Volg dus deze stappen door analoge acties uit te voeren om een specifieke microscoop te configureren. Dit protocol geeft instructies voor het werken in NIS-Elements.
    1. Configureer de confocale microscoop voor autofluorescentiebeeldvorming.
      1. Klik op 405 Laser en typ het emissievenster in het menu 405 Laser . Klik op TD om een beeld van doorvallend licht te verzamelen en stel de HV-waarde in om het monster te visualiseren.
      2. Stel het laservermogen in op 3.5% en de versterking op 75. Stel Zoom in op 2. Stel de confocale scanparameters in, stel Pixel Dhold in op 0,5 en stel de resolutie in op 2048 x 2048 pixels.
    2. Breng de cellen scherp onder een ~60x olie-immersie objectieflens met behulp van een helderveld om scherp te stellen.
    3. Schakel over naar de confocale scanmodus door op Eye Port te klikken, zorg ervoor dat het lichtpad nu naar de scankop gaat en dat er zich geen filterkubus in het lichtpad bevindt.
    4. PAF is verrijkt met qNSC's en is op grote schaal prikkelbaar en emitteerbaar (zie figuur 1). Kies de beste optische configuratie op basis van de mogelijkheden van het systeem met behulp van afbeelding 1 als richtlijn. Voor het sterkste en schoonste signaal, exciteer met een laser tussen ~400-500 nm, verzamel ~580-620 nm en gebruik een ~60x olie-immersieobjectieflens.
      OPMERKING: Autofluorescentiebeeldvorming vereist hogere laservermogens om te exciteren dan typische beeldvormingsexperimenten zouden vereisen. Als u andere autofluorescerende moleculen of andere labels samen met PAF afbeeldt, moet u de optische configuratie zorgvuldig ontwerpen om doorbloeding in autofluorescentiekanalen te voorkomen.
    5. Verkrijg beelden van autofluorescentie in qNSC's en aNSC's. Klik op Scannen, focus op de afbeelding en klik vervolgens op Vastleggen. Voor de beste beelden verzamelt u enkelvlaksbeelden met het cytoplasma van cellen (gebaseerd op zwakkere autofluorescentie die diffuus door de cel is verspreid) in focus om een representatieve dwarsdoorsnede van elke cel te krijgen.
    6. Gebruik een identieke optische configuratie (bijv. hetzelfde laservermogen) en beeldvoorbeelden op dezelfde dag als u verschillende beelden rechtstreeks wilt vergelijken.
    7. De exacte vermogens van de laser en detector zijn afhankelijk van elk specifiek systeem. Begin met het gebruik van lage laservermogens en verhoog vervolgens langzaam het vermogen totdat het signaal detecteerbaar is zonder verzadigd te zijn.
  3. Analyseer PAF in live qNSC's en aNSC's in vitro.
    1. Nadat u autofluorescentiebeelden in qNSC's of aNSC's hebt verkregen, kwantificeert u de beelden door een bestand te openen in ImageJ25.
    2. Gebruik de optie Filters > Verwerken > Gaussiaanse vervaging (Sigma: 2) op de afbeelding van qNSC/aNSC-autofluorescentie om ongelijke pixels glad te strijken.
    3. Gebruik Afbeelding > Pas > drempel aan om pixels te selecteren die PAF vertegenwoordigen (achtergrondpixels elimineren) en klik op Toepassen. Gebruik dezelfde drempelparameters voor alle afbeeldingen die direct worden vergeleken.
    4. Gebruik Process > Binary > Watershed om PAF's in nauwe ruimtelijke nabijheid te scheiden.
    5. Teken met de computermuis een interessegebied (ROI) rond een cel, zoals bepaald door naar een helderveldbeeld te kijken of door te kijken naar diffuse autofluorescentie die gelijkmatig in het cytoplasma van de cel aanwezig is.
      OPMERKING: Het is over het algemeen prima om dunne perifere processen uit te sluiten en de kern op te nemen, aangezien autofluorescentie doorgaans niet aanwezig is op deze locaties en dus de analyse niet zou verstoren.
    6. Gebruik Analyseren > Deeltjes analyseren (Grootte: 0,1 oneindig μm; Circulariteit: 0-1) met samenvatten aangevinkt.
      OPMERKING: ImageJ produceert dan een uitvoervenster met gegevens over de deeltjes in het interessegebied, waarmee het aantal PAF in elke cel kan worden getabelleerd. Andere fluorescerende moleculen kunnen worden gecombineerd met beeldvormende PAF. Omdat PAF echter een relatief zwak signaal is, is het belangrijk om te valideren dat andere fluoroforen niet in het PAF-kanaal bloeden. Doorgaans kunnen fluoroforen die 600+ nm absorberen en 650+ nm uitzenden, worden gecombineerd met beeldvormende PAF, zoals LipidSpot 610.

2. FACS gebruiken om de NSC-activeringstoestand te verrijken in gekweekte NSC's op basis van autofluorescentie

  1. Genereer qNSC's en aNSC's zoals beschreven in sectie 1.
  2. Sorteer een mengsel van levende qNSC's en aNSC's op basis van autofluorescentie.
    OPMERKING: In dit protocol wordt bijvoorbeeld besproken hoe aNSC's of qNSC's in een monster kunnen worden verrijkt dat is gegenereerd door qNSC's en aNSC's te mengen in een verhouding van 1:1.
    1. Voorafgaand aan trypsinisatie en celsortering, labelt u de cellen die door de S-fase gaan door 10 μM 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU; een thymidine-analoog die wordt opgenomen in cellen die DNA synthetiseren, zoals in de S-fase van de celcyclus) toe te voegen aan het celkweekmedium gedurende 1 uur.
    2. Probeer qNSC's en aNSC's zoals besproken in stap 1.1.8, resuspendeer in 0,5 ml FACS-buffer (tabel 1) en plaats ze vervolgens op ijs.
      OPMERKING: qNSC's hechten sterk aan de schaal. Bij een relatief hogere samenvloeiing kunnen qNSC's mechanisch worden losgekoppeld van de schotel. Als qNSC's zich echter op een relatief lagere samenvloeiing bevinden of moeilijk mechanisch uit de schaal kunnen worden verwijderd door te pipetteren, gebruik dan trypsine om ze uit de schaal te verwijderen.
      1. Verwijder het kweekmedium uit qNSC's en voeg 0,25% trypsine toe, voldoende om de bodem van de schaal te bedekken (voor een beeldvormingscuvet van 1 cm2 , gebruik ~150 μL), incubeer gedurende 3 minuten bij 37 °C.
      2. Na incubatie doof de trypsinereactie door medium toe te voegen dat overeenkomt met elk celtype dat gelijk is aan het volume trypsine dat is toegevoegd. Cellen mechanisch loskoppelen van de schaal voordat ze worden verzameld en gecentrifugeerd.
    3. Analyseer met behulp van een mondstuk van ~130 μm qNSC's en aNSC's met behulp van een flowcytometer of FACS met optische omstandigheden op basis van de mogelijkheden van het instrument en detecteer PAF zoals weergegeven in afbeelding 1. Gebruik bijvoorbeeld een laser van 405 nm om het monster te prikkelen en gebruik een filter van 580-620 nm voor detectie.
    4. Verzamel ten minste 10.000 singlet qNSC's en aNSC's in een gegevensbestand en gebruik deze vervolgens om poorten te ontwerpen om een verrijking van qNSC's of aNSC's te verzamelen. Stel bijvoorbeeld poorten in om de bovenste 25% of onderste 25% van de NSC's te verzamelen op basis van de autofluorescentie-intensiteit in het gemengde aNSC:qNSC (1:1)-monster.
    5. Na het instellen van poorten om singlets met helderdere of zwakkere autofluorescentie te sorteren, zoals hierboven beschreven, sorteert u de cellen in PLO-, laminine-gecoate putjes gevuld met aNSC-medium (10.000 cellen/cm2, zie stap 1.1.3).
    6. Laat de NSC's na FACS 3 uur in de couveuse zitten. Fixeer de cellen door ze te behandelen met 4% paraformaldehyde, voldoende om de bodem van de schaal te bedekken (voor een beeldvormingscuvet van 1 cm2 , gebruik ~150 μL) gedurende 15 minuten bij RT.
      OPMERKING: Om EdU in cellen te visualiseren, is het het gemakkelijkst om een commerciële kit voor het detecteren van EdU te verkrijgen en het door de fabrikant aanbevolen protocol te volgen.
    7. Permeabiliseer eerst de cellen door behandeling met 0,25% triton in PBS gedurende 15 minuten bij RT.
    8. Behandel vervolgens de cellen met een EdU-kleuringsoplossing bij RT gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: De precieze samenstelling van de EdU-kleuringsoplossing is afhankelijk van de bron van de reagentia, maar bestaat ruwweg uit een reactiebuffer, een reactiebufferadditief, kopersulfaat en een alkyne of azide-gemodificeerd molecuul. Zie de Tabel met materialen voor een aanbevolen kit.
    9. Na het kleuren om EdU te visualiseren, wast u de monsters 3 keer gedurende 10 minuten met PBS.

3. Een multifotonenmicroscoop gebruiken om autofluorescentie van kanaal 1 en kanaal 2 te detecteren en FLIM uit te voeren op NSC's in vitro om NSC-celtoestandspopulaties en overgangen te identificeren

OPMERKING: Elke microscoop heeft zijn eigen software; Volg dus deze stappen door analoge acties uit te voeren om een specifieke microscoop te configureren. Dit protocol geeft instructies voor het werken in Prairie View.

  1. Genereer qNSC's en aNSC's zoals beschreven in sectie 1.
  2. Stel de multifotonenmicroscoop in voor beeldvorming gedurende de fluorescentielevensduur.
    1. Gebruik een objectieflens met een vergroting van 40x of meer (~1.15 NA).
    2. Gebruik een multifotonenmicroscoop met de volgende of gelijkwaardige componenten: een afstembare ultrasnelle laser, een 720 nm long pass dichroïsch, een galliumarsenidefosfide (GaAsP) fotomultiplicatorbuis (PMT), tijdgecorreleerde elektronica voor het tellen van één foton en een analoge vermogensmeter.
    3. Voor beeldvormingskanaal 1 stelt u de afstembare laser in op 750 nm en gebruikt u een emissiefilterkubus van 440/80 nm. Voor beeldvormingskanaal 2 stelt u de laser in op 890 nm en gebruikt u een emissiefilterkubus van 550/100 nm.
      NOTITIE: Doe de kamerverlichting uit voordat de PMT's worden ingeschakeld.
  3. Responsfunctie van het instrument
    1. Leg een instrumentresponsfunctie (IRF) vast door een gebroken ureumkristal af te beelden om rekening te houden met de temporele respons van het instrument in het gemeten verval.
      OPMERKING: De IRF is verbonden met het verval om de vervalcurven nauwkeurig te berekenen. Voor acquisitie wordt de laser ingesteld op 890 nm en wordt de 440/80 nm emissiefilterkubus gebruikt. De GaAsP PMT is ingesteld op een versterking van 800 en de pockels (laservermogen) zijn in eerste instantie erg laag ingesteld, meestal 1.
    2. Selecteer een gezichtsveld met kristallijn ureum en verhoog de pockels iets (tot een maximum van 15).
    3. Maak vervolgens een afbeelding met dezelfde parameters die worden gebruikt voor celbeeldvorming: constante fractiediscriminator (CFD) 1 x 104 - 1 x 105, resolutie van 256 x 256, verblijftijd ingesteld op 4,8 μs, optische zoom ingesteld op 1,5x en een integratietijd van 60 s.
  4. Voer in vitro beeldvorming gedurende de fluorescentielevensduur en intensiteitsbeeldvorming uit voor autofluorescentie van kanaal 1 en kanaal 2 op live qNSC's en aNSC's
    1. Zoek een gezichtsveld naar beeld: Gebruik de oculair om een geschikt gezichtsveld te vinden en verander het lichtpad naar het monster op de microscoop om beeldvorming mogelijk te maken.
      OPMERKING: Er wordt eerst een kanaal 1-beeld verkregen, gevolgd door een kanaal 2-beeld van hetzelfde gezichtsveld.
    2. Instellen voor het verzamelen van kanaal 1-beeld: Klik op het tabblad Power/Gain en stel de versterking op de PMT in op 800, klik op het tabblad 2-P Laser en selecteer 750 nm voor de laser en zorg ervoor dat de juiste filterkubus wordt gebruikt (440/80 nm).
    3. Verzamel een afbeelding van kanaal 1.
      1. Start de Preview-modus door naar het tabblad Power/Gain te gaan en de Pockels in te stellen op 30, vervolgens naar het gedeelte Scannen van dat scherm te gaan en op Live Scan te klikken.
      2. Verhoog de Pockels om een goed gezichtsveld te vinden bij een laag laservermogen (minder dan 3,6 mW). Zodra het gezichtsveld is gevonden, past u de Pockels zo aan dat de vermogensmeter ~3.6 mW aangeeft op het vermogen na de pockelcel, en de constante breukdiscriminator (CFD) in het tabblad Telsnelheden meet 1 x 104 - 1 x 105.
    4. Ga naar het gedeelte Scannen en klik op Enkele scan zodra aan deze parameters is voldaan. Hiermee wordt een kanaal 1-beeld van meer dan 60 s verkregen.
    5. Om een kanaal 2-afbeelding te verzamelen, klikt u op het tabblad 2-P laser en selecteert u 890 nm voor de laser, verwisselt u de filterkubus met de kanaal2-emissiekubus (550/100 nm).
    6. Start de preview-modus zoals beschreven in 3.4.3, verhoog de Pockels totdat de vermogensmeter ~7 mW aangeeft en de CFD-tellingen zijn weer 1 x 104 -1 x 105.
    7. Ga naar het gedeelte Scannen en klik op Enkele scan zodra aan die parameters is voldaan. Hiermee wordt een kanaal 2-beeld van meer dan 60 s verkregen.
    8. Verkrijg meer afbeeldingen - Nadat u een afbeelding van kanaal 1 en kanaal 2 hebt verkregen, zoekt u een nieuw gezichtsveld en herhaalt u de stappen 3.4.2 - 3.4.4. Doorgaans is het verzamelen van 4-6 gezichtsvelden om ~50-100 cellen in beeld te brengen voldoende voor één voorwaarde in een experiment.
      OPMERKING: mCherry kan worden gebruikt als een extra fluorescerend label zonder door te drukken naar de kanalen Kanaal 1 en Kanaal 2.
  5. Analyseer de beelden van de fluorescerende levensduur.
    1. Genereer vervalmatrices voor beelden van de fluorescentielevensduur in SPCImage volgens de stappen 3.5.2-3.1.14.
      OPMERKING: Raadpleeg voor meer informatie de bijgewerkte handboeken die gratis online beschikbaarzijn 26.
    2. Open SPCImage en open de IRF FLIM-afbeelding die in sectie 3.3 is verzameld.
    3. Pas de verticale zwarte balken in het histogram aan om beperkt te zijn tot de IRF-vervalcurve. Klik in de bovenste menubalk op IRF > Kopiëren naar klembord.
    4. Open een FLIM-afbeeldingsbestand binnen de te analyseren dataset, verkregen in sectie 3.4.
    5. Klik in de bovenste menubalk op IRF > Plakken van klembord.
    6. Stel in de rechterbenedenhoek van de software Componenten in op 2.
    7. Klik in de bovenste menubalk van de software op Opties > Model. Selecteer vervolgens MLE voor Pasvormmethode, Ruimtelijke Binning naar Vierkant, Drempel naar piek en selecteer onder Instellingen de optie Multiexponentieel verval.
    8. Verhoog in de linkerbenedenhoek van de software Bin totdat het aantal fotonen ten minste 100 is in representatieve cytoplasmatische pixels op de piek van het aantal fotonen onmiddellijk na excitatie.
    9. Stel linksonder in de software de drempel in. Gebruik voor kanaal 1 een drempelwaarde van "50". Gebruik voor kanaal 2 een drempelwaarde van '0'.
    10. Klik in de bovenste menubalk van de software (dit protocol beschrijft hoe versie 8.3 moet worden bediend) op Bereken > Decay Matrix.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de Chi2-waarden in de hele afbeelding ~0.8-1.2 zijn. Dit bevestigt dat de gegevens robuust zullen zijn door bi-exponentiële vervalmodellering te valideren.
    11. Klik in de bovenste menubalk op Bestand > Opslaan.
    12. Klik in de bovenste menubalk van de software op Bestand > Exporteren en exporteer het volgende:
      Kleurgecodeerde waarde, T1, T2, Chi2, pixelintensiteit, A1[%], A2[%] en kleurgecodeerd beeld (met legenda)
      OPMERKING: Nu is SPCImage ingesteld om een batchproces uit te voeren, waarbij alle afbeeldingen van een bepaald kanaal worden geanalyseerd (analyseer Kanaal 1 FLIM-afbeeldingen samen en herhaal dit vanaf stap 3.5.2 voor Kanaal 2 FLIM-afbeeldingen).
    13. Om een batchverwerking uit te voeren, klikt u op Bereken > batchverwerking en selecteer u de te verwerken FLIM-beelden.
    14. Klik in de bovenste menubalk op Bestand > Exporteren > Batchexport en selecteer de vervalmatrices die u wilt exporteren (gegenereerd in de vorige stap).
    15. Gebruik CellProfiler om cytoplasmatische maskers te maken volgens de stappen 3.5.16-3.5.24.
      OPMERKING: Om dit te doen, worden kernen handmatig rond intensiteitsbeelden van kanaal 1 geplaatst, waarbij de kern zwart en duidelijk zichtbaar is. Vervolgens zal een CellProfiler-pijplijn manual_segmentation.cpproj27 (aanvullend bestand 1) automatisch een hele cel en een cytoplasmatisch masker produceren, zoals aangegeven door het nucleaire masker. Kernen kunnen ook worden gelabeld met mCherry en worden afgebeeld naast autofluorescentie van kanaal 1 en kanaal 2 om de mogelijkheid te bieden om de identificatie van kernen te automatiseren. Veel conventionele nucleaire kleurstoffen zullen echter spectraal in de autofluorescentiekanalen bloeden en zijn dus onverenigbaar met deze techniek.
    16. Gebruik in R Studio R_ASCtoTIFF.rmd27 (aanvullend bestand 2) om de X_photons.asc-bestanden te converteren, waarbij X de naam is van de verkregen afbeelding van de afbeelding van kanaal 1 die is ingesteld op TIF-bestanden.
    17. Open Cell Profiler en open manual_segmentation.cpproj.
    18. Laad de foton-TIF's van kanaal 1 die zijn gemaakt in stap 3.5.16 in de stap Afbeeldingen boven aan de pijplijn.
    19. In de onderste 3 stappen in de pijplijn met de titel SaveImages stelt u een opslagpad in voor de maskers die CellProfiler zal genereren.
    20. Klik op Start Test Mode linksonder in CellProfiler.
    21. Klik op Uitvoeren linksonder in CellProfiler. Wanneer CellProfiler bij de stap IdentifyObjectsManually komt, verschijnt er een venster met de huidige Channel 1-afbeelding die wordt verwerkt.
    22. Klik op de F-toets op het toetsenbord en teken vervolgens handmatig een spoor van de kernen van een cel terwijl u de linkermuisknop ingedrukt houdt. Nadat u kernen hebt getraceerd, laat u de linkermuisknop los. Herhaal deze stap voor alle cellen in de afbeelding.
    23. Klik op Gereed rechtsonder in het pop-upvenster met de intensiteitsafbeelding. De software zal nu de pijplijn voltooien en cytoplasmatische, nucleaire en totale celmaskers exporteren.
    24. Klik linksonder op Volgende beeldset en herhaal stap 3.5.21-3.5.23 voor alle kanaal 1 TIF-afbeeldingen.
    25. Gebruik het R-script (Integreer vervalmatrices en cytoplasmatische maskers.rmd) om vervalmatrices te integreren die zijn gegenereerd in stappen 3.5.2-3.5.14 en cytoplasmatische maskers die zijn gegenereerd in stappen 3.5.15-3.5.24 om gemiddelde fluorescentielevensduurbeeldvormingsvariabelen voor het cytoplasma van elke cel te verkrijgen door stappen 3.5.26-3.5.30 te volgen
    26. Maak met behulp van een spreadsheet (bijv. Microsoft Excel) een .csv document met de titel test_key 27 [Aanvullend bestand 3] als voorbeeld) met 3 kolommen.
    27. Geef de kolommen de titel Map, NADH en FAD. Vul de tabel in om de maplocatie in de map weer te geven en vul vervolgens het voorvoegsel van de afbeeldingstitel in respectievelijk NADH en FAD in om elke afbeelding van kanaal 1 aan elke afbeelding van kanaal 2 te koppelen (zie voorbeeldgegevens - tabel 2).
  6. Open in R Studio Integreer vervalmatrices en cytoplasmatische maskers.rmd27(aanvullend bestand 4).
    1. Stel de volgende bestandspaden in zoals geannoteerd in het script: Werkmap instellen, Kanaal 1-bestandslocatie, FAD-bestandslocatie, Maskerbestandslocatie en Locatie en naam van het uitvoerbestand.
    2. Voer het hele script uit. Na succesvolle afronding van het script wordt een uitvoerbestand gegenereerd, inclusief metadata en gemiddelde FLIM-variabelen.
    3. Voer de analyse uit met behulp van autofluorescentie FLIM data.rmd27 (aanvullend bestand 5) of met behulp van andere analysesoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Confocale autofluorescentiebeeldvorming naar afzonderlijke NSC-celtoestand (Figuur 1)
Om confocale microscopie te gebruiken om de NSC-activeringstoestand op te lossen, werden qNSC's en aNSC's in vitro gegenereerd met behulp van een activeringsmedium of rustmedium, zoals eerder beschreven 10,13,17,18. Om...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft een levende-cel, labelvrije, niet-destructieve, single-cell resolutietechniek die de classificatie van NSC-celtoestand in vitro mogelijk maakt door middel van beeldvorming van autofluorescerende signalen in NSC's. Deze benadering detecteert metabole verschuivingen die optreden tijdens het verlaten van NSC-rust, die de optische eigenschappen van metabole cofactoren, zoals NAD(P)H, beïnvloeden en biedt veel voordelen ten opzichte van bestaande technologieën...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Dankbetuigingen

We danken de UW-Madison-flowcytometriekern (P30 CA014520 en 1S10RR025483-01) en leden van het Moore-lab en de UW-Madison-gemeenschap voor hun inbreng. We danken onze financieringsbronnen: NIH T32 T32GM008688 (naar CSM), Diana Jacobs Kalman Fellowship van AFAR (naar CSM), Wisconsin Graduate Fellowship (naar CSM), DP2 NIH New Innovator Award (1DP2OD025783, naar D.L.M.), Vallee Scholar Award (naar D.L.M.), NIH 1R56NS130450 (naar D.L.M en M.C.S.), R01 CA185747 (naar M.C.S.), R01 CA205101 (naar M.C.S.), R01 CA211082 (naar M.C.S.) en de National Science Foundation Grant No. CBET-1642287 (naar M.C.S.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
40x Water objectieflensNikonMRD77410Objectieflens gebruikt in multifotonenmicroscoop in Deel 3
8 wel cuvetIbidi80826-90Voor beeldvorming aNSCs/qNSCs
Analoge vermogensmeterThorlabsPM100AGebruikt in multifotonenmicroscoop in Deel 3
Antibioticum-Antimycoticum (100X) (PSF)Thermo Fisher15240062Antibioticum voor NSC media
B-27Invitrogen17504044Voedingssupplement voor NSC media
BMP4Fisher Scientific5020BP010Factor voor het induceren van kiemrust
RundserumalbumineSigmaA4919-25GVoor het maken van BMP4
Chameleon ultrasnelle laserCoherentN/ALaser gebruikt in multifotonenmicroscoop in Deel 3
Confocale microscoopNikonC2Microscoop gebruikt voor Deel 1
DMEM/F-12 (zonder GlutaMAX)Invitrogen11320033Basismedia voor NSCs
DNAseSigmaD5025-15KUToegevoegd aan trypsine-remmer
EdU-assaykitInvitrogenC10337Proliferatie-assay voor celcultuur
EGFPeproTechAF-100-15-500UGGroeifactor voor NSC media
FGFPeproTech100-18BGroeifactor voor NSC media
Fluorescent geactiveerde celsorteerderBDFACSAriaFluorescent geactiveerde celsorteerder gebruikt voor Deel 2
HeparineSigmaH3149-50KUAdditief voor NSC media
L-15Invitrogen21083027Voor het bereiden van trypsine-remmeroplossing
LamineSigmaL2020-1MGVoor het coaten van glaswerk
Nikon TiE omgekeerde microscoopNikonN/AMicroscoopframe gebruikt voor Deel 3
PLOSigmaP3655-100MGVoor het coaten van glaswerk
SPC-150 Enkelfoton tellende elektronicaBecker and HicklN/AGebruikt in multifotonenmicroscoop in Deel 3
Trypsine (voor het trypsiniseren van pellets van aNSCs die groeiden als sferen of monolagen)Gibco15090046Voor het trypsiniseren van neurosferen of aanhangende aNSCs
Trypsine (voor het trypsiniseren van qNSCs)Gibco25200072Voor het trypsiniseren van aanhangende qNSCs
Trypsine-remmerSigmaT6522-100MGVoor het remmen van trypsinisatie van aNSCs
UreakristallenSigmaU5128-5GGebruikt om een IRF te verzamelen
VerseenThermo Fisher15040066Voor het bereiden van trypsine

Referenties

  1. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult neurogenesis in the hippocampus: From stem cells to behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  2. Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. J Neurosci. 16 (6), 2027-2033 (1996).
  3. Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
  4. Urban, N., Blomfield, I. M., Guillemot, F. Quiescence of adult mammalian neural stem cells: A highly regulated rest. Neuron. 104 (5), 834-848 (2019).
  5. Urban, N., et al. Return to quiescence of mouse neural stem cells by degradation of a proactivation protein. Science. 353 (6296), 292-295 (2016).
  6. Kalamakis, G., et al. Quiescence modulates stem cell maintenance and regenerative capacity in the aging brain. Cell. 176 (6), 1407-1419 (2019).
  7. Walsh, A. J., et al. Classification of T-cell activation via autofluorescence lifetime imaging. Nat Biomed Eng. 5 (1), 77-88 (2021).
  8. Sagar, M. A. K., et al. Microglia activation visualization via fluorescence lifetime imaging microscopy of intrinsically fluorescent metabolic cofactors. Neurophotonics. 7 (3), 035003(2020).
  9. Knobloch, M., et al. Metabolic control of adult neural stem cell activity by Fasn-dependent lipogenesis. Nature. 493 (7431), 226-230 (2013).
  10. Knobloch, M., et al. A fatty acid oxidation-dependent metabolic shift regulates adult neural stem cell activity. Cell Rep. 20 (9), 2144-2155 (2017).
  11. Knobloch, M., et al. SPOT14-positive neural stem/progenitor cells in the hippocampus respond dynamically to neurogenic regulators. Stem Cell Reports. 3 (5), 735-742 (2014).
  12. Shin, J., et al. Single-cell RNA-Seq with waterfall reveals molecular cascades underlying adult neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
  13. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  14. Beckervordersandforth, R. Mitochondrial metabolism-mediated regulation of adult neurogenesis. Brain Plast. 3 (1), 73-87 (2017).
  15. Morrow, C. S., et al. Autofluorescence is a biomarker of neural stem cell activation state. Cell Stem Cell. , (2024).
  16. Kolenc, O. I., Quinn, K. P. Evaluating cell metabolism through autofluorescence imaging of NAD(P)H and FAD. Antioxid Redox Signal. 30 (6), 875-889 (2019).
  17. Mira, H., et al. Signaling through BMPR-IA regulates quiescence and long-term activity of neural stem cells in the adult hippocampus. Cell Stem Cell. 7 (1), 78-89 (2010).
  18. Morrow, C. S., et al. Vimentin coordinates protein turnover at the aggresome during neural stem cell quiescence exit. Cell Stem Cell. 26 (4), 558-568 (2020).
  19. Martynoga, B., et al. Epigenomic enhancer annotation reveals a key role for NFIX in neural stem cell quiescence. Genes Dev. 27 (16), 1769-1786 (2013).
  20. Bin Imtiaz, M. K., Jessberger, S. Isolation of adult mouse hippocampal neural stem cells for fluorescence loss in photobleaching assays. STAR Protoc. 2 (3), 100695(2021).
  21. Guo, W., Patzlaff, N. E., Jobe, E. M., Zhao, X. Isolation of multipotent neural stem or progenitor cells from both the dentate gyrus and subventricular zone of a single adult mouse. Nat Protoc. 7 (11), 2005-2012 (2012).
  22. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Johnson, M. L. Fluorescence lifetime imaging of free and protein-bound NADH. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (4), 1271-1275 (1992).
  23. Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radic Biol Med. 100, 53-65 (2016).
  24. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. J Biomed Opt. 25 (7), 1-43 (2020).
  25. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  26. Becker & Hichl Handbooks. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2024).
  27. GitHub Materials. , Available from: https://github.com/chrismorrow5/Neural-Stem-Cell-Autofluorescence-Analysis/ (2024).
  28. Codega, P., et al. Prospective identification and purification of quiescent adult neural stem cells from their in vivo niche. Neuron. 82 (3), 545-559 (2014).
  29. Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-cell transcriptomics reveals a population of dormant neural stem cells that become activated upon brain injury. Cell Stem Cell. 17 (3), 329-340 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

neurale stamcellenactivering van NSC'sadulte neurogenesequiescentie van NSC'sautofluorescentie-imagingconfocale microscopieflowcytometriefluorescence lifetime imagingclassificatie van celtoestandenanalyse van levende cellen
Classificatie van neurale stamcelactiveringstoestand in vitro met behulp van autofluorescentie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.