Method Article

Retinale pathofysiologische evaluatie in een rattenmodel

DOI:

10.3791/63111

⸱

May 6th, 2022

 , 
1Translational Pharmaceutics Research Laboratory (TPRL), Department of Pharmacy, Birla Institute of Technology & Science — Pilani, Hyderabad Campus

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diabetische retinopathie is een van de belangrijkste oorzaken van blindheid. Histologie, bloed-retinale barrièreafbraaktest en fluorescentieangiografie zijn waardevolle technieken om de pathofysiologie van het netvlies te begrijpen, wat de efficiënte screening van geneesmiddelen tegen diabetische retinopathie verder zou kunnen verbeteren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een posterieure segment oogziekte zoals diabetische retinopathie verandert de fysiologie van het netvlies. Diabetische retinopathie wordt gekenmerkt door een netvliesloslating, afbraak van de bloed-retinale barrière (BRB) en retinale angiogenese. Een in vivo rattenmodel is een waardevol experimenteel hulpmiddel om de veranderingen in de structuur en functie van het netvlies te onderzoeken. We stellen drie verschillende experimentele technieken voor in het rattenmodel om morfologische veranderingen van retinale cellen, retinale vasculatuur en gecompromitteerde BRB te identificeren. Retinale histologie wordt gebruikt om de morfologie van verschillende retinale cellen te bestuderen. Ook wordt kwantitatieve meting uitgevoerd door retinale celgetal- en diktemeting van verschillende retinale lagen. Een BRB-afbraaktest wordt gebruikt om de lekkage van extraoculaire eiwitten uit het plasma naar glasachtig weefsel te bepalen als gevolg van de afbraak van BRB. Fluorescentieangiografie wordt gebruikt om angiogenese en lekkage van bloedvaten te bestuderen door retinale vasculatuur te visualiseren met behulp van FITC-dextran-kleurstof.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diabetische retinopathie (DR) is een van de meest complexe secundaire complicaties van diabetes mellitus. Het is ook de belangrijkste oorzaak van vermijdbare blindheid bij de beroepsbevolking wereldwijd. In een recente meta-analyse van 32,4 miljoen blinde mensen waren 830.000 (2,6%) mensen blind als gevolg van DR1. Het aandeel van verlies van gezichtsvermogen toegeschreven aan diabetes stond in 2015 op de zevende plaats met 1,06% (0,15-2,38) wereldwijd2,3.

Diabetische retinopathie wordt gediagnosticeerd door vasculaire afwijkingen in de achterste oculaire weefsels. Klinisch is het verdeeld in twee stadia - Non-Proliferatieve DR (NPDR) en Proliferatieve DR (PDR), gebaseerd op de vascularisatie in het netvlies. Hyperglycemie wordt beschouwd als de krachtige regulator van DR omdat het verschillende routes impliceert die betrokken zijn bij neurodegeneratie4,5, ontsteking6,7 en microvasculatuur8 in het netvlies. Meerdere metabole complicaties geïnduceerd als gevolg van hyperglycemie omvatten de accumulatie van geavanceerde glycatie-eindproducten (AGE's), polyolroute, hexosamineroute en eiwitkinase-C-route. Deze routes zijn verantwoordelijk voor celproliferatie (endotheelcellen), migratie (pericyten) en apoptose (neurale retinale cellen, pericyten en endotheelcellen) op basis van verschillende stadia van diabetische retinopathie. Deze metabole veranderingen kunnen leiden tot fysiologische veranderingen zoals netvliesloslating, verlies van retinale cellen, afbraak van de bloed-retinale barrière (BRB), aneurysma's en angiogenese9.

Streptozotocine (STZ) geïnduceerde type-1 diabetes is een gevestigde en goed geaccepteerde praktijk bij ratten voor het evalueren van diabetes pathogenese en de complicaties ervan. Diabetogene effecten van STZ zijn te wijten aan selectieve vernietiging van pancreaseilandjes β-cellen10. Als gevolg hiervan zullen de dieren insulinedeficiëntie, hyperglycemie, polydipsie en polyurie ondergaan, die allemaal kenmerkend zijn voor diabetes mellitus11 bij de mens type 1. Voor ernstige diabetesinductie wordt STZ toegediend met 40-65 mg / kg lichaamsgewicht intraveneus of intraperitoneaal tijdens de volwassenheid. Na ongeveer 72 uur vertonen deze dieren bloedglucosewaarden van meer dan 250 mg / dL10,12.

Om de fysiologische veranderingen van het netvlies als gevolg van neurodegeneratie, ontsteking en angiogenese te begrijpen, moeten verschillende technieken worden geoptimaliseerd in experimentele diermodellen. Structurele en functionele veranderingen in retinale cellen en retinale vaten kunnen worden bestudeerd door verschillende technieken zoals histologie, BRB-afbraaktest en fluorescentieangiografie.

Histologie omvat de studie van de anatomie van cellen, weefsels en organen op microscopisch niveau. Het legt een correlatie tussen de structuur en functie van cellen/weefsel. Verschillende stappen worden uitgevoerd om de microscopische veranderingen in de weefselstructuur te visualiseren en te identificeren, waardoor gezonde en zieke tegenhangers worden vergeleken13. Daarom is het essentieel om elke stap van de histologie zorgvuldig te standaardiseren. Verschillende stappen die betrokken zijn bij retinale histologie zijn fixatie van het monster, trimmen van het monster, uitdroging, opruimen, impregneren met paraffine, paraffine inbedding, sectie en kleuring (Hematoxyline en Eosine kleuring)13,14.

In een gezond netvlies wordt het transport van moleculen over het netvlies gecontroleerd door BRB, bestaande uit endotheelcellen en pericyten aan de binnenkant en retinale pigmentepitheelcellen aan de buitenkant. Innerlijke BRB-endotheelcellen en pericyten beginnen echter te degenereren tijdens de zieke toestand en BRB is ook aangetast15. Door deze BRB-afbraak lekken veel moleculen met een laag molecuulgewicht in glasvocht en netvliesweefsel16. Naarmate de ziekte vordert, lekken veel andere eiwitmoleculen (laag en hoog molecuulgewicht) ook in glasvocht en netvliesweefsel als gevolg van homeostasestoornissen17. Het leidt tot verschillende andere complicaties en uiteindelijk macula-oedeem en blindheid. Vandaar dat het kwantificeren van de eiwitniveaus in het glasvocht en het vergelijken van gezonde en diabetische toestanden BRB in gevaar bracht.

Fluorescentieangiografie is een techniek die wordt gebruikt om de bloedcirculatie van het netvlies en het vaatvlies te bestuderen met behulp van fluorescerende kleurstof. Het wordt gebruikt om vasculatuur van het netvlies en vaatvlies te visualiseren door fluoresceïnekleurstof te injecteren via intraveneuze route of hartinjectie18. Zodra de kleurstof is geïnjecteerd, bereikt deze eerst de retinale slagaders, gevolgd door retinale aderen. Deze circulatie van kleurstof wordt meestal voltooid binnen 5 tot 10 minuten na de injectie van kleurstof19. Het is een belangrijke techniek om verschillende posterieure segment oculaire ziekten te diagnosticeren, waaronder diabetische retinopathie en choroïdale neovascularisatie20. Het helpt bij het detecteren van grote en kleine vasculatuurveranderingen in normale en zieke omstandigheden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol volgt alle richtlijnen voor dierverzorging die worden verstrekt door de Institutional Animal Ethics Committee, BITS-Pilani, Hyderabad campus.

1. Retinale histologie

  1. Enucleatie en fixatie van het oog
    1. Euthanaseer een 2 tot 3 maanden oude diabetische Wistar mannelijke rat samen met de leeftijd-gematchte controle (14 tot 15 weken oud) met behulp van een hoge dosis pentobarbital (150 mg / kg) geïnjecteerd via de intraperitoneale route. Geen detecteerbare hartslag bevestigt het overlijden binnen 2-5 minuten.
    2. Enucleeer het oog door incisies te maken met behulp van een scalpelmes op de neus- en temporale gebieden van het oog. Knip vervolgens langs de randen met een tang en microschaar om het oog uit de orbitale kom te verwijderen.
      OPMERKING: Voordat u ratten opoffert, moet u de fixatieve oplossingen klaar houden.
      LET OP: Formaldehyde irriteert de huid, het oog, de neus en de luchtwegen. Het kan ook kanker veroorzaken omdat het een krachtige huidsensibilisator is. Draag handschoenen en hanteer deze onder de motorkap21.
    3. Was het oog grondig met 10 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in een petrischaaltje om bloed te verwijderen. Verwijder het overtollige vet rond het oog voor eenvoudige penetratie van de fixerende oplossing.
    4. Plaats het oog onmiddellijk in 5 ml fixatieve oplossing met behulp van een tang en zorg ervoor dat het niet vastzit aan wanden van glazen injectieflacons. Roer voorzichtig een paar seconden en vervang de dop door de juiste etikettering. Incubeer het oog in een fixatieve oplossing gedurende 24 tot 48 uur in donkere omstandigheden bij kamertemperatuur.
  2. Trimmen van weefsel
    1. Verwijder na fixatie het oog uit de fixatieve oplossing, was met 10 ml PBS en plaats het in een petrischaal met 10 ml PBS gekoeld bij 4 °C.
    2. Houd met behulp van een microtang het oog met de oogzenuw en maak een inkeping bij pars plana met behulp van een microschaar. Snijd door de hele rand van het hoornvlies om de voorste beker van een oog te scheiden. Gebruik een tang, kies de lens voorzichtig, gooi deze weg en snijd de oogzenuw door.
    3. Maak met behulp van een gebogen microschaar een lengtegedeelte van de achterste oogschelp, door de optische schijf en verdeelt deze in twee helften. Plaats het in de basis van de cassette en sluit het deksel goed zonder enige verstoring van het weefsel. Label de cassettes met de naam en datum van het weefselmonster.
  3. Uitdroging, clearing en paraffine impregnatie van weefsel
    1. Droog het getrimde weefsel uit door geleidelijke overdracht in 80 ml van 50%, 70%, 90% en 100% ethanol. Zorg ervoor dat u de cassettes tijdens het overbrengen van de cassettes van de ene concentratie naar de andere op schoon tissuepapier dept om besmetting te minimaliseren.
      OPMERKING: Laat het weefsel gedurende 30 minuten (tweemaal) in elke overdracht staan. De totale tijd die voor deze stap wordt verbruikt, is ongeveer 4 uur.
    2. Breng na uitdroging de cassettes gedurende 30 minuten (tweemaal) over in 80 ml xyleen om de ethanol te vervangen door xyleen.
      OPMERKING: Na incubatie met xyleen wordt het weefsel doorschijnend.
      LET OP: Xyleen is een aromatische verbinding met een benzeenring. Het irriteert het oog en het slijmvlies en kan ook depressies veroorzaken.
    3. Impregneer ten slotte het weefsel met voorverwarmde paraffine bij 60 °C om xyleen in het weefsel te vervangen. Dep de cassettes meerdere keren op tissuepapier om het xyleengehalte te minimaliseren en plaats gedurende 2 uur (1 uur x 2) 200 ml paraffine (vloeistof bij 60 °C) in 2 uur (1 uur x 2).
      LET OP: Vermijd het inhaleren van gesmolten paraffine, omdat het kleine lipidedruppeltjes produceert die ademhalingsongemakken kunnen veroorzaken.
  4. Paraffine inbedding
    1. Schakel de paraffine-insluitmachine ten minste 1 uur voor gebruik in om de paraffine te smelten en ervoor te zorgen dat de stations de gewenste temperaturen bereiken. Vul een stalen mal met gesmolten paraffine door deze op een heet oppervlak te plaatsen en verwijder vervolgens één cassette tegelijk uit de paraffinecontainer.
    2. Verplaats de stalen mal van een warm naar een koud oppervlak (4 °C). Op dit punt zal de was in de mal beginnen te stollen. Voordat het volledig stolt, plaatst u het weefsel in was met behulp van een tang en oriënteert u het weefsel zodat het optische schijfgedeelte van de achterste beker naar de basis van de mal is gericht.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het weefsel niet beweegt en de gewenste oriëntatie behoudt. Zo niet, plaats de vorm dan terug op het warme werkoppervlak totdat de hele paraffine vloeibaar wordt en begin dan opnieuw met stap 1.4.2.
    3. Als de was in de mal begint te stollen, plaatst u onmiddellijk de cassettebasis bovenop de mal. Vul de mal voorzichtig met paraffine boven de bovenrand van de cassette en breng deze langzaam over naar een koud oppervlak (in de buurt van -20 °C) voor snelle stolling. Totdat het stolt, herhaalt u het proces met andere cassettes uit stap 1.4.2.
    4. Zodra alle mallen zijn gestold, scheidt u de stalen mal van de cassette. Als het moeilijk is, wacht dan wat langer en probeer het opnieuw (verwijder het niet met geweld). Scheiding wordt gemakkelijker na volledige stolling. Nu wordt de cassette de basis van het paraffineblok dat tijdens het doorsnijden door microtoom moet worden vastgehouden.
      OPMERKING: Dit blok kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen voor verder gebruik. Op dit punt kan het proces worden gestopt en later worden voortgezet (indien nodig).
  5. Doorsnede
    1. Installeer een microtoom wegwerpmesje in de meshouder. Verwijder overtollige paraffine rond cassettes, zodat zowel het bovenste als het onderste gedeelte van de blokken evenwijdig aan het mes blijven. Plaats het blok op de cassettehouder.
    2. Ontgrendel het handwiel om het vooruit te helpen totdat het oppervlak van het blok in contact is met de rand van het mes. Trim de overtollige paraffine op het blok totdat het weefsel op het oppervlak van het blok is gevisualiseerd. Stel de sectiedikte in op 5 μm en knip een lint van vijf tot zes secties door.
    3. Breng het lint met een tang voorzichtig over op het oppervlak van het voorverwarmde waterbad (ongeveer 50 °C) om het lint uit te vouwen. Verzamel secties op een glazen dia bedekt met Mayer's albumine door de dia onder de sectie te houden. Til de secties voorzichtig op en laat de glijbanen 's nachts horizontaal drogen bij 37 °C.
      OPMERKING: Dia's kunnen bij kamertemperatuur enkele maanden in droge dozen worden bewaard. Bij deze stap kan het proces worden gestopt en later worden voortgezet.
  6. Kleuring
    1. Verwarm de te kleuren glaasjes vóór gebruik gedurende 1 uur in een heteluchtoven bij 60 °C om de paraffine te laten smelten en volg de in tabel 1 vermelde stappen.
      LET OP: Hematoxyline en Eosine vlekken zijn giftig bij inademing of inname. Er is gemeld dat ze kankerverwekkend zijn.
ReagensStaande tijdHerhaling (Aantal keren)
Xyleen5 min.2
100% Ethanol5 min.2
90% Ethanol5 min.2
70% Ethanol5 min.2
50% Ethanol5 min.2
Water5 min.2
Hematoxyline4 min.1
Water wassen
1% Zure alcohol in 70% Ethanol30 s1
Water wassen
Scott's water1 min.1
Water wassen
50% Ethanol1 min.1
95% Ethanol1 min.1
0,25% Eosine5 s1
Water wassen
Water2 min.1
95% Ethanol1 min.1
100% Ethanol1 min.1
Xyleen5 min.2
Mountant en coverslip

Tabel 1. Hematoxyline en Eosine kleuring procedure

2. Bloed-hersenbarrière afbraaktest

  1. Bloed- en glasvochtverzameling
    1. Anesthetiseer een 2 tot 3 maanden oude diabetische Wistar mannelijke rat samen met de leeftijd-gematchte controle (14 tot 15 weken) met ketamine (80 mg / kg) en xylazine (8 mg / kg). Bevestig de verdovingstoestand door pedaaltrekreflex (teenknijpen). Verzamel onmiddellijk 1 ml bloed door hartpunctie in een ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) gecoate buis om plasma van volbloed te scheiden.
    2. Euthanaseer de rat met behulp van een hoge dosis pentobarbital (150 mg / kg), geïnjecteerd via de intraperitoneale route. Geen detecteerbare hartslag bevestigt het overlijden binnen 2-5 minuten. Enucleeer het oog en plaats het onmiddellijk op droogijs.
    3. Plaats het oog in een schone petrischaal boven droogijs (aanbevolen) en begin met het ontleden van het oog zoals vermeld in stap 1.2.2.
    4. Verwijder de lens, trek het glasvocht voorzichtig uit de achterste beker met behulp van een microtang en plaats het in een homogenisatiebuis met drie tot vier glasparels (2-4 mm).
      OPMERKING: Dissectie op droogijs wordt aanbevolen omdat het verwijderen van de lens en het glasvocht gemakkelijker is onder vriesomstandigheden.
  2. Bereiding van monsters
    1. Homogeniseer glasvochthumor in een kraalhomogenisator op gemiddelde snelheid gedurende 10 s.
    2. Breng het bloed (1 ml) en de glasvochtmonsters (10-20 μL) over in de microcentrifugebuizen en centrifugeer beide monsters bij 5200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: In het geval van succesvolle homogenisatie heeft glasvocht een uniforme consistentie na centrifugeren. In het geval van niet-uniforme consistentie van glasvocht, herhaal dit echter vanaf stap 2.2.1 met een verhoogde homogenisatietijd.
    3. Verzamel supernatant uit beide monsters en verdun glasvochthumor en plasmamonsters in respectievelijk 1:10 en 1:20 met PBS.
  3. Eiwitkwantificering en glasvocht-plasma-eiwitverhouding
    1. Om de eiwitconcentratie in glasvochthumor- en plasmamonsters te kwantificeren, voegt u 5 μL verdunde monsters toe aan 250 μL Bradford-reagens, mengt u goed en leest u de absorptie bij 590 nm binnen 40 minuten.
      OPMERKING: Als de absorptiewaarde van de monsters hoger is dan 1,0, verdunt u de monsters verder en herhaalt u de procedure van stap 2.2.3.
    2. Normaliseer het glasvochteiwitniveau naar plasma-eiwitniveau van dezelfde rat en meet het vouwverschil tussen gezonde versus diabetische ratten.

3. Fluorescentieangiografie

  1. FITC-dextran70000 kleurstof injectie
    1. Verdoof een 2 tot 3 maanden oude diabetische Wistar-mannelijke rat samen met de leeftijdsgematchte controle (14 tot 15 weken) met behulp van 3% isofluraan en bevestig de pedaalontwenningsreflex (teen knijpen). Dompel de staart in een bekerglas met warm water (37-40 °C). Reinig de staart met 70% ethanol voordat u de kleurstof injecteert. Zoek de laterale ader van de staart en markeer de injectiepositie in het onderste deel van de staart.
      OPMERKING: Als het inbrengen van de naald mislukt, probeer dan op een andere locatie boven de huidige positie in te brengen (tip naar de basis van de staart). Het wordt echter geadviseerd om eenmaal te injecteren, omdat herhaald prikken kan leiden tot stressontwikkeling bij de rat, wat vasoconstrictie kan veroorzaken.
    2. Injecteer 1 ml 50 mg/ml FITC-dextran70000 kleurstofoplossing door de staartader en laat de kleurstof gedurende 5 minuten circuleren. Euthanaseer de rat met een hoge dosis pentobarbital (150 mg / kg), geïnjecteerd via de intraperitoneale route. Geen detecteerbare hartslag bevestigt het overlijden binnen 2-5 minuten. Enucleer het oog zoals vermeld in stap 1.1.1.
      OPMERKING: Indien nodig kan het oog worden gefixeerd in 4% formaldehyde-oplossing, gedurende niet meer dan 30 minuten.
  2. Flat mount voorbereiding
    1. Voor het voorbereiden van platte bevestigingen houdt u de ontleedgereedschappen bij de hand, samen met de dia's en coverslips. Plaats het oog in een petrischaaltje gevuld met gekoeld PBS en begin met het ontleden van het oog zoals vermeld in stap 1.2.2.
    2. Plaats nu de punt van een puntige tang tussen de sclera en het netvlies. Beweeg het voorzichtig langs de rand van de beker en zorg ervoor dat het netvlies op geen enkel moment aan de sclera is bevestigd. Als er een obstructie is, knip dat deel dan langzaam langs de rand met behulp van een gebogen microschaar.
    3. Zodra is bevestigd dat het netvlies van geen enkele kant aan de sclera is bevestigd, snijdt u in de buurt van de optische schijf en maakt u een klein gaatje zodat het netvlies volledig loskomt van de sclera. Duw het netvlies langzaam in de PBS-oplossing en plaats het op een schone platte dia met behulp van een spatel of tang.
    4. Maak met behulp van een microschaar of scalpelmesjes kleine sneden in het netvliesweefsel en verdeel het in vier kwadranten. Zorg ervoor dat de sneden zich op een afstand van ten minste 2 mm van het gat bevinden dat de optische schijf in het midden heeft achtergelaten, zoals weergegeven in figuur 1.
    5. Verwijder overtollige PBS van de zijkanten van het weefsel met behulp van 0,2 ml tips zonder de platte houder te verstoren.
    6. Plaats een druppel anti-fading montagemedium (50 μL tot 100 μL) op een vlakke houder, dek af met een coverslip en visualiseer onmiddellijk onder een confocale microscoop.
      OPMERKING: Houd minimale lichtinval gedurende de hele procedure.
  3. Visualisatie van flat mount
    1. Visualiseer de platte houder onder 10x objectief van een confocale microscoop. Voer het scannen van tegels uit om de volledige vlakke montage als één afbeelding vast te leggen. Het aantal tegels is afhankelijk van de grootte van de retinale platte houder. Voer ook Z-stacking uit om de aderen en slagaders in verschillende foci te visualiseren (voorkeursgrootte voor Z-stack is 5 μm, afhankelijk van welke, het aantal Z-stack-stappen varieert).
    2. Gebruik PMT- en HyD-detector bij % winst als respectievelijk 700-900 en 100-150. Kies een emissiebereik tussen 510-530 nm voor FITC-dextran-kleurstof.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinale histologie
In het diabetische netvlies ondergaan retinale cellen degeneratie. Bovendien neemt de dikte van de retinale lagen toe als gevolg van oedeem22. De beelden verkregen na hematoxyline- en eosinekleuring kunnen worden gebruikt voor het aantal cellen en het meten van de dikte van verschillende lagen, zoals weergegeven in figuur 2 met behulp van ImageJ.

Bloed-retinale barrièreafbraaktest
...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histologie
Retinale histologie wordt uitgevoerd om de morfologische veranderingen van retinale cellen en lagen te visualiseren. Verschillende stappen, waaronder de keuze van de fixatieve oplossing, de fixatieduur, uitdroging en paraffine-impregnatie, moeten worden geoptimaliseerd. De weefselgrootte mag niet groter zijn dan 3 mm, omdat de fixatieve penetratie langzaam wordt. De veelgebruikte 4% paraformaldehyde leidt tot netvliesloslating, zelfs in het gezonde oog vanwege de relatief hoge osmolariteit ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs willen graag de Indian Council of Medical Research (ICMR; ITR-2020-2882) voor financieringssteun aan Dr. Nirmal J. We willen ook de University Grant of Commission bedanken voor het verstrekken van Junior Research Fellowship aan Manisha Malani en Central Analytical Laboratory Facility, BITS-Pilani, Hyderabad campus voor het verstrekken van infrastructurele faciliteiten.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Histologie
Reagentia
IsofluraanAbbottAnesthesiemiddel
KetaminehydrochlorideTroikaa PharmaceuticalsAnesthesiemiddel
XylazineIndian Immunologicals LimitedAnesthesiemiddel
PentobarbitalnatriumZora PharmaEuthanasiemiddel
Fixeeroplossing (1 % formaldehyde, 1,25 % glutaaraldehydeHiMedia, AvraMB059, ASG2529Bereidt in huis
EthanolHaymanF204325Dehydratie
XyleenHiMediaMB-180Opheldering van ethanol of paraffine
ParaffinewasHiMediaGRM10702Gebruikt voor het inbedden van weefsel
GlycerolHiMediaTC503Om albumine-gecoate slides voor te bereiden. Glycerol en eiwitalbumine wordt gemengd in een 1:1-verhouding om op slides te coaten
ZoutzuurSisco Research laboratories Pvt. Ltd.65955Voor de bereiding van 1 % zuuralcohol
AzijnzuurHiMediaAS119Voor de bereiding van eosina
Scotts waterLeica3802900Blauwingreagens
Papanicolaou's oplossing 1b HematoxylinfoplossingSigma1.09254.0500Kleuren van kernen
EosinaHiMediaGRM115Kleuren van cytoplasma, 0,25% oplossing werd in huis bereid
DPX Mountant mediaSigma6522Visualisatie en bescherming van retinale secties
Apparatuur
GlaswerkBorosil
Corneale pincetStephens InstrumentsS5-1200Dissectie
Colibri-pincetStephens InstrumentsS5-1135Dissectie
Gebogen microschaarStephens InstrumentsS7-1311Dissectie
Vannas schaarStephens InstrumentsS7-1387Dissectie
Iris schaarStephens InstrumentsS7-1015Dissectie
CassettesHiMediaPW1292Om weefsel te houden tijdens histologieverwerking
WaterbadGT SonicGT Sonic-D9Temperatuurbehoud
Paraffine-inbeddingsstationMyrEC 350Bereiding van paraffineblokjes
MicrotoomZhengzhou Nanbei Instrument Equipment Co., Ltd.YD-335ASectie
BladesLeicaLeica 818Sectie
SlidesHiMediaBG005Houdt paraffine-weefselsneden vast
DekglasjesHiMediaBG014COm weefsel te bedekken na het toevoegen van montagemedia
Breken van de bloed-retinabarrière
Reagentia
IsofluraanAbbottB506Anesthesie
Droge ijsNiet van toepassingNiet van toepassingDissectie
Bradford reagensSigmaB6916Eiwitkwantificering
Apparatuur
Corneale pincetStephens InstrumentsS5-1200Dissectie
Colibri-pincetStephens InstrumentsS5-1135Dissectie
Gebogen microschaarStephens InstrumentsS7-1311Dissectie
Vannas schaarStephens InstrumentsS7-1387Dissectie
Iris schaarStephens InstrumentsS7-1015Dissectie
GlaswerkBorosilNiet van toepassing
EDTA-gecoate buisjesJ.K DiagnosticsNiet van toepassingPlasma scheiden van vol bloed
HomogenisatiebuisjesMP BiomedicalsSKU: 115076200-CFHomogenisatie van vitreuze
HomogenisatiedoppenMP BiomedicalsSKU: 115063002-CFHomogenisatie van vitreuze
GlaspebbeltjesMP BiomedicalsSKU: 116914801Homogenisatie van vitreuze
HomogenisatorBertin InstrumentsP000673-MLYS0-AHomogenisatie van vitreuze
96-welplate - TransparantGrenierGN655101Eiwitkwantificering
Plate readerMolecular devicesSpectrMax M4Absorptiemeting
CentrifugeREMICPR240 PlusCentrifugatie
Fluorescentieangiografie
Reagentia
IsofluraanAbbottB506Anesthesie
FITC-dextran 70 kD (FITC, Dextran, Dibutylin dilaureate, DMSOFITC, Dextran en Dibutylin dilaureate van Sigma; DMSO van HiMediaFITC-F3651,Dextran-31390,Dibutylin dilaureate -29123, DMSO-TC185Bereidt in huis
FluoroshieldSigmaF6182Anti-fade montagemedium
Apparatuur
Corneale pincetStephens InstrumentsS5-1200Dissectie
Colibri-pincetStephens InstrumentsS5-1135Dissectie
Gebogen microschaarStephens InstrumentsS7-1311Dissectie
Vannas schaarStephens InstrumentsS7-1387Dissectie
Iris schaarStephens InstrumentsS7-1015Dissectie
GlaswerkBorosilNiet van toepassing
SlidesHiMediaBG005Flatmount voorbereiding
DekglasjesHiMediaBG014COm weefsel te bedekken na het toevoegen van montagemedia
Confocale microscoopLe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jonas, J. B., Sabanayagam, C. Epidemiology and risk factors for diabetic retinopathy. Diabetic Retinopathy and Cardiovascular Disease. 27, 20-37 (2019).
  2. Pandova, M. G. Visual Impairment and Blindness. , IntechOpen. (2019).
  3. Mokdad, A. H., et al. Global, regional, national, and subnational big data to inform health equity research: perspectives from the Global Burden of Disease Study 2017. Ethnicity & Disease. 29, Suppl 1 159-172 (2019).
  4. Barber, A. J., et al. Neural apoptosis in the retina during experimental and human diabetes. Early onset and effect of insulin. The Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 783-791 (1998).
  5. El-Asrar, A. M. A., Dralands, L., Missotten, L., Al-Jadaan, I. A., Geboes, K. Expression of apoptosis markers in the retinas of human subjects with diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2760-2766 (2004).
  6. Schröder, S., Palinski, W., Schmid-Schönbein, G. Activated monocytes and granulocytes, capillary nonperfusion, and neovascularization in diabetic retinopathy. The American Journal of Pathology. 139 (1), 81(1991).
  7. Miyamoto, K., et al. Prevention of leukostasis and vascular leakage in streptozotocin-induced diabetic retinopathy via intercellular adhesion molecule-1 inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (19), 10836-10841 (1999).
  8. Bhanushali, D., et al. Linking retinal microvasculature features with severity of diabetic retinopathy using optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 519-525 (2016).
  9. Wang, W., Lo, A. C. Diabetic retinopathy: pathophysiology and treatments. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1816(2018).
  10. Akbarzadeh, A., et al. Induction of diabetes by streptozotocin in rats. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 22 (2), 60-64 (2007).
  11. Weiss, R. B. Streptozocin: a review of its pharmacology, efficacy, and toxicity. Cancer Treatment Reports. 66 (3), 427-438 (1982).
  12. Karunanayake, E. H., Hearse, D. J., Mellows, G. The metabolic fate and elimination of streptozotocin. Biochemical Society Transactions. 3 (3), 410-414 (1975).
  13. Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. , McGraw-Hill, Blakiston Division. New York. (1968).
  14. Okunlola, A., et al. Histological studies on the retina and cerebellum of Wistar rats treated with Arteether. Journal of Morphological Sciences. 31 (01), 028-032 (2014).
  15. Wallow, I., Engerman, R. Permeability and patency of retinal blood vessels in experimental diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 16 (5), 447-461 (1977).
  16. do Cartmo, A., Ramos, P., Reis, A., Proença, R., Cunha-Vaz, J. Breakdown of the inner and outer blood retinal barrier in streptozotocin-induced diabetes. Experimental Eye Research. 67 (5), 569-575 (1998).
  17. Shires, T., Faeth, J., Pulido, J. Protein levels in the vitreous of rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Brain Research Bulletin. 30 (1-2), 85-90 (1993).
  18. D'amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. H. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
  19. Gupta, D. Fluorescein angiography refresher course: Here's how to interpret the findings of this useful diagnostic tool. Review of Optometry. 138 (11), 60-65 (2001).
  20. Edelman, J. L., Castro, M. R. Quantitative image analysis of laser-induced choroidal neovascularization in rat. Experimental Eye Research. 71 (5), 523-533 (2000).
  21. Formaldehyde, 2-Butoxyethanol and 1-tert-Butoxypropan-2-ol. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. , Available from: http://monographs.iarc.fr/ENG/Monographs/vol88/index.php (2009).
  22. Szabó, K., et al. Histological evaluation of diabetic neurodegeneration in the retina of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats. Scientific Reports. 7 (1), 1-17 (2017).
  23. Margo, C. E., Lee, A. Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 233 (6), 366-370 (1995).
  24. Tokuda, K., et al. Optimization of fixative solution for retinal morphology: a comparison with Davidson's fixative and other fixation solutions. Japanese Journal of Ophthalmology. 62 (4), 481-490 (2018).
  25. Luna, L. G. Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. Third edition. , Blakiston Division, McGraw-Hill. McGraw-Hill, New York. (1968).
  26. Skeie, J. M., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Evisceration of mouse vitreous and retina for proteomic analyses. Journal of Visualized Experiments. (50), e2795(2011).
  27. D'Amato, R., Wesolowski, E., Smith, L. E. Microscopic visualization of the retina by angiography with high-molecular-weight fluorescein-labeled dextrans in the mouse. Microvascular Research. 46 (2), 135-142 (1993).
  28. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye (Lond). 5, Pt 4 440-446 (1991).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Diabetic RetinopathyRetinal PathophysiologyRat ModelBlood Retinal BarrierRetinal HistologyFluorescence AngiographyRetinal Cell CountRetinal Flat MountProtein Leakage AssayRetinal Angiogenesis

Related Articles