Deze studie rapporteert een nieuwe benadering om meerdere mitochondriale functionele parameters te meten op basis van flowcytometrie en dubbele kleuring met twee fluorescerende melders of antilichamen om veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal, reactief zuurstofsoortniveau, mitochondriale ademhalingsketensamenstelling en mitochondriaal DNA te detecteren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mitochondriën zijn belangrijk in de pathofysiologie van veel neurodegeneratieve ziekten. Veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal (MMP), mitochondriale productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en mitochondriaal DNA (mtDNA) kopienummer zijn vaak kenmerken van deze processen. Dit rapport beschrijft een nieuwe op flowcytometrie gebaseerde benadering om meerdere mitochondriale parameters in verschillende celtypen te meten, waaronder door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en van iPSC afgeleide neurale en gliacellen. Deze op stroom gebaseerde strategie maakt gebruik van levende cellen om mitochondriaal volume, MMP- en ROS-niveaus te meten, evenals vaste cellen om componenten van de mitochondriale ademhalingsketen (MRC) en mtDNA-geassocieerde eiwitten zoals mitochondriale transcriptiefactor A (TFAM) te schatten.
Door co-kleuring met fluorescerende verslaggevers, waaronder MitoTracker Green (MTG), tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) en MitoSox Red, kunnen veranderingen in mitochondriaal volume, MMP en mitochondriale ROS worden gekwantificeerd en gerelateerd aan mitochondriaal gehalte. Dubbele kleuring met antilichamen tegen MRC-complexe subeenheden en translocase van buitenste mitochondriaal membraan 20 (TOMM20) maakt de beoordeling van MRC-subeenheidexpressie mogelijk. Omdat de hoeveelheid TFAM evenredig is met het mtDNA-kopienummer, geeft de meting van TFAM per TOMM20 een indirecte meting van mtDNA per mitochondriaal volume. Het gehele protocol kan binnen 2-3 uur worden uitgevoerd. Belangrijk is dat deze protocollen de meting van mitochondriale parameters mogelijk maken, zowel op het totale niveau als op het specifieke niveau per mitochondriaal volume, met behulp van flowcytometrie.
Inleiding
Mitochondriën zijn essentiële organellen die in bijna alle eukaryote cellen aanwezig zijn. Mitochondriën zijn verantwoordelijk voor de energievoorziening door adenosinetrifosfaat (ATP) te produceren via oxidatieve fosforylering en fungeren als metabole intermediairs voor biosynthese en metabolisme. Mitochondriën zijn nauw betrokken bij vele andere belangrijke cellulaire processen, zoals ROS-generatie, celdood en intracellulaire Ca2 + -regulatie. Mitochondriale disfunctie is in verband gebracht met verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Huntington (HD), Friedreich's ataxie....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Zie de tabel met materialen en de aanvullende tabel S1 voor recepten van alle media en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
1. Differentiatie van menselijke iPSC's in NCS'en, dopaminerge (DA) neuronen en astrocyten
- Bereid matrix-gecoate platen voor.
- Ontdooi een flacon met 5 ml matrix op ijs een nacht. Verdun 1 ml matrix met 99 ml koude Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (Advanced DMEM/F12) (1% eindconcentratie). Maak 1 ml aliquots en bewaar ze bij -20 °C.
- Ontdooi de matrixoplossing bij 4 °C (houd het koud) en bestrijk 6 pu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een schematische beschrijving van de differentiatiemethode en flowcytometrische strategieën is weergegeven in figuur 3. Menselijke iPSC's worden gedifferentieerd in neurale rozetten en vervolgens opgetild in suspensiecultuur voor differentiatie in neurale sferen. Neurale bollen worden verder gedifferentieerd en gerijpt tot DA-neuronen. Neurale bollen worden gedissocieerd in afzonderlijke cellen om glia-astrocyten te genereren, opnieuw geplateerd in monolagen als NSC's en vervolgens gediffere.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hierin zijn protocollen voor het genereren van iPSC-afgeleide neuronen en astrocyten en het evalueren van meerdere aspecten van mitochondriale functie met behulp van flowcytometrie. Deze protocollen maken een efficiënte omzetting van menselijke iPSC's in zowel neuronen als glia-astrocyten mogelijk en de gedetailleerde karakterisering van mitochondriale functie, meestal in levende cellen. De protocollen bieden ook een co-staining flowcytometrie-gebaseerde strategie voor het verwerven en analyseren van meerdere mitochondri.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken het Molecular Imaging Centre en de Flow Cytometry Core Facility aan de Universiteit van Bergen in Noorwegen. Dit werk werd ondersteund door financiering van de Norwegian Research Council (Grant number: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat en de China Scholarship Council (projectnummer: 201906220275).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857, RRID:AB_445175 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-SSEA4 | Abcam | ab16287, RRID:AB_778073 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Sox2 | Abcam | ab97959, RRID:AB_2341193 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Pax6 | Abcam | ab5790, RRID:AB_305110 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Nestin | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927, RRID:AB_627994 | Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-GFAP | Abcam | ab4674, RRID:AB_304558 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-S100β conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab196442, RRID:AB_2722596 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; |
| anti-TH | Abcam | ab75875, RRID:AB_1310786 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Tuj 1 | Abcam | ab78078, RRID:AB_2256751 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Synaptophysin | Abcam | ab32127, RRID:AB_2286949 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-PSD-95 | Abcam | ab2723, RRID:AB_303248 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab198308 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-NDUFB10 | Abcam | ab196019 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-SDHA | Abcam | ab137040 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-COX IV | Abcam | ab14744, RRID:AB_301443 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control. |
| Activin A | PeproTech | 120-14E | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| ABM Basal Medium | Lonza | CC-3187 | Basal medium for astrocyte culture |
| AGM SingleQuots Supplement Pack | Lonza | CC-4123 | Supplement for astrocyte culture |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | CDM ingredient |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Basal medium for dilute Geltrex |
| Bovine Serum Albumin | Europa Bioproducts | EQBAH62-1000 | Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | DA neurons medium ingredient |
Referenties
- Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
- Chen, A., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
