Methodenartikel

Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten

DOI:

10.3791/63116

⸱

8 november 2021

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Neuro-SysMed, Center of Excellence for Clinical Research in Neurological Diseases, Haukeland University Hospital, 3Department of Neurosurgery, Qilu Hospital and Institute of Brain and Brain-Inspired Science, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 4Shandong Key Laboratory of Brain Function Remodeling

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie rapporteert een nieuwe benadering om meerdere mitochondriale functionele parameters te meten op basis van flowcytometrie en dubbele kleuring met twee fluorescerende melders of antilichamen om veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal, reactief zuurstofsoortniveau, mitochondriale ademhalingsketensamenstelling en mitochondriaal DNA te detecteren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën zijn belangrijk in de pathofysiologie van veel neurodegeneratieve ziekten. Veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal (MMP), mitochondriale productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en mitochondriaal DNA (mtDNA) kopienummer zijn vaak kenmerken van deze processen. Dit rapport beschrijft een nieuwe op flowcytometrie gebaseerde benadering om meerdere mitochondriale parameters in verschillende celtypen te meten, waaronder door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) en van iPSC afgeleide neurale en gliacellen. Deze op stroom gebaseerde strategie maakt gebruik van levende cellen om mitochondriaal volume, MMP- en ROS-niveaus te meten, evenals vaste cellen om componenten van de mitochondriale ademhalingsketen (MRC) en mtDNA-geassocieerde eiwitten zoals mitochondriale transcriptiefactor A (TFAM) te schatten.

Door co-kleuring met fluorescerende verslaggevers, waaronder MitoTracker Green (MTG), tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) en MitoSox Red, kunnen veranderingen in mitochondriaal volume, MMP en mitochondriale ROS worden gekwantificeerd en gerelateerd aan mitochondriaal gehalte. Dubbele kleuring met antilichamen tegen MRC-complexe subeenheden en translocase van buitenste mitochondriaal membraan 20 (TOMM20) maakt de beoordeling van MRC-subeenheidexpressie mogelijk. Omdat de hoeveelheid TFAM evenredig is met het mtDNA-kopienummer, geeft de meting van TFAM per TOMM20 een indirecte meting van mtDNA per mitochondriaal volume. Het gehele protocol kan binnen 2-3 uur worden uitgevoerd. Belangrijk is dat deze protocollen de meting van mitochondriale parameters mogelijk maken, zowel op het totale niveau als op het specifieke niveau per mitochondriaal volume, met behulp van flowcytometrie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën zijn essentiële organellen die in bijna alle eukaryote cellen aanwezig zijn. Mitochondriën zijn verantwoordelijk voor de energievoorziening door adenosinetrifosfaat (ATP) te produceren via oxidatieve fosforylering en fungeren als metabole intermediairs voor biosynthese en metabolisme. Mitochondriën zijn nauw betrokken bij vele andere belangrijke cellulaire processen, zoals ROS-generatie, celdood en intracellulaire Ca2 + -regulatie. Mitochondriale disfunctie is in verband gebracht met verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Huntington (HD), Friedreich's ataxie (FRDA) en amyotrofische laterale sclerose (ALS)1. Verhoogde mitochondriale disfunctie en mtDNA-afwijking worden ook verondersteld bij te dragen aan de veroudering van de mens 2,3.

Verschillende soorten mitochondriale disfunctie komen voor bij neurodegeneratieve ziekten, en veranderingen in mitochondriaal volume, MMP-depolarisatie, productie van ROS en veranderingen in mtDNA-kopienummer komen vaak voor 4,5,6,7. Daarom is het vermogen om deze en andere mitochondriale functies te meten van groot belang bij het bestuderen van ziektemechanismen en het testen van potentiële therapeutische middelen. Bovendien, gezien het gebrek aan diermodellen die menselijke neurodegeneratieve ziekten getrouw repliceren, is het opzetten van geschikte in vitro modelsystemen die de menselijke ziekte in hersencellen samenvatten een belangrijke stap in de richting van een beter begrip van deze ziekten en de ontwikkeling van nieuwe therapieën 2,3,8,9.

Menselijke iPSC's kunnen worden gebruikt om verschillende hersencellen te genereren, waaronder neuronale en niet-neuronale cellen (d.w.z. gliacellen), en mitochondriale schade geassocieerd met neurodegeneratieve ziekte is gevonden in beide celtypen 3,10,11,12,13. Geschikte methoden voor iPSC-differentiatie in neurale en gliale afstammingslijnen zijn beschikbaar 14,15,16. Deze cellen bieden een uniek platform voor mens/patiënt voor in vitro ziektemodellering en geneesmiddelenscreening. Verder, omdat deze zijn afgeleid van patiënten, bieden iPSC-afgeleide neuronen en gliacellen ziektemodellen die nauwkeuriger weergeven wat er bij mensen gebeurt.

Tot op heden zijn er weinig handige en betrouwbare methoden beschikbaar voor het meten van meerdere mitochondriale functionele parameters in iPSC's, met name levende neuronen en gliacellen. Het gebruik van flowcytometrie biedt de wetenschapper een krachtig hulpmiddel voor het meten van biologische parameters, waaronder mitochondriale functie, in afzonderlijke cellen. Dit protocol biedt details voor het genereren van verschillende soorten hersencellen, waaronder neurale stamcellen (NSC's), neuronen en glia-astrocyten van iPSC's, evenals nieuwe op flowcytometrie gebaseerde benaderingen om meerdere mitochondriale parameters in verschillende celtypen te meten, waaronder iPSC's en iPSC-afgeleide neurale en gliacellen. Het protocol biedt ook een co-kleuringsstrategie voor het gebruik van flowcytometrie om mitochondriaal volume, MMP, mitochondriaal ROS-niveau, MRC-complexen en TFAM te meten. Door metingen van mitochondriaal volume of massa op te nemen, maken deze protocollen ook de meting van zowel het totale niveau als het specifieke niveau per mitochondriale eenheid mogelijk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Zie de tabel met materialen en de aanvullende tabel S1 voor recepten van alle media en oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.

1. Differentiatie van menselijke iPSC's in NCS'en, dopaminerge (DA) neuronen en astrocyten

  1. Bereid matrix-gecoate platen voor.
    1. Ontdooi een flacon met 5 ml matrix op ijs een nacht. Verdun 1 ml matrix met 99 ml koude Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (Advanced DMEM/F12) (1% eindconcentratie). Maak 1 ml aliquots en bewaar ze bij -20 °C.
    2. Ontdooi de matrixoplossing bij 4 °C (houd het koud) en bestrijk 6 putten (1 ml per putje in een 6-wells plaat).
    3. Plaats de matrixgecoate plaat in een bevochtigde 5% CO2/95% luchtincubator bij 37 °C gedurende 1 uur. Haal het bord uit de incubator en laat het in evenwicht brengen tot kamertemperatuur (RT).
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de plaat binnen 3 dagen na het coaten te gebruiken. De gecoate plaat kan echter tot 2 weken bij 4 °C worden bewaard. Vergeet niet om het eruit te halen en het voor gebruik op te warmen tot RT. Voeg voor langdurige opslag 1 ml iPSC-kweekmedium toe aan de gecoate plaat om uitdroging van de matrix te voorkomen.
  2. IPSC's ontdooien
    1. Verwarm de met matrix beklede platen gedurende 20-30 minuten voor op RT of in de incubator bij 37 °C. Prewarm de benodigde hoeveelheid iPSC-kweekmedium bij RT.
    2. Meng 6 ml voorgewarmd iPSC-kweekmedium met 12 μL Y-27632 ROCK-remmer om een eindconcentratie van 10 μM te verkrijgen.
    3. Ontdooi de bevroren injectieflacon met iPSC's bij 37 °C gedeeltelijk in een waterbad totdat er een klein stukje ijs overblijft.
    4. Voeg langzaam 1 ml voorgewarmd iPSC-kweekmedium met 12 μL ROCK-remmer druppelsgewijs toe aan de cellen. Breng de vloeistofinhoud van de injectieflacon met iPSC's druppelsgewijs over in één putje van een 6-well voorgecoate plaat met behulp van een pipet van 5 ml.
    5. Verplaats de plaat in loodrechte richtingen om de putinhoud te mengen en breng de plaat terug naar de incubator. Vervang het iPSC-kweekmedium na 24 uur na het wassen met Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) (1x) (Ca2+/Mg2+-vrij) (4 ml per putje in een 6-well plaat).
      OPMERKING: Voeg geen ROCK-remmer toe aan volgende voedingen. Verander het iPSC-cultuurmedium dagelijks.
  3. Subculturatie van iPSC's
    1. Verwarm de met matrix beklede platen gedurende 20-30 minuten voor op RT of in de incubator bij 37 °C. Prewarm de benodigde hoeveelheid iPSC-kweekmedium bij RT.
    2. Aspirateer het kweekmedium uit de platen die de cellen bevatten. Spoel de iPSC's af met DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-vrij) (4 ml per putje in een 6-wells plaat).
    3. Voeg EDTA (0,5 mM) (1 ml per put toe in een 6-well plaat). Incubeer de platen bij 37 °C totdat de randen van de kolonies uit de put beginnen op te tillen (meestal 3-5 min). Aspirateer de EDTA.
    4. Voeg voorgewarmd iPSC-kweekmedium toe (4 ml per put in een 6-wellsplaat) en maak de iPSC-kolonies eenmaal krachtig los met een steriele pipet van 10 ml. Pipetteer niet op en neer, omdat dit celklonters in afzonderlijke cellen kan breken.
    5. Breng de inhoud van elke put over in twee afzonderlijke putten in een matrixgecoate 6-well plaat (2 ml per put in een 6-well plaat) en incubeer bij 37 °C. Genereer geen bubbels in de suspensie tijdens het pipetteren.
      OPMERKING: Schud de plaat voorzichtig voordat u deze in de couveuse bewaart. De split ratio kan 1:2 zijn (één put in 2 nieuwe putten) tot 1:4 (één put in 4 nieuwe putten).
    6. Vervang het medium dagelijks totdat de kolonies 60% samenvloeiing bereiken met een goede grootte en verbindingen.
  4. Neurale inductie en neurale voorlopergeneratie
    1. Bereid 500 ml chemisch gedefinieerd medium (CDM), 500 ml neuraal inductiemedium (NIM) en 500 ml neuraal stamcelserumvrij (NSC SF) medium voor.
    2. Spoel de cellen af met DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-vrij) (4 ml per putje in een 6-well plaat) en voeg NIM (3 ml per put toe in een 6-well plaat). Ingesteld als Dag 0.
    3. Vervang de NIM (3 ml per put in een 6-well plaat) op dag 1, dag 3 en dag 4 en observeer dagelijks onder de microscopie.
    4. Maak op dag 5 de neurale rozetten los in suspensiecultuur zoals hieronder beschreven.
      1. Was eens voorzichtig met DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-vrij) (4 ml per putje in een 6-well plaat). Voeg collagenase IV toe (1 ml per putje in een 6-wellsplaat) en bewaar 1 min in een couveuse. Aspirateer het collagenase IV en was het eenmaal met DPBS (1x) (4 ml per putje in een 6-wells plaat) voorzichtig.
      2. Voeg 2 ml NSC SF Medium per put toe aan een 6-well plaat. Maak de cellen los door de bodems van de putten te schrapen door roosters te tekenen met behulp van een pipetpunt van 200 μL.
      3. Verzamel de celsuspensie van de 6-well plaat in een 10 cm niet-hechtende schaal. Vul het volume aan tot 12 ml met NSC SF Medium.
      4. Schud de niet-aanhangende schotel bij 65-85 tpm op een orbitale shaker in een incubator om aggregatie te voorkomen.
  5. DA neuron differentiatie
    1. Voeg op dag 7 12 ml CDM toe, aangevuld met 100 ng / ml fibroblastgroeifactor-8b (FGF-8b) en plaats de schotel op de orbitale shaker in de incubator.
    2. Op dag 8-13, verander het medium om de 2 dagen en observeer dagelijks onder de microscopie.
    3. Voeg op dag 14 12 ml CDM toe, aangevuld met 100 ng / ml FGF-8b en 1 μM purmorphamine (PM). Plaats de schaal op de orbitale shaker in de incubator.
    4. Op dag 15-20 verwisselt u het medium om de 2 dagen en observeert u de cellen dagelijks onder de microscopie.
    5. Laat de bollen mechanisch passeren door 1000 μL tips te gebruiken om de grotere bollen op te breken.
      OPMERKING: De verhouding kan 1:2 zijn (één gerecht in 2 nieuwe gerechten).
  6. Beëindiging van de differentiatie
    1. Bekleed een 6-wells plaat of coverslips met Poly-L-Ornithine (PLO) en laminine zoals hieronder beschreven.
      1. Bestrijk een 6-wells plaat met 1 ml PLO per put en incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 20 min. Aspirateer de PLO-oplossing.
      2. Steriliseer de plaat onder UV gedurende 20 min. Spoel de putjes twee keer af met DPBS (1x) (4 ml per putje in een 6-wells plaat).
      3. Voeg 5 μg/ml laminineoplossing (1 ml per putje in een 6-wellsplaat) toe aan de put en incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur. Aspirateer het laminine en was de putjes kort met DPBS (1x) (4 ml per putje in een 6-well plaat) eenmaal voor het plateren.
    2. Verzamel alle bollen (vanaf stap 1.5.5) in buizen van 50 ml en vul bij met DPBS (1x). Draai op 300 × g gedurende 5 min. Aspirateer het supernatant.
    3. Incubeer met 2 ml celdissociatiereagens (zie de tabel met materialen) gedurende 10 minuten bij 37 °C in een waterbad, gevolgd door zachte trituratie met een pipet van 200 μL (20-50 keer afhankelijk van de grootte van de bollen, waardoor bellenvorming wordt vermeden).
    4. Neutraliseer het celdissociatiereagens met 2 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en centrifugeer de conische buis van 50 ml met de cellen op 300 × g gedurende 5 minuten bij RT. Aspirateer het supernatant.
    5. Voeg 1 ml CDM toe, aangevuld met 10 ng / ml Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) en 10 ng / ml Gliacellijn-afgeleide neurotrofe factor (GDNF) om de celpellets te resuspenderen door voorzichtig op en neer te pipetteren om eencellige suspensies te verkrijgen.
    6. Aspirateer de laminineoplossing uit de plaat (stap 1.6.1.3), was kort met DPBS (1x) (4 ml per put in een 6-well plaat) en zaai de cellen (vanaf stap 1.6.5) in de voorgecoate platen of coverslips in 3 ml CDM aangevuld met 10 ng/ml BDNF en 10 ng/ml GDNF. Voer de cellen om de 4 dagen.
      OPMERKING: Differentiërende culturen kunnen gedurende vele weken tot 3 maanden worden gehandhaafd. De neurale morfologie verschijnt meestal na 2 weken van beëindiging en kan vanaf dat moment worden gebruikt voor downstream-analyses. BDNF en GDNF zijn niet nodig voor het kweken voor langer onderhoud (tot 2 maanden).
  7. NSC generatie
    1. Laag matrixplaten.
    2. Verzamel alle neurale bollen (gegenereerd vanaf stap 1.4) in buizen van 50 ml en vul bij met DPBS (1x) (Ca2 +/ Mg2 +-vrij). Draai op 300 × g gedurende 5 min. Aspirateer de supernatanten.
    3. Incubeer de pellets met 2 ml celdissociatiereagens gedurende 10 minuten bij 37 °C in een waterbad, gevolgd door zachte trituratie met een pipet van 200 μL (20-50 keer afhankelijk van de grootte van de bollen, waardoor bellenvorming wordt vermeden).
    4. Neutraliseer met 2 ml DMEM met 10% FBS en centrifugeer de 50 ml conische buizen met de cellen op 300 × g gedurende 5 minuten bij RT. Aspirateer de supernatanten. Resuspendeer de celpellets door voorzichtig op en neer te pipetteren om eencellige suspensies te verkrijgen.
    5. Aspirateer de matrixoplossing uit een voorgecoate plaat en zaai de cellen in de voorgecoate platen in NSC SF Medium (3 ml per put in een 6-well plaat). Voed de cellen om de 2-3 dagen en splits de cellen wanneer ze samenvloeien.
      OPMERKING: Vanaf deze fase kunnen NSC's worden uitgebreid en bevroren.
  8. Glia astrocyten differentiatie
    1. Astrocyten differentiatie van NSC's
      1. Bereid 500 ml astrocytendifferentiatiemedium voor.
      2. Zaad NSC's op Poly-D-Lysine (PDL)-gecoate platen/coverslips met NSC SF Medium.
      3. Spoel de volgende dag de cellen af met DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-vrij) (4 ml per putje in een 6-well plaat) en voeg Astrocyte Differentiation Medium (3 ml per put toe in een 6-well plaat). Ingesteld als Dag 0.
      4. Observeer de NSC's dagelijks onder de microscoop en vervang het Astrocyte Differentiation Medium (3 ml per put in een 6-well plaat) elke 2 dagen van dag 1 tot 27.
    2. Astrocytenrijping
      1. Bereid Astrocyten Maturation Medium voor.
      2. Spoel op dag 28 de cellen af met DPBS (1x) (4 ml per put in een 6-putplaat) en voeg Astrocyte Maturation Medium (3 ml per put toe in een 6-well plaat).
      3. Observeer op dag 29 en later dagelijks de cellen onder de microscoop en vervang het Astrocyte Maturation Medium (3 ml per put in een 6-well plaat) om de 2 dagen.
      4. Na een maand rijping, breid de cellen uit en cryoprereserveer ze vanaf dit stadium.
        OPMERKING: Tijdens deze fase zal het aantal cellen toenemen. Bij het splitsen van de cellen zijn PDL-gecoate coverslips niet nodig voor het kweken.

2. Celkarakterisering door immunocytochemie en immunofluorescentiekleuring

  1. Breng aan het einde van de kweekperiode de coverslips met de cellen over naar een 12-wells plaat.
    Spoel de cellen twee keer af met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (1x) en incubeer gedurende 10 minuten in 4% paraformaldehyde (PFA) (0,5 ml per put in een 12-well plaat) op RT.
    OPMERKING: Het vaste monster kan worden bedekt met 2 ml PBS (1x) en worden bewaard bij 4 °C totdat het nodig is voor immunostaining. PFA is giftig en wordt verdacht van het veroorzaken van kanker. Voorkom blootstelling van de huid en de ogen en werk onder een chemische zuurkast.
  2. Blok en permeabiliseer de cellen en incubeer met blokkerende buffer met PBS (1x), 0,3% Triton X-100 en 10% normaal geitenserum gedurende 1 uur bij RT.
  3. Incubeer met primaire antilichamen in blokkerende buffer 's nachts bij 4 °C: vlek-iPSC's met anti-octameerbindende transcriptiefactor 4 (oct4) en anti-stadiumspecifiek embryonaal antigeen-4 (SSEA4), NSC's met anti-geslachtsbepalend gebied Y box-2 (Sox2) en anti-Nestin, neurale bollen met anti-paired box-6 (Pax6) en anti-Nestin, astrocyten met anti-glial fibrillair zuur eiwit (GFAP) en anti-S100 calciumbindend eiwit β (S100β), en DA-neuronen met anti-tyrosinehydroxylase (TH), anti-β III Tubulin (Tuj 1), anti-Synaptophysin en anti-PSD-95 (0,5 ml primaire antilichaamoplossing per put in een 12-well plaat; zie de Tabel met materialen voor details).
  4. Was de monsters met PBS (1x) drie keer gedurende 10 minuten elk met zacht schommelen.
  5. Incubeer met secundaire antilichaamoplossing (1:800 in blokkerende buffer, 0,5 ml Alexa Fluor secundaire antilichaamoplossing per put in een 12-well plaat) gedurende 1 uur bij RT met zacht schommelen.
  6. Incubeer de cellen met Hoechst 33342 (1:5.000, 0,5 ml per put in een 12-well plaat) in PBS (1x) gedurende 15 minuten bij RT om de kernen te labelen.
  7. Monteer de cellen met montagemedium en droog 's nachts bij RT voor beeldvorming onder een fluorescentiemicroscoop in het donker. Zie aanvullende figuur S1 voor de microscoopinstellingen en parameters.

3. Flowcytometriemeting van mitochondriaal volume, MMP en mitochondriale ROS in levende cellen

  1. Zaai de cellen afzonderlijk in 4 putten in een 6-wells plaat totdat de cellen 50% -60% samenvloeiing bereiken. Label deze vier putten als # 1, # 2, # 3 en # 4.
  2. Bereid aan het einde van de kweekperiode 5 individuele kleuringsoplossingen (500 μL per put in een 6-wellsplaat) als volgt: # 1 alleen kweekmedium (tot goed # 1 met alleen cellen voor controle); #2-1 met FCCP (100 μM); #2-2 met FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) in kweekmedium; #3 met TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) in kweekmedium; #4 met MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) in PBS (1x) met 10% FBS. Zie figuur 1A, aanvullende tabel S2 en de tabel met materialen voor details over deze verbindingen en flowcytometrie-instellingen.
    OPMERKING: Gebruik het kweekmedium om de kleuringsoplossing te bereiden. Warm het medium en PBS (1x) op RT op voor gebruik. FCCP is giftig; voorkomen van huid- en oogblootstelling en werken onder een chemische zuurkast.
  3. Aspirateer het medium uit de #2 put en voeg #2-1 oplossing toe (alleen FCCP). Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 10 min.
  4. Aspirateer het medium van #2 en #3 putten en voeg #2-2 oplossing (FCCP + TMRE + MTG) toe in de #2 put en #3 oplossing (TMRE + MTG) in #3. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 45 min.
  5. Aspirateer het medium uit de #4 put en voeg #4 oplossing (MitoSox Red + MTG) toe. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 15 min.
  6. Aspirateer het medium uit alle putten. Wassen met PBS (1x) (4 ml per put in een 6-well plaat). Maak de cellen los met behulp van 1 ml celdissociatiereagens (1 ml per putje in een 6-wellsplaat) bij 37 °C gedurende 5 min. Neutraliseer het celdissociatiereagens in 1 ml DMEM met 10% FBS (2 ml per put in een 6-well plaat).
  7. Verzamel de inhoud van alle putten in conische buizen van 15 ml. Centrifugeer de buizen op 300 × g gedurende 5 min. Was de pellets een of twee keer met PBS (1x).
  8. Adem de supernatanten op, maar laat ongeveer 100 μL achter in de buizen. Resuspendeer de celpellets in 300 μL PBS (1x). Breng de cellen over naar 1,5 ml microcentrifugebuizen. Houd de buizen in het donker bij RT.
  9. Analyseer de cellen met behulp van een flowcytometer (met een 3 blauwe en 1 rode laserconfiguratie). Detecteer MTG in filter 1 (FL1) met een 530/30 bandpass filter, TMRE in filter 2 (FL2) met het bandpass filter 585/40 en MitoSox Red in filter 3 (FL3) met een 510/580 bandpass filter.

4. Flowcytometriemeting van MRC-complexe subeenheden en TFAM in vaste cellen

  1. Maak aan het einde van de kweekperiode de cellen los (~106) door het celdissociatiereagens toe te voegen; pelleteer vervolgens en verzamel de cellen in een buis van 15 ml. Was de cellen door centrifugatie met PBS (1x) tweemaal door centrifugeren op 300 × g gedurende 5 minuten.
  2. Fixeer de cellen in 1,6% PFA (1 ml van 1,6% PFA in een buis van 15 ml) op RT gedurende 10 minuten. Was de cellen door centrifugatie met PBS (1x) tweemaal door centrifugeren op 300 × g gedurende 5 minuten.
  3. Permeabiliseer de cellen met ijskoude 90% methanol (1 ml 90% methanol in een buis van 15 ml) bij -20 °C gedurende 20 minuten.
  4. Blokkeer de monsters in een blokkerende buffer met 0,3 M glycine, 5% geitenserum en 1% runderserumalbumine (BSA) - Fractie V in PBS (1x) (1 ml blokkerende buffer in een buis van 15 ml). Was de cellen tweemaal door centrifugatie met PBS (1x) (zoals in stap 3.7).
  5. Incubeer de cellen met de volgende primaire antilichamen gedurende 30 minuten: anti-NDUFB10 (1:1.000) voor meting van complexe I-subeenheid, anti-succinaatdehydrogenasecomplex flavoproteïnesubeenheid A (SDHA, 1:1.000) voor meting van complexe II-subeenheid en anti-COX IV (1:1.000) voor meting van complexe IV-subeenheid, en anti-TFAM-antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 488 (1:400). Kleur hetzelfde aantal cellen afzonderlijk met anti-TOMM20-antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 488 (1:400) gedurende 30 minuten (1 ml primaire antilichaamoplossing in een buis van 15 ml; zie de tabel met materialen voor details over de antilichamen).
  6. Was de cellen met PBS (1x) eenmaal met centrifugatie op 300 × g gedurende 5 min. Voeg secundair antilichaam (1:400) toe aan buizen van NDUFB10, SDHA en COX IV en incubeer de cellen met deze oplossingen gedurende 30 minuten.
  7. Was de cellen eenmaal met PBS (1x) door gedurende 5 minuten te centrifugeren op 300 × g . Zuig de supernatanten aan en laat ongeveer 100 μL achter in de buizen. Resuspendeer de celpellets in 300 μL PBS (1x). Breng de cellen over naar 1,5 ml microcentrifugebuizen die in het donker op ijs worden bewaard.
  8. Analyseer de cellen op de flowcytometer (met een 3 blauwe en 1 rode laserconfiguratie). Detecteer signalen in filter 1 (FL1) met behulp van een 530/30 bandpass filter. Zie aanvullende figuur S2 voor de microscoopinstellingen en parameters.

5. Verwerving en analyse van flowcytometrie

  1. Gebruik de niet-gekleurde controlebuis om het voorwaartse spreidingsgebied (FSC-A) en het zijverstrooiingsgebied (SSC-A) spreidingsdiagrammen in te stellen op basis van de grootte en complexiteit van de geanalyseerde celpopulatie. Zie aanvullende figuur S2 voor de microscoopinstellingen en parameters.
    OPMERKING: Stel niet-gekleurde besturingselementen in voor afzonderlijke celtypen.
  2. Gebruik de niet-vlekcontrolebuizen om de positieve poorten te selecteren en gebruik eenkleurige controlebuizen om te compenseren voor de spectrale overlapping van fluorescentie tussen MTG (fluorofoor-1 [FL-1]) en TMRE (FL-2) in meerkleurige flowcytometrie. Gebruik isotypecontrole voor negatieve controle om achtergrondkleuring in MRC- en TFAM-monsters te controleren. Gebruik de FCCP-buis als depolarisatiecontrole voor TMRE-kleuring.
  3. Sluit vreemd puin af om levende cellen en de hoofdgating van de voorwaartse en zijwaartse spreidingsplot te selecteren (figuur 2A). Sluit doubletten af met behulp van een voorwaartse strooihoogte (FSC-H) versus (vs.) FSC-A-dichtheidsdiagram om doubletten uit te sluiten en construeer ook een zijverstrooiingshoogte (SSC-H) versus SSC-A-plot (figuur 2A).
  4. Data-acquisitie (flowcytometer)
    1. Gebruik de niet-gekleurde of isotypemonsters als een negatieve controle en creëer een poort boven de hoofdpopulatie van de gebeurtenissen met één cel terwijl u SSC-A en de verschillende filters (FL1, FL2, FL3, FL4) bekijkt (figuur 1B en figuur 2B).
  5. Data-analyse (CFlow software)
    1. Kopieer de positie van de poorten op de gekleurde celmonsters en noteer de hoeveelheid positief gekleurde cellen voor de positieve kleuring.
    2. Selecteer voor elke celsubpopulatie een histogramplot en analyseer de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) van de verschillende filterkanalen (FL1, FL2, FL3, FL4) (x-as).
      1. Bereken de TMRE-niveaus door de MFI van FL2 van #2 fccp-behandelde cellen af te trekken van de MFI van FL2 van #3 TMRE-gekleurde monsters in een histogram, zoals in Eq (1) hieronder.
        TMRE-niveaus = MFI van FL2 uit #3 TMRE-gekleurde monsters - MFI van FL2 van #2 FCCP-behandelde cellen (1)
      2. Bereken de specifieke waarden voor MMP en mitochondriale ROS door MFI in TMRE of MitoSox Red, waarbij de mitochondriale volume-indicator MTG wordt gedeeld.
      3. Bereken de specifieke waarde voor complexe subeenheid en TFAM met behulp van MFI in complexe expressie of TFAM, waarbij de mitochondriale volume-indicator TOMM20 wordt gedeeld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een schematische beschrijving van de differentiatiemethode en flowcytometrische strategieën is weergegeven in figuur 3. Menselijke iPSC's worden gedifferentieerd in neurale rozetten en vervolgens opgetild in suspensiecultuur voor differentiatie in neurale sferen. Neurale bollen worden verder gedifferentieerd en gerijpt tot DA-neuronen. Neurale bollen worden gedissocieerd in afzonderlijke cellen om glia-astrocyten te genereren, opnieuw geplateerd in monolagen als NSC's en vervolgens gediffere...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hierin zijn protocollen voor het genereren van iPSC-afgeleide neuronen en astrocyten en het evalueren van meerdere aspecten van mitochondriale functie met behulp van flowcytometrie. Deze protocollen maken een efficiënte omzetting van menselijke iPSC's in zowel neuronen als glia-astrocyten mogelijk en de gedetailleerde karakterisering van mitochondriale functie, meestal in levende cellen. De protocollen bieden ook een co-staining flowcytometrie-gebaseerde strategie voor het verwerven en analyseren van meerdere mitochondri...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken het Molecular Imaging Centre en de Flow Cytometry Core Facility aan de Universiteit van Bergen in Noorwegen. Dit werk werd ondersteund door financiering van de Norwegian Research Council (Grant number: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat en de China Scholarship Council (projectnummer: 201906220275).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
anti-Oct4Abcamab19857, RRID:AB_445175Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4Abcamab16287, RRID:AB_778073Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2Abcamab97959, RRID:AB_2341193Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6Abcamab5790, RRID:AB_305110Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-NestinSanta Cruz Biotechnologysc-23927, RRID:AB_627994Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAPAbcamab4674, RRID:AB_304558Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488Abcamab196442, RRID:AB_2722596Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1Abcamab78078, RRID:AB_2256751Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-SynaptophysinAbcamab32127, RRID:AB_2286949Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95Abcamab2723, RRID:AB_303248Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488Abcamab198308Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-17764 RRID:AB_628381Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10Abcamab196019Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHAAbcamab137040Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IVAbcamab14744, RRID:AB_301443Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin APeproTech120-14EAstrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal MediumLonzaCC-3187Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement PackLonzaCC-4123Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific15240062CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634010Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum AlbuminEuropa BioproductsEQBAH62-1000Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNFPeproTech450-02DA neurons medium ingredient

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  2. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304(2021).
  3. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146(2020).
  4. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
  5. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  6. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583(2019).
  7. Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311(2019).
  8. Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
  9. Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449(2020).
  10. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337(2021).
  11. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  12. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17(2012).
  13. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
  15. Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400(2019).
  16. Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
  17. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536(2021).
  18. Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
  19. Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
  20. Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
  21. Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Flowcytometrieneurale derivatenmitochondriaal membraanpotentiaalreactieve zuurstofcomponentenmitochondriaal volumemitochondriaal DNA kopiegetalmitochondriale ademhalingsketen

Gerelateerde artikelen