Dit artikel beschrijft een gevestigde en reproduceerbare lectinevlekkentest voor de gehele retinale preparaten van mount en de protocollen die nodig zijn voor de kwantitatieve meting van vasculaire parameters die vaak worden gewijzigd in proliferatieve en niet-proliferatieve retinopathieën.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kwantificering van vasculaire parameters in whole mount retinas van muizen met niet-proliferatieve en proliferatieve retinopathieën
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Retinopathieën zijn een heterogene groep ziekten die het neurosensorische weefsel van het oog aantasten. Ze worden gekenmerkt door neurodegeneratie, gliose en een progressieve verandering in vasculaire functie en structuur. Hoewel het begin van de retinopathieën wordt gekenmerkt door subtiele verstoringen in de visuele waarneming, zijn de wijzigingen in de vasculaire plexus de eerste tekenen die door clinici worden gedetecteerd. De afwezigheid of aanwezigheid van neovascularisatie bepaalt of de retinopathie wordt geclassificeerd als niet-proliferatief (NPDR) of proliferatief (PDR). In die zin probeerden verschillende diermodellen specifieke vasculaire kenmerken van elke fase na te bootsen om de onderliggende mechanismen te bepalen die betrokken zijn bij endotheelveranderingen, neuronale dood en andere gebeurtenissen die plaatsvinden in het netvlies. In dit artikel zullen we een volledige beschrijving geven van de procedures die nodig zijn voor het meten van retinale vasculaire parameters bij volwassenen en vroeggeboorte muizen op postnatale dag (P) 17. We zullen de protocollen beschrijven om retinale vasculaire kleuring uit te voeren met Isolectine GSA-IB4 in hele mounts voor latere microscopische visualisatie. Belangrijke stappen voor beeldverwerking met Image J Fiji-software worden ook verstrekt, daarom kunnen de lezers de vaatdichtheid, diameter en tortuositeit, vasculaire vertakking, evenals avasculaire en neovasculaire gebieden meten. Deze hulpmiddelen zijn zeer nuttig om vasculaire veranderingen in zowel niet-proliferatieve als proliferatieve retinopathieën te evalueren en te kwantificeren.
Inleiding
De ogen worden gevoed door twee arterio-veneuze systemen: de choroïdale vasculatuur, een extern vasculair netwerk dat retinaal gepigmenteerd epitheel irrigeert en fotoreceptoren; en de neuro-retinale vasculatuur die de ganglioncellenlaag irrigeert en de binnenste nucleaire laag van het netvlies1. De retinale vasculatuur is een georganiseerd netwerk van bloedvaten die voedingsstoffen en zuurstof leveren aan de retinale cellen en afvalproducten oogsten om een goede visuele signaaltransductie te garanderen. Deze vasculatuur heeft een aantal onderscheidende kenmerken, waaronder: het ontbreken van autonome innervatie, de regulatie van de vasculaire ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
C57BL/6J-muizen werden behandeld volgens de richtlijnen van de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek. Experimentele procedures werden ontworpen en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (CICUAL) van de Faculteit chemische Wetenschappen, Nationale Universiteit van Córdoba (Res. HCD 1216/18).
1. Bereiding van bufferoplossingen en reagentia
- Bereiding van 1x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS): Voeg 8 g natriumchloride (NaCl), 0,2 g kaliumchloride (KCl), 14,4 g dinatrium-waterstof-fosfaatdihydraat (Na2HPO4 2H2O) en 0,24 g k....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Zoals beschreven in de protocolsectie, kunt u uit een enkele fluorescerende kleuringstest de vasculaire morfologie verkrijgen en verschillende parameters van belang kwantitatief evalueren. Het zoeken naar een specifieke verandering zal afhangen van het type retinopathie dat wordt bestudeerd. In dit artikel werden avasculaire en neovasculaire gebieden, tortuositeit en dilatatie geëvalueerd in een muismodel van proliferatieve retinopathie, terwijl de vasculaire vertakking en dichtheid werden geanalyseerd in een MetS-muismo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Diermodellen van retinopathieën zijn krachtige hulpmiddelen voor het bestuderen van vasculaire ontwikkeling, remodellering of pathologische angiogenese. Het succes van deze studies in het veld is afhankelijk van de gemakkelijke toegang tot het weefsel dat het mogelijk maakt om een breed scala aan technieken uit te voeren, waarbij gegevens van in vivo en postmortale muizen worden verstrekt26,27. Bovendien is er een grote correlatie gevonden tusse.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Dankbetuigingen
We danken Carlos Mas, María Pilar Crespo en Cecilia Sampedro van CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentinië) voor hulp bij confocale microscopie, aan Soledad Miró en Victoria Blanco voor toegewijde dierenverzorging en Laura Gatica voor histologische hulp. We danken ook Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication van FCQ) voor de videoproductie en -editie en Paul Hobson voor zijn kritische lezing en taalrevisie van het manuscript.
Dit artikel werd gefinancierd door subsidies van Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para l....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Aluminuim folie | |||
| Bovine Serum Albumine | Merck | A4503 | kwaliteit |
| Calciumchloride dihydraat | Merck | C3306 | |
| Zoutzuur | Biopack | 9632.08 | |
| Confocal Microscoop FV1200 | Olympus | FV1200 | met gemotoriseerde plaat |
| Dekvlakken | Paul Marienfeld GmnH & Co. | 111520 | |
| Dissectiemicroscoop | NIKON | SMZ645 | |
| Dinatriumwaterstoffosfaat dihydraat | Merck | 119753 | |
| 200 µL buis | Merck | Z316121 | |
| Filterpapier | Merck | WHA5201090 | |
| Incubator shaker GyroMini | LabNet International | S0500 | |
| Isolectin GS-IB4 Van Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugaat | Invitrogen | I21411 | |
| Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88) | Merck | 475904 | |
| Paraformaldehyde | Merck | 158127 | |
| pH-meter | SANXIN | PHS-3D-03 | |
| Kaliumchloride | Merck | P9541 | |
| Kaliumdiwaterstoffosfaat | Merck | 1,04,873 | |
| Glijbanen | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Natriumchloride | Merck | S3014 | |
| Natriumhydroxide | Merck | S5881 | |
| Tris | Merck | GE17-1321-01 | |
| Triton X-100 | Merck | X100-1GA | |
| Vessel Analysis Fiji software | Mai Elfarnawany | https://imagej.net/Vessel_Analysis |
Referenties
- Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
- McDougal, D. H., Gamlin, P. D.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
