Methodenartikel

Kwantificering van vasculaire parameters in whole mount retinas van muizen met niet-proliferatieve en proliferatieve retinopathieën

3.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63126

⸱

12 maart 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Nacional de Córdoba, 2Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Vitreo-retinal Department, Centro Privado de Ojos Romagosa-Fundación VER, 4Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica (UNITEFA), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een gevestigde en reproduceerbare lectinevlekkentest voor de gehele retinale preparaten van mount en de protocollen die nodig zijn voor de kwantitatieve meting van vasculaire parameters die vaak worden gewijzigd in proliferatieve en niet-proliferatieve retinopathieën.

Samenvatting

Retinopathieën zijn een heterogene groep ziekten die het neurosensorische weefsel van het oog aantasten. Ze worden gekenmerkt door neurodegeneratie, gliose en een progressieve verandering in vasculaire functie en structuur. Hoewel het begin van de retinopathieën wordt gekenmerkt door subtiele verstoringen in de visuele waarneming, zijn de wijzigingen in de vasculaire plexus de eerste tekenen die door clinici worden gedetecteerd. De afwezigheid of aanwezigheid van neovascularisatie bepaalt of de retinopathie wordt geclassificeerd als niet-proliferatief (NPDR) of proliferatief (PDR). In die zin probeerden verschillende diermodellen specifieke vasculaire kenmerken van elke fase na te bootsen om de onderliggende mechanismen te bepalen die betrokken zijn bij endotheelveranderingen, neuronale dood en andere gebeurtenissen die plaatsvinden in het netvlies. In dit artikel zullen we een volledige beschrijving geven van de procedures die nodig zijn voor het meten van retinale vasculaire parameters bij volwassenen en vroeggeboorte muizen op postnatale dag (P) 17. We zullen de protocollen beschrijven om retinale vasculaire kleuring uit te voeren met Isolectine GSA-IB4 in hele mounts voor latere microscopische visualisatie. Belangrijke stappen voor beeldverwerking met Image J Fiji-software worden ook verstrekt, daarom kunnen de lezers de vaatdichtheid, diameter en tortuositeit, vasculaire vertakking, evenals avasculaire en neovasculaire gebieden meten. Deze hulpmiddelen zijn zeer nuttig om vasculaire veranderingen in zowel niet-proliferatieve als proliferatieve retinopathieën te evalueren en te kwantificeren.

Inleiding

De ogen worden gevoed door twee arterio-veneuze systemen: de choroïdale vasculatuur, een extern vasculair netwerk dat retinaal gepigmenteerd epitheel irrigeert en fotoreceptoren; en de neuro-retinale vasculatuur die de ganglioncellenlaag irrigeert en de binnenste nucleaire laag van het netvlies1. De retinale vasculatuur is een georganiseerd netwerk van bloedvaten die voedingsstoffen en zuurstof leveren aan de retinale cellen en afvalproducten oogsten om een goede visuele signaaltransductie te garanderen. Deze vasculatuur heeft een aantal onderscheidende kenmerken, waaronder: het ontbreken van autonome innervatie, de regulatie van de vasculaire tonus door intrinsieke retinale mechanismen en het bezit van een complexe retinale bloedbarrière2. Daarom is retinale vasculatuur de focus geweest van veel onderzoekers die niet alleen vasculogenese tijdens de ontwikkeling uitgebreid hebben bestudeerd, maar ook de veranderingen en de pathologische angiogenese die deze bloedvaten ondergaan bij ziekten3. De meest voorkomende vasculaire veranderingen waargenomen bij retinopathieën zijn vaatdilatatie, neovascularisatie, verlies van vasculaire arborisatie en vervorming van de retinale hoofdvaten, waardoor ze meer ziggaggy worden4,5,6. Een of meer van de beschreven veranderingen zijn de vroegste tekenen die door clinici worden gedetecteerd. Vasculaire visualisatie biedt een snelle, niet-invasieve en goedkope screeningsmethode7. De uitgebreide studie van de waargenomen veranderingen in de vasculaire boom zal bepalen of de retinopathie niet-proliferatief of proliferatief is en de verdere behandeling. De niet-proliferatieve retinopathieën kunnen zich manifesteren met afwijkende vasculaire morfologie, verminderde vasculaire dichtheid, acellulaire haarvaten, pericytendood, macula-oedeem, onder anderen. Bovendien ontwikkelen proliferatieve retinopathieën ook een verhoogde vasculaire permeabiliteit, extracellulaire remodellering en de vorming van vasculaire plukjes naar de glasvochtholte die gemakkelijk afbreken of netvliesloslating veroorzaken8.

Eenmaal gedetecteerd, kan de retinopathie worden gecontroleerd door middel van zijn vasculaire veranderingen9,10. De progressie van de pathologie kan worden gevolgd door de structurele veranderingen van de bloedvaten, die duidelijk de stadia van de ziekte definiëren11. De kwantificering van vasculaire veranderingen in deze modellen maakte het mogelijk om vaatveranderingen en neuronale dood te correleren en farmacologische therapieën te testen voor patiënten in verschillende fasen van de ziekte.

In het licht van de bovenstaande verklaringen zijn wij van mening dat de herkenning en kwantificering van vasculaire veranderingen fundamenteel zijn in retinopathieënstudies. In dit werk zullen we laten zien hoe verschillende vasculaire parameters kunnen worden gemeten. Daarvoor gebruiken we twee diermodellen. Een daarvan is het zuurstofgeïnduceerde retinopathiemuismodel12, dat retinopathie van prematuriteit en sommige aspecten van proliferatieve diabetische retinopathie nabootst13,14. In dit model meten we avasculaire gebieden, neovasculaire gebieden en de dilatatie en tortuositeit van hoofdvaten. In ons laboratorium is een metabool syndroom (MetS) muismodel ontwikkeld, dat een niet-proliferatieve retinopathie induceert15. Hier zullen we de vasculaire dichtheid en vertakking evalueren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

C57BL/6J-muizen werden behandeld volgens de richtlijnen van de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visieonderzoek. Experimentele procedures werden ontworpen en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (CICUAL) van de Faculteit chemische Wetenschappen, Nationale Universiteit van Córdoba (Res. HCD 1216/18).

1. Bereiding van bufferoplossingen en reagentia

  1. Bereiding van 1x fosfaatbufferzoutoplossing (PBS): Voeg 8 g natriumchloride (NaCl), 0,2 g kaliumchloride (KCl), 14,4 g dinatrium-waterstof-fosfaatdihydraat (Na2HPO4 2H2O) en 0,24 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4) toe aan 800 ml gedestilleerd water. Roer de oplossing totdat de zouten volledig zijn opgelost. Stel de pH in op 7,4 met chloridezuur (HCl) en stel het volume in op 1 L met extra gedestilleerd water. Filtreer de oplossing en bewaar deze bij 4 °C.
  2. Bereiding van 4% paraformaldehyde (PFA): Voeg 40 g vaste PFA toe aan 800 ml vers bereid PBS. Roer de oplossing in een verwarmingsplaat bij een constante temperatuur van 60 °C. Voeg 1 M natriumhydroxide (NaOH) toe totdat PFA volledig is opgelost en controleer of de pH op een bereik van 7,2-7,4 wordt gehouden. Vul het volume aan tot 1.000 ml met PBS en meng. Schakel de verwarmingsplaat uit en filtreer de oplossing wanneer de temperatuur lager is dan 35 °C. Bewaar de oplossing bij 4 °C gedurende maximaal 3 dagen.
    LET OP: PFA is schadelijk bij inslikken of bij inademing en is waarschijnlijk een mutagene verbinding. Gebruik handschoenen en gezichtsmasker tijdens het hele proces en werk in een veiligheidscabine.
  3. Bereiding van 1x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS): Voeg 6,1 g Tris en 9 g NaCl toe aan 800 ml gedestilleerd water. Roer de oplossing totdat de zouten volledig zijn opgelost. Stel de pH in op 7,4 met HCl en stel het volume in op 1 L met extra gedestilleerd water. Filtreer de oplossing en bewaar deze bij 4 °C.
  4. Bereiding van TBS- 0,1% Triton X-100: Voeg 0,1 ml TritonX-100 toe aan 100 ml TBS. Meng voorzichtig en bewaar het bij 4 °C gedurende maximaal 1 week.
    OPMERKING: Omdat Triton een zeer dicht reinigingsmiddel is, snijdt u de terminal van de punt iets af voor een betere pipettering.
  5. Bereiding van TBS-5%-Bovine Serum Albumin (BSA) -0,1% Triton-X-100: Weeg 5 g BSA en voeg TBS- 0,1% triton X-100-oplossing toe tot een eindvolume van 100 ml. Roer voorzichtig. Aliquot en bewaren bij -20 °C gedurende maximaal 2 maanden.
  6. Isolectine GSA-IB4 Alexa fluor-488-conjugaat (Isolectine GSA-IB4): Gewicht 36,75 mg calciumchloridedihydraat (CaCl2·2H2O) en voeg het toe aan 500 ml vers bereid PBS. Roer de oplossing met een roerstaaf. Pipetteer 500 μL van de oplossing van CaCl2/PBS en voeg deze toe aan de injectieflacon met 500 μg gelyofiliseerd isolectine GSA-IB4 poeder. Meng voorzichtig en vul de oplossing in buizen van 0,5 ml. Bewaar ze bij -20 °C beschermd tegen licht.
  7. Poly(vinylalcohol) in glycerol/Tris: Weeg 2,4 g Poly(vinylalcohol), voeg 6 g g glycerol toe en roer voorzichtig. Voeg vervolgens 6 ml water toe en blijf enkele uren roeren bij kamertemperatuur. Voeg 12 ml voorverwarmde 0,2 M Tris-oplossing (pH: 8,5) toe en verwarm gedurende 10 minuten bij een constante temperatuur van 50 °C en meng af en toe. Centrifugeer ten slotte de oplossing bij 5.000 x g gedurende 15 minuten ter verduidelijking.
    OPMERKING: Laat de oplossing afkoelen bij kamertemperatuur, vul het op en bewaar het bij -20 °C.

2. Fluorescerende lectinekleuring

  1. Bij muizenoffer door inademing van koolstofdioxide (CO2), enucleatie de ogen met een schaar16. Fixeer de geëmailleerde ogen met vers bereide 4% PFA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
    OPMERKING: Fixatie kan ook worden uitgevoerd door de ogen 's nachts in 4% PFA (ON) bij 4 °C te incuberen. Muizen werden geofferd volgens de richtlijnen van de ARVO-verklaring voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en visionair onderzoek en de Institutional Animal Care and Use Committee (CICUAL) van de Faculteit chemische wetenschappen, Nationale Universiteit van Córdoba (Res. HCD 1216/18).
  2. Verwijder onder de ontleedmicroscoop de hoornvliezen met een schaar door langs de limbus te snijden en ontleed het hele netvlies. Gooi het voorste segment van het oog weg en scheid vervolgens het netvlies van het RPE-Choroid.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u het resterende vuil en de tongbeenderen met een tang uit het netvlies verwijdert.
  3. Plaats de netvliezen in buisjes van 200 μL. Blokkeer en permeabiliseer vervolgens de netvliezen in 100 μL Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 5% Bovine Serum Albumin (BSA) en 0,1% Triton-X-100 gedurende 6 uur bij 4 °C met zachte agitatie in de shaker.
    OPMERKING: Deze stap kan gedurende 2 uur bij RT worden uitgevoerd.
  4. Keer vervolgens de buis om om het netvlies in de dop te plaatsen en verwijder de blokkerende oplossing met een pipet.
  5. Voeg 100 μL van de oplossing toe die 0,01 μg/μL isolectine GSA-IB4 (GSA-IB4) bevat. Wikkel de buizen met aluminiumfolie om de monsters tegen licht te beschermen. Incubeer het netvlies met de lectineoplossing AAN bij 4 °C of gedurende 2 uur bij RT met zachte agitatie in de shaker.
  6. Was het netvlies met 100 μL TBS met 0,1% Triton-X-100 gedurende 20 minuten met zachte agitatie in de shaker. Voor een goede wasbeurt plaatst u het netvlies in de dop van de buis door deze om te keren. Breng de buis terug naar de staande positie en verwijder het medium dat in de container achterblijft. Herhaal deze stap drie keer.
  7. Plaats het netvlies in een dia en voeg een druppel PBS toe. Voer onder de ontleedmicroscoop vier even verre sneden uit van de randen van het netvlies naar de oogzenuw.
  8. Om de bloemblaadjes van het netvlies uit te vouwen, gebruikt u een tang of kleine stukjes filterpapier. Zorg ervoor dat de fotoreceptorzijde naar beneden is gericht.
  9. Verwijder de resterende PBS van de dia met filterpapier. Voeg vervolgens een montagemedium (Poly (vinylalcohol) in glycerol / Tris) en coverslip toe. Laat het 1 uur drogen bij RT.
  10. Bewaar dia's bij 4 °C beschermd tegen licht.
    OPMERKING: Netvliezen kunnen ook worden bewaard in PBS bij 4 °C tot confocale microscopievisualisatie.

3. Confocale microscopie visualisatie en microfotograaf acquisitie

  1. Voordat u de visualisatie maakt, incubeert u de dia's gedurende 10 minuten bij RT bedekt met licht.
  2. Plaats bij de confocale microscoop de dia in de plaat met de voorkant naar beneden.
  3. Focus de superieure plexus van de retinale vasculatuur en selecteer een gebied om de beeldverwerving te starten.
  4. Stel algemene laserparameters in de software in: Golflengte: 488 nm; Laser intensiteit; Hv; Verschuiving; Behalen.
    OPMERKING: Laserintensiteit, PMT, offset en versterking kunnen variëren afhankelijk van de omstandigheden en het gebruik van de lamp. De optimale instellingen geven een duidelijk beeld van de vaten, waardoor de verzadiging in de gevoeligheid van de fotomultiplicatorbuis wordt vermeden om een lineaire relatie met het fluorescentiesignaal te hebben.
  5. Andere acquisitieparameters instellen: Modus; Grootte; Objectief, zonder zoom; Geen Kalman; Stapgrootte.
    OPMERKING: Identieke acquisitievoorwaarden moeten worden gebruikt voor het afbeelden van de controle- en experimentele monsters.
  6. Stel de coördinaten in op x- en y-as: Scan het netvlies 2x scherp. Als het gebied vaten toont, selecteert u het door tweemaal op het gebied te klikken om het te markeren voor latere beeldverwerving.
    OPMERKING: Het is ten zeerste aan te bevelen om het retinale gebied te selecteren door de superieure vasculaire plexus te volgen, omdat de fluorescentie van grotere bloedvaten hoger is.
  7. Ga in het raster naar een buurplein, richt het netvlies en selecteer het gebied als het overeenkomt. Herhaal deze stap totdat het geselecteerde gebied het hele netvlies omvat.
  8. Selecteer één gebied en stel de coördinaten in op de z-as om de dikte te bepalen die moet worden gescand. Visualiseer hiervoor het netvlies 2x scherp; ga met de micrometer naar de bovenkant van het netvlies en klik op Instellen bij de startpositie. Ga vervolgens naar de onderkant van het netvlies en klik op Instellen in de eindpositie.
  9. Herhaal stap 3.8 op elk gebied dat in het raster is geselecteerd.
    OPMERKING: Als u het gescande gebied grondig wilt controleren, drukt u op Go in de startpositie. Als vaten nog steeds worden gevisualiseerd, past u de positie aan door de micrometer te bewegen en klikt u vervolgens op Instellen. Herhaal het proces in de positie Eind.
  10. Initialiseer geautomatiseerd scannen.
  11. Zodra het scanproces is voltooid, opent u de afbeelding.
  12. Selecteer de serie-indeling om de afbeelding op te nemen als mozaïek en sla deze op met de gewenste extensie. Ten slotte wordt de gestikte afbeelding op het scherm weergegeven.

4. Beeldverwerking

  1. Ga in de ImageJ FIJI-software naar de menubalk en klik op Bestand > Openen. Selecteer de afbeelding die u wilt verwerken. Selecteer in het venster Importopties voor bio-indelingen de OME-XML-metagegevens weergeven en klik op OK.
    OPMERKING: Afbeeldingen met een vergelijkbare naam moeten in afzonderlijke mappen worden opgeslagen.
  2. Zoek in het venster OME Metadata naar de pixelgrootte-informatie, genaamd PhysicalSizeX, PhysicalSizeY en PhysicalSizeZ. Kopieer deze gegevens.
  3. Ga voor beeldkalibratie naar de menubalk en selecteer Afbeelding > eigenschappen. Kopieer de informatie van de afbeelding in stap 4.2 en klik op OK. De afbeelding wordt geopend als een venster met verschillende foto's, waarbij elk de microfoto's vertegenwoordigt die op een z-as zijn verkregen.
  4. Wijs een voorkeursluit toe aan de afbeelding om een kleur naar het fluorescerende label te verzenden. Ga hiervoor naar de menubalk en klik op het LUT-pictogram .
  5. Als u alle stapels in één afbeelding wilt visualiseren, gaat u naar de menubalk en selecteert u Afbeelding > stapels > Z-project.
  6. Selecteer in het weergegeven Z-projectievenster alle stapels waar vaten worden gevisualiseerd. Kies in Projectietype de optie Gemiddelde intensiteit en klik op OK.
    OPMERKING: Het resultaat van de som van de stapels wordt weergegeven in een nieuwe afbeelding met de naam AVG (afbeeldingsnaam).
  7. Pas de helderheid en het contrast in de resulterende afbeelding aan om de achtergrond te verkleinen en vaten te markeren. Ga naar de menubalk en klik op Afbeelding> Aanpassen> Helderheid /Contrast. In de B- en C-vensters bewegen de balken totdat een betere intensiteit wordt waargenomen. Klik op Toepassen en sla de wijzigingen op.
  8. Kopieer de parameters die zijn geselecteerd voor Helderheid/contrast; deze moeten voor alle afbeeldingen identiek zijn.
  9. Definieer voorafgaand aan beeldkwantificering de parameters die zullen worden gemeten. Ga in de menubalk naar Analyseren > metingen instellen. In de hier beschreven procedures zal het nodig zijn om Gebied en Perimeter te verkrijgen (dit is uiteindelijk ook nodig om afstanden te meten). Klik op OK.
  10. Download de plug-in die nodig is voor de kwantificering van de scheepsdichtheid17 en volg de installatie-instructies van de plug-in.
  11. Ga verder met de kwantificering van een specifieke vasculaire parameter.

5. Kwantificering van avasculaire gebieden

  1. Kies in de menubalk het gereedschap Toverstok. Selecteer het netvliesgebied zonder vaten.
    OPMERKING: Grotere of kleinere gebieden kunnen worden geselecteerd, afhankelijk van de tolerantie. Om de tolerantie aan te passen, klikt u tweemaal op het pictogram van het toverstokgereedschap. Gebruikte modus: Legacy.
  2. Druk op de T-letter op het toetsenbord om het geselecteerde gebied in de ROI Manager vast te leggen. Herhaal stap 5.1 en 5.2 met alle avasculaire gebieden van het netvlies.
  3. Klik op Meten in de ROI-manager om de avasculaire gebiedsinformatie te verkrijgen. Het programma geeft een nieuw venster weer met de vereiste informatie. Kopieer de gegevens in een ander programma of sla het bestand op.
    OPMERKING: In sommige afbeeldingen kan men er de voorkeur aan geven om de avasculaire gebieden handmatig te selecteren. Kies in dit geval het gereedschap Veelhoekselectie, teken korte afstanden rond het avasculaire gebied en klik op de afbeelding wanneer een nieuwe afstand op het punt staat te beginnen. Sluit het geselecteerde gebied door op het eerste punt te klikken.
  4. Herhaal stap 5.1, 5.2 en 5.3 om het totale oppervlak van het netvlies te meten.
  5. Bereken het avasculaire gebied van het netvlies als de som van alle gemeten avasculaire gebieden gedeeld door het totale gebied van het netvlies.

6. Kwantificering van neovasculaire gebieden

  1. Kies in de menubalk het gereedschap Toverstaf.
  2. Zoom in op de afbeelding om neovessels beter te visualiseren. Selecteer de neovessels één voor één met het gereedschap.
    OPMERKING: Pas de tolerantie niet hoger dan 20 aan om de selectie van een enkel neovessel te garanderen. Dit tolerantieniveau moet constant blijven tijdens alle beeldkwantificeringen.
  3. Druk op de T-letter op het toetsenbord om het geselecteerde gebied in de ROI Manager vast te leggen. Herhaal stap 6.1 en 6.2 met alle neovasculaire gebieden van het netvlies.
  4. Klik op Meten in de ROI-manager om de gebiedsgegevens te verkrijgen. Het programma geeft een nieuw venster weer met de vereiste informatie. Kopieer de gegevens in een ander programma of sla het bestand op.
  5. Herhaal stap 6.1, 6.2 en 6.3 om het totale gebied van het netvlies te kwantificeren.
  6. Bereken het neovasculaire gebied van het netvlies als de som van alle oppervlakten van de neovessels gemeten gedeeld door het totale gebied van het netvlies.

7. Kwantificering van de diameter van het vat

  1. Selecteer in de menubalk het gereedschap Rechte lijn.
  2. Zoom in op de afbeelding om de vaatwand beter te visualiseren. Voer drie transversale lijnen uit naar het hoofdvat vóór de eerste tak. Dit moet worden gedaan door een lijn te trekken van de grens van de ene muur van het vat naar de tegenovergestelde.
    OPMERKING: De lijn moet perfect loodrecht op het wandvat staan om kwantificeringsfouten te voorkomen.
  3. Druk op de T-letter op het toetsenbord om het geselecteerde gebied in de ROI Manager vast te leggen. Herhaal stap 7.1 en 7.2 in alle vaten die moeten worden gekwantificeerd.
  4. Klik op Meten in de ROI-manager om de afstandsgegevens te verkrijgen. Het programma geeft een nieuw venster weer met de vereiste informatie. Kopieer de gegevens in een ander programma of sla het bestand op.

8. Kwantificering van de tortuositeit van het vaartuig

  1. Klik in de menubalk op het pictogram Straight-Line Tool met de rechterknop van de muis en selecteer Gesegmenteerde lijn of Freehand Line. Trek een lijn in het vat van de oogzenuw tot de eerste vaatvertakking na de vasculaire vorm.
    OPMERKING: De lijn moet de vasculaire vorm volgen om kwantificeringsfouten te voorkomen.
  2. Druk op de T-letter op het toetsenbord om het geselecteerde gebied in de ROI Manager vast te leggen.
  3. Selecteer in de menubalk het gereedschap Rechte lijn. Trek een lijn van de oogzenuw tot de eerste vaatvertakking.
  4. Druk op de T-letter op het toetsenbord om het geselecteerde gebied in de ROI Manager vast te leggen.
  5. Klik op Meten in de ROI Manager om de afstandsgegevens te verkrijgen. Het programma geeft een nieuw venster weer met de vereiste informatie. Kopieer de gegevens in een ander programma of sla het bestand op.
  6. Bereken de tortuositeitsindex als volgt: afstand verkregen met gesegmenteerde lijn gedeeld door de afstand verkregen met rechte lijn.

9. Kwantificering van vasculaire vertakking

  1. Definieer met het gereedschap Ovaal van de menubalk een gebied dat op gelijke wijze wordt toegepast op alle experimentele omstandigheden. Het geselecteerde gebied moet een concentrische cirkel zijn die rond de oogzenuw is getekend.
  2. Druk op de T-letter op het toetsenbord om het geselecteerde gebied in de ROI Manager vast te leggen.
    OPMERKING: In dit geval is het raadzaam om de ROI op te slaan, omdat de kwantificering traag is en de identieke ROI in alle afbeeldingen moet worden gebruikt. Om dit te doen, klikt u in de ROI Manager op MEER > Opslaan.
  3. Tel handmatig het aantal primaire vertakkingen dat voortvloeit uit hoofdvaten binnen het selectiegebied.
  4. Herhaal stap 9.2 en 9.3 in aangrenzende gebieden, met behoud van de criteria voor de oogzenuw-periferie.

10. Kwantificering van de vasculaire dichtheid

  1. Transformeer de afbeelding naar de 8-bits modus.
  2. Ga naar Plug-ins in de menubalk, selecteer Vessel Analysis > Vascular Density.
  3. Definieer een gebied met het gereedschap Vierkant van de menubalk, waar de vatdichtheid moet worden gemeten. Klik op OK.
  4. Het programma geeft een nieuw venster weer met de vereiste informatie. Kopieer de gegevens in een ander programma of sla het bestand op.
  5. Herhaal stap 10.2, 10.3 en 10.4 in de aangrenzende gebieden, behoud de ROI, maar plaats deze negen keer in de periferie en het midden van het hele netvlies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zoals beschreven in de protocolsectie, kunt u uit een enkele fluorescerende kleuringstest de vasculaire morfologie verkrijgen en verschillende parameters van belang kwantitatief evalueren. Het zoeken naar een specifieke verandering zal afhangen van het type retinopathie dat wordt bestudeerd. In dit artikel werden avasculaire en neovasculaire gebieden, tortuositeit en dilatatie geëvalueerd in een muismodel van proliferatieve retinopathie, terwijl de vasculaire vertakking en dichtheid werden geanalyseerd in een MetS-muismo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Diermodellen van retinopathieën zijn krachtige hulpmiddelen voor het bestuderen van vasculaire ontwikkeling, remodellering of pathologische angiogenese. Het succes van deze studies in het veld is afhankelijk van de gemakkelijke toegang tot het weefsel dat het mogelijk maakt om een breed scala aan technieken uit te voeren, waarbij gegevens van in vivo en postmortale muizen worden verstrekt26,27. Bovendien is er een grote correlatie gevonden tusse...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

We danken Carlos Mas, María Pilar Crespo en Cecilia Sampedro van CEMINCO (Centro de Micro y Nanoscopía Córdoba, CONICET-UNC, Córdoba, Argentinië) voor hulp bij confocale microscopie, aan Soledad Miró en Victoria Blanco voor toegewijde dierenverzorging en Laura Gatica voor histologische hulp. We danken ook Victor Diaz (Pro-Secretary of Institutional Communication van FCQ) voor de videoproductie en -editie en Paul Hobson voor zijn kritische lezing en taalrevisie van het manuscript.

Dit artikel werd gefinancierd door subsidies van Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT), Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (allemaal naar M.C.S.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aluminuim folie
Bovine Serum AlbumineMerckA4503kwaliteit
Calciumchloride dihydraatMerckC3306
ZoutzuurBiopack9632.08
Confocal Microscoop FV1200OlympusFV1200met gemotoriseerde plaat
DekvlakkenPaul Marienfeld GmnH & Co.111520
DissectiemicroscoopNIKONSMZ645
Dinatriumwaterstoffosfaat dihydraatMerck119753
200 µL  buisMerckZ316121
FilterpapierMerckWHA5201090
Incubator shaker GyroMiniLabNet InternationalS0500
Isolectin GS-IB4 Van Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 ConjugaatInvitrogenI21411
Poly(vinyl alcohol) (Mowiol 4-88)Merck475904
ParaformaldehydeMerck158127
pH-meterSANXINPHS-3D-03
KaliumchlorideMerckP9541
KaliumdiwaterstoffosfaatMerck1,04,873
GlijbanenFisher Scientific12-550-15
NatriumchlorideMerckS3014
NatriumhydroxideMerckS5881
TrisMerckGE17-1321-01
Triton X-100MerckX100-1GA
Vessel Analysis Fiji softwareMai Elfarnawanyhttps://imagej.net/Vessel_Analysis

Referenties

  1. Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
  2. McDougal, D. H., Gamlin, P. D. Autonomic control of the eye. Comprehensive Physiology. 5 (1), 439-473 (2015).
  3. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  4. Wei, Y., et al. Age-related alterations in the retinal microvasculature, microcirculation, and microstructure. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (9), 3804-3817 (2017).
  5. Lavia, C., et al. Reduced vessel density in the superficial and deep plexuses in diabetic retinopathy is associated with structural changes in corresponding retinal layers. PLoS One. 14 (7), 0219164(2019).
  6. Rosenblatt, T. R., et al. Key factors in a rigorous longitudinal image-based assessment of retinopathy of prematurity. Scientific Reports. 11 (1), 5369(2021).
  7. Edwards, A. L. Funduscopic examination of patients with diabetes who are admitted to hospital. Canadian Medical Association Journal. 134 (11), 1263-1265 (1986).
  8. Lechner, J., O'Leary, O. E., Stitt, A. W. The pathology associated with diabetic retinopathy. Vision Research. 139, 7-14 (2017).
  9. Sun, Z., et al. angiography metrics predict progression of diabetic retinopathy and development of diabetic macular edema: A prospective study. Ophthalmology. 126 (12), 1675-1684 (2019).
  10. Jia, Y., et al. Quantitative optical coherence tomography angiography of vascular abnormalities in the living human eye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 2395-2402 (2015).
  11. Pauleikhoff, D., Gunnemann, F., Book, M., Rothaus, K. Progression of vascular changes in macular telangiectasia type 2: comparison between SD-OCT and OCT angiography. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 257 (7), 1381-1392 (2019).
  12. Gammons, M. V., Bates, D. O. Models of oxygen induced retinopathy in rodents. Methods in Molecular Biology. 1430, 317-332 (2016).
  13. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
  14. Han, N., Xu, H., Yu, N., Wu, Y., Yu, L. MiR-203a-3p inhibits retinal angiogenesis and alleviates proliferative diabetic retinopathy in oxygen-induced retinopathy (OIR) rat model via targeting VEGFA and HIF-1α. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 47 (1), 85-94 (2020).
  15. Paz, M. C., et al. Metabolic syndrome triggered by fructose diet impairs neuronal function and vascular integrity in ApoE-KO mouse retinas: Implications of autophagy deficient activation. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 573987(2020).
  16. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
  17. Zarb, Y., et al. Ossified blood vessels in primary familial brain calcification elicit a neurotoxic astrocyte response. Brain. 142 (4), 885-902 (2019).
  18. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  19. Subirada, P. V., et al. Effect of autophagy modulators on vascular, glial, and neuronal alterations in the oxygen-induced retinopathy mouse model. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 279(2019).
  20. Lutty, G. A., McLeod, D. S. Development of the hyaloid, choroidal and retinal vasculatures in the fetal human eye. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 58-76 (2018).
  21. Kim, C. B., D'Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
  22. Guaiquil, V. H., et al. A murine model for retinopathy of prematurity identifies endothelial cell proliferation as a potential mechanism for plus disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (8), 5294-5302 (2013).
  23. Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science: Official Publication of the American Academy of Optometry. 93 (10), 1268-1279 (2016).
  24. Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
  25. Kim, A. Y., et al. Quantifying microvascular density and morphology in diabetic retinopathy using spectral-domain optical coherence tomography angiography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (9), 362(2016).
  26. Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: from development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
  27. Grossniklaus, H. E., Kang, S. J., Berglin, L. Animal models of choroidal and retinal neovascularization. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (6), 500-519 (2010).
  28. Kern, T. S., Antonetti, D. A., Smith, L. E. H. Pathophysiology of diabetic retinopathy: Contribution and limitations of laboratory research. Ophthalmic Research. 62 (4), 196-202 (2019).
  29. Lorenc, V. E., et al. IGF-1R regulates the extracellular level of active MMP-2, pathological neovascularization, and functionality in retinas of OIR mouse model. Molecular Neurobiology. 55 (2), 1123-1135 (2018).
  30. Ma, N., Streilein, J. W. Contribution of microglia as passenger leukocytes to the fate of intraocular neuronal retinal grafts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (12), 2384-2393 (1998).
  31. Mazzaferri, J., Larrivée, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 3916(2018).
  32. Milde, F., Lauw, S., Koumoutsakos, P., Iruela-Arispe, M. L. The mouse retina in 3D: quantification of vascular growth and remodeling. Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro (Camb). 5 (12), 1426-1438 (2013).
  33. Yang, T., et al. Pericytes of indirect contact coculture decrease integrity of inner blood-retina barrier model in vitro by upgrading MMP-2/9 activity. Disease Markers. 2021, 7124835(2021).
  34. Huang, Q., Wang, S., Sorenson, C. M., Sheibani, N. PEDF-deficient mice exhibit an enhanced rate of retinal vascular expansion and are more sensitive to hyperoxia-mediated vessel obliteration. Experimental Eye Research. 87 (3), 226-241 (2008).
  35. Jiang, H., Zhang, H., Jiang, X., Wu, S. Overexpression of D-amino acid oxidase prevents retinal neurovascular pathologies in diabetic rats. Diabetologia. 64 (3), 693-706 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Kwantificering van de retinale vascularisatiewhole mount retinazuurstof ge nduceerde retinopathienon proliferatieve retinopathieproliferatieve retinopathievasculaire densiteitvatdiametervasculaire vertakkingisolectine kleuringImageJ Fiji analyse

Gerelateerde artikelen