Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van endotheelcellen uit het lumen van muisslagaders voor eencellige multi-omics-experimenten

3.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63128

⸱

4 oktober 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

We presenteren een methode voor het isoleren van endotheelcellen en kernen uit het lumen van muiscarotisslagaders die zijn blootgesteld aan stabiele of verstoorde stroomomstandigheden om eencellige omics-experimenten uit te voeren.

Samenvatting

Atherosclerose is een ontstekingsziekte van de arteriële gebieden die worden blootgesteld aan een verstoorde bloedstroom (d-flow). D-flow reguleert de expressie van genen in het endotheel op transcriptomisch en epigenomisch niveau, wat resulteert in proatherogene responsen. Onlangs werden single-cell RNA sequencing (scRNAseq) en single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin sequencing (scATACseq) studies uitgevoerd om de transcriptomische en chromatine toegankelijkheidsveranderingen te bepalen bij een single-cell resolutie met behulp van het muis partiële carotis ligatie (PCL) model. Aangezien endotheelcellen (EC's) een klein deel van de totale celpopulaties in de slagaderwand vertegenwoordigen, werd een luminale verteringsmethode gebruikt om EC-verrijkte eencellige preparaten te verkrijgen. Voor deze studie werden muizen onderworpen aan PCL-chirurgie om d-flow in de linker halsslagader (LCA) te induceren terwijl de rechter halsslagader (RCA) als controle werd gebruikt. De halsslagaders werden twee dagen of twee weken na de PCL-operatie ontleed. Het lumen van elke halsslagader werd onderworpen aan collagenasevertering en endotheelverrijkte enkele cellen of enkele kernen werden verkregen. Deze eencellige en eenkernige preparaten werden vervolgens gecodeerd met behulp van een 10x Genomics microfluïdische opstelling. De single-cells en single-nuclei met streepjescode werden vervolgens gebruikt voor RNA-voorbereiding, bibliotheekgeneratie en sequencing op een HIGH-throughput DNA-sequencer. Na de verwerking van bioinformatica identificeerden de datasets scRNAseq en scATACseq verschillende celtypen uit de luminale vertering, voornamelijk bestaande uit EC's. Gladde spiercellen, fibroblasten en immuuncellen waren ook aanwezig. Deze EC-verrijkingsmethode hielp bij het begrijpen van het effect van de bloedstroom op het endotheel, wat moeilijk had kunnen zijn met de totale slagaderverteringsmethode. De EC-verrijkte eencellige bereidingsmethode kan worden gebruikt om eencellige omics-studies uit te voeren bij EC-knock-outs en transgene muizen waarbij het effect van de bloedstroom op deze genen niet is bestudeerd. Belangrijk is dat deze techniek kan worden aangepast om EC-verrijkte enkele cellen te isoleren van menselijke arterie-explantaten om vergelijkbare mechanistische studies uit te voeren.

Inleiding

Dit laboratorium toonde eerder aan dat inductie van d-flow leidt tot snelle en robuuste atheroscleroseontwikkeling bij hyperlipidemische muizen 1,2. Het nieuwe muismodel van d-flow-geïnduceerde atherosclerose was mogelijk met behulp van partiële carotisligatie (PCL) chirurgie 3. PCL-chirurgie induceert een lage en oscillerende bloedstroomconditie of d-flow in de ligatie linker halsslagader (LCA). Daarentegen blijft de contralaterale rechter halsslagader (RCA) te maken hebben met een stabiele laminaire stroming (s-flow). Om het effect van d-flow op endotheelcellen te begrijpen, werden de halsslagaders eerder na een gedeeltelijke ligatieoperatie ontleed en gespoeld met een op fenol en guanidine isothiocyanaat gebaseerd lysingmiddel (luminale RNA / DNA-spoelmethode)2,4, die endotheelverrijkte "gepoolde bulk" RNA's of DNA's leverden. Deze gepoolde bulk-RNA's of DNA's werden vervolgens verwerkt voor transcriptomische studies of epigenomische DNA-methyloomstudies, respectievelijk 4,5,6. Deze studies hielpen bij het ontdekken van meerdere stroomgevoelige genen en microRNA's waarvan de rol in endotheelbiologie en atherosclerose uitgebreid werd onderzocht 4,6,7.

Ondanks endotheelverrijking konden deze bulk RNA/ DNA-studies echter niet de specifieke rol van elk celtype in de slagaderwand onderscheiden bij d-flow-geïnduceerde atherosclerose. Endotheelverrijkte eencellige (sc) isolatie en scRNA- en scATAC-sequencingstudies werden uitgevoerd om deze beperking te overwinnen8. Hiervoor werden C57Bl6-muizen onderworpen aan de PCL-operatie om d-flow in de LCA te induceren terwijl de s-flow-blootgestelde RCA als controle werd gebruikt. Twee dagen of twee weken na de PCL-operatie werden de muizen geofferd en werden de halsslagaders ontleed en opgeruimd. Het lumen van zowel LCA's als RCA's werd doordrenkt met collagenase en de luminale collagenase-digesten die EC's bevatten als een significante fractie en andere arteriële cellen werden verzameld. De single-cell suspension (scRNAseq) of single-nuclei suspensie (scATACseq) werden voorbereid en voorzien van barcodes met unieke identifiers voor elke cel of kern met behulp van een 10x Genomics setup. De RNA's werden onderworpen aan cDNA-bibliotheekvoorbereiding en gesequenced.

De scRNAseq en scATACseq datasets werden verwerkt met behulp van de Cell Ranger Single-Cell Software en verder geanalyseerd door Seurat en Signac R pakketten 9,10. Elke cel en kern kreeg een celtype toegewezen uit deze analyses en geclusterd in het celtype op basis van de markergenen en unieke genexpressiepatronen. De resultaten van de scRNAseq en scATACseq toonden aan dat deze eencellige preparaten verrijkt zijn met EC's en ook gladde spiercellen (SMC's), fibroblasten en immuuncellen bevatten.

Verdere analyse toonde aan dat de EG-populatie in de luminale vertering zeer divergent en plastisch is (8 verschillende EC-clusters) en reageert op de bloedstroom. Het belangrijkste is dat deze resultaten aantoonden dat d-flow EC's herprogrammeert van een athero-beschermd ontstekingsremmend fenotype naar pro-atherogene fenotypen, waaronder pro-inflammatoire, endotheel-naar-mesenchymale overgang, endotheelstam / voorlopercelovergang en het meest verrassend, endotheel-naar-immuuncelachtige overgang. Bovendien onthullen scATACseq-gegevens nieuwe stroomafhankelijke chromatinetoegankelijkheidsveranderingen en transcriptiefactorbindingsplaatsen op een genoombrede manier, die de basis vormen van verschillende nieuwe hypothesen. De methodologie en het protocol voor het voorbereiden van enkelvoudige endotheelcellen voor eencellige multi-omics-studies van de muiscarotisslagaders worden hieronder beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hieronder beschreven dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee aan de Emory University. Niet-hypercholesterolemische, leeftijds- en geslachtsgematchte C57BL/6-muizen werden gebruikt om geslachtsafhankelijke variatie te verminderen en eventuele complicaties van hypercholesterolemische aandoeningen te compenseren.

1. Gedeeltelijke carotisligatie (PCL) chirurgie

OPMERKING: Gedeeltelijke halsslagaderligatie van LCA werd uitgevoerd zoals eerder beschreven en aangetoond3.

  1. Verdoof de muis door isofluraaninhalatie (5% isofluoraan in zuurstof voor inductie en 1,5% daarna voor onderhoud) gedurende de hele procedure met behulp van een verdovingsverdamper. Plaats de muis in rugligging op een deltafase isothermisch kussen om verlies van lichaamswarmte tijdens de operatie te voorkomen.
  2. Breng een oculaire zalf aan om blootstelling aan keratitis te voorkomen en bevestig de diepte van de anesthesie door de afwezigheid van een teenknijprespons.
  3. Injecteer buprenorfine 0,05 mg/kg subcutaan om pijn preventief te beheersen. Desinfecteer het geëmuleerde gebied door drie keer aan te brengen en te reinigen met betadine en isopropanoloplossing. Zorg ervoor dat betadine de laatste stap is om het operatiegebied te steriliseren, beginnend bij het midden en eindigend aan de zijkanten.
  4. Maak met behulp van aseptische technieken een ventrale middenlijnincisie (~ 1 cm) in het nekgebied en stel het LCA-vertakkingspunt bloot door stompe dissectie.
  5. Ligate de linker interne halsslagader, externe carotis en occipitale slagaders met 6-0 zijde hechting; laat de superieure schildklierslagader onaangeroerd.
  6. Benader de huid en sluit de incisie met weefsellijm en/of hechtingen.
  7. Breng de muis over naar een voorverwarmde herstelkooi (gehandhaafd op 37 °C) en plaats hem op een schone handdoek gedurende maximaal 1 uur om onderkoeling na de operatie te voorkomen.
    OPMERKING: In onze ervaring is een preventieve enkele dosis Buprenorfine (0,05 mg / kg) meestal voldoende voor pijnbestrijding na de operatie. Een herhaalde dosis Buprenorfine kan worden toegediend als het dier na de eerste 24 uur in nood verkeert. Indien correct uitgevoerd, is er geen mortaliteit geassocieerd met deze procedure en is postoperatieve stress voor de muis minimaal. De muizen worden teruggebracht naar hun respectievelijke kooien en dagelijks gecontroleerd na de operatie.
  8. Bereid de perfusie-instelling voor.
    1. Gebruik 0,9% NaCl (normale zoutoplossing) met 10 U/ml heparine in een infuuszak. Haak de infuuszak 244-274 cm (8-9 voet) vanaf de grond of ongeveer 122-152 cm (4-5 voet) hoger dan de snijplank. Bevestig de vlindernaald aan het einde van de zoutoplossing en spoel eventuele luchtbellen uit de infuuslijn.

2. Isolatie van halsslagaders na opoffering

  1. Offer de muizen op door CO 2-inademing volgens het institutionele IACUC-protocol.
  2. Spuit 70% ethanol op de huid van de muis en plaats deze in rugligging op de snijplank met adsorberende papieren handdoeken. Bevestig de poten van de muis aan de adsorberende handdoeken op het snijplank met plakband of een naald van 21 G.
  3. Verwijder met een steriele schaar de huid van de muis vanaf de buik en helemaal tot aan de bovenkant van de thorax.
  4. Gebruik een schaar om de buikwand onder de ribbenkast te openen door stompe dissectie.
  5. Maak met behulp van de schaar voorzichtig een incisie langs de lengte van het diafragma en ga door de ribben aan beide zijden van de thorax totdat het borstbeen kan worden weggetild. Til het borstbeen voorzichtig weg met een tang; verwijder daarna de ribbenkast om het hart bloot te leggen.
  6. Verwijder voorzichtig de thymus en eventueel bindweefsel over het hart om de belangrijkste bloedvaten te visualiseren.
  7. Knip de vena cava af met een schaar om bloed uit de gesloten circulatie te laten ontsnappen.
  8. Steek een vlindernaald van 21 G verbonden met de IV-lijn door de top van het hart in de linker ventrikel en laat retrograde perfusie gedurende 2-3 minuten met normale zoutoplossing bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat een constante stroomsnelheid van normale zoutoplossing wordt gehandhaafd door de zoutzak op een hoogte van 8-9 voet van de grond te houden.
    OPMERKING: De longen en lever worden bleek, wat wijst op een optimale perfusie. Voor elke muis wordt ongeveer 20 ml perfusiebuffer gebruikt.
  9. Verwijder de huid uit het nekgebied en verwijder alle vet, spieren en bindweefsels om de halsslagaders bloot te leggen (figuur 1A).
    OPMERKING: De rest van de procedure wordt uitgevoerd onder de ontleedmicroscoop.
  10. Pas het gezichtsveld aan om de ligatieplaatsen te lokaliseren. Maak met behulp van de 10 mm microdissectieschaar een kleine incisie onder de ligatieplaats in de LCA om perfusie mogelijk te maken.
  11. Perfuseer opnieuw gedurende nog eens 1 min via de linker ventrikel en zorg ervoor dat de LCA goed doordrenkt is en vrij van zichtbare bloedsporen.
  12. Gebruik een fijne tiptang en een kleine veerschaar om de peri-adventitiale weefsels rond de halsslagader voorzichtig te verwijderen terwijl de halsslagader aan het lichaam is bevestigd.
    OPMERKING: Wees uiterst voorzichtig om de halsslagaders niet te knijpen of uit te rekken tijdens deze reinigingsstap, omdat dit het aantal niet-levensvatbare cellen kan verhogen. Indien correct uitgevoerd, is de levensvatbaarheid van de cel in de uiteindelijke celsuspensie meestal >93%.

3. Endotheel-cel-verrijkte eencellige isolatie van muizencarotiden

OPMERKING: De hieronder beschreven reagentia kunnen van tevoren worden bereid en tot gebruik bij 4 °C worden bewaard: 1x en 0,1x single-nuclei lysis buffers met de in tabel 1 vermelde reagentia; wasbuffer met één kern met de in tabel 1 vermelde reagentia; single-nuclei Nuclei Buffer recept met de in tabel 1 vermelde reagentia. De werkvoorraden van deze buffers moeten worden opgesteld volgens het protocol van de fabrikant. Samenstelling van de digestiebuffer: Collagenase Type II 600 U/ml en DNase I 60 U/ml in 0,5% foetaal runderserum (FBS)-bevattende fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).

  1. Terwijl de halsslagaders nog steeds zijn bevestigd, wast u de buitenkant van de halsslagaders met een normale zoutoplossing om eventuele bloedsporen weg te spoelen.
  2. Injecteer met behulp van een insulinespuit met een naald van 29 G ~ 50 μL van de digestiebuffer in het lumen van het distale uiteinde van de linker halsslagader. Als de digestiebuffer de halsslagader begint te vullen, klemt u het proximale uiteinde van de halsslagader vast met een microclip (figuur 1B). Breng een extra 15-20 μL digestiebuffer in het lumen en klem het distale uiteinde vast om het vrijkomen van de digestiebuffer te voorkomen.
  3. Explant de halsslagaders voorzichtig uit de muis (figuur 1B,C) en plaats ze in schotels van 35 mm met warme (bij 37 °C) Hepes-gebufferde zoutoplossing.
    LET OP: Zorg ervoor dat beide klemmen goed geplaatst zijn. Als de klem losraakt, kan de verteringsoplossing uit het lumen lekken en het verkregen celgetal beïnvloeden. Als dit gebeurt, voeg dan extra enzymatische oplossing toe met behulp van een insulinespuit met een naald van 29 G vanaf het open uiteinde van de halsslagader en zet de klem opnieuw vast (figuur 1D). Als de enzymbufferoplossing opnieuw lekt, is het waarschijnlijk dat de halsslagader wordt afgebroken tijdens het explantatieproces. Gooi in dit geval de halsslagader weg en sluit het monster uit van het onderzoek. Herhaalde ruwe behandeling van de halsslagader zal de levensvatbaarheid van de cel en de kwaliteit van eencellige bereiding verminderen. Zorg ervoor dat u de linker- en rechter halsslagaders identificeert en correct labelt.
  4. Incubeer de uitgeplante halsslagaders gedurende 45 minuten bij 37 °C met intermitterend schommelen.

4. Spoelen van de halsslagaders

  1. Verwijder na het voltooien van de luminale enzymatische spijsvertering de halsslagader samen met de klemmen uit de schaal van 35 mm. Verwijder zorgvuldig elke klem en zorg ervoor dat de digestiebuffer niet lekt.
  2. Houd het ene uiteinde van de halsslagader voorzichtig met een fijne tang op een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Steek met de andere hand een naald van 29 G met een insulinespuit met 100 μL warme verteringsbuffer (37 °C) in het lumen (figuur 1D).
  3. Spoel het lumen van de halsslagader snel in de microcentrifugebuis. Blokkeer de enzymatische reactie door 0,3 ml FBS toe te voegen aan de buis van 1,5 ml. Plaats de tube op ijs.
    OPMERKING: Het blozen bevat de cellen van de luminale enzymatische spijsvertering. Het toevoegen van FBS en het verlagen van de temperatuur stopt het enzymatische verteringsproces. Als het aantal cellen in het preparaat hoog is en puin of vetweefsel bevat, wordt het gebruik van een celzeef van 50 of 70 μm ten zeerste aanbevolen om ongewenst weefselafval te filteren. Om het aantal één cellen te verhogen, wordt het spoelen van meerdere halsslagaders aanbevolen. Hier, om ten minste 5.000 cellen te verkrijgen, werden 10-12 halsslagaders gespoeld en samengevoegd als één monster.
  4. Centrifugeer de cellen bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C met behulp van een centrifuge die is uitgerust met een rotor met vaste hoek (zie de tabel met materialen).
  5. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de celpellet in de digestiebuffer met celdissociatiereagens (zie de materiaaltabel) gedurende 5 minuten bij 37 °C om alle cellen in afzonderlijke cellen te scheiden.
    OPMERKING: Als het aantal cellen in het preparaat laag is, verhoogt u de centrifugesnelheid tot 2.000-3.000 × g om de cellen te laten draaien. Bovendien vergemakkelijkt het gebruik van centrifugebuizen van 0,5 ml een betere visualisatie van de celpellet aan de onderkant van de buis.
  6. Blokkeer de enzymatische reactie door 0,15 ml FBS toe te voegen aan de buis van 0,5 ml.
  7. Centrifugeer de eencellige suspensie bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C met behulp van een centrifuge met een rotor onder vaste hoek, zoals in stap 4.4.
  8. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de cellen in 100 μL ijskoude 1% runderserum albumine (BSA) oplossing in PBS in een microcentrifugebuis van 0,2 ml.
    OPMERKING: Het gebruik van centrifugebuizen van 0,2 ml verbetert de visualisatie van de eencellige pellet op de bodem van de buis.

5. Eencellige en eenkernige analyses

  1. Resuspend en dien het eencellige preparaat in voor scRNAseq.
    1. Resuspendeer de eencellige pellet met 100 μL ijskoude 1% BSA in PBS in een buis van 0,2 ml.
    2. Nadat de cellen zijn geresuspendeerd voor inkapseling met één cel, gaat u onmiddellijk over tot inkapseling en barcodering met behulp van een op microfluïdica gebaseerd eencellig partitionerings- en barcoderingssysteem (zie de tabel met materialen).
    3. Voordat u de monsters naar de Genomics Core verzendt, telt en inspecteert u de eencellige preparaten; zorgen voor de afwezigheid van celaggregaten.
      OPMERKING: De aggregatie van afzonderlijke cellen kan verder worden geminimaliseerd door het BSA-bedrag tot 2% te verhogen.
  2. Resuspendeer en dien het eencellige preparaat voor scATACseq in.
    1. Resuspendeer de celpellet in 100 μL van 0,04% BSA in ijskoude 1x PBS en centrifugeer de eencellige suspensie bij 500 × g bij 4 °C.
    2. Lyseer de eencellige suspensie met ijskoude 0,1x lysisbuffer (tabel 1) en incubeer gedurende 5 minuten op ijs.
    3. Meng het lysaat 10 keer met een P-20 pipet en incubeer nog eens 10 minuten.
    4. Voeg 500 μL gekoelde wasbuffer (tabel 1) toe aan de gelyseerde cellen en meng 5 keer met een pipet.
      OPMERKING: Gebruik een celzeef van 70 μm om vuil uit de celsuspensie te filteren en over te brengen in een buis van 2 ml.
    5. Centrifugeer het lysaat bij 500 × g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de kernen-pellet in de verdunde kernenbuffer (150 μL) (zie de tabel met materialen en tabel 1). Tel en inspecteer de preparaten met één kern met behulp van een hemocytometer11.
    6. Dien het single-nuclei-monster in bij de Genomics Core voor single-nuclei-transpositie, nuclei-partitionering, bibliotheekvoorbereiding en sequencing.
      OPMERKING: Als het initiële celnummer laag is, is het gebruikelijk om puin langs de kernen te observeren. Daarom is het aan te raden om te beginnen met een hoog celgetal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Gedeeltelijke carotisligatieoperaties werden uitgevoerd op 44 muizen en het begin van d-flow in de LCA werd gevalideerd door echografie uit te voeren een dag na gedeeltelijke ligatiechirurgie. Succesvolle gedeeltelijke ligatiechirurgie veroorzaakt een verminderde bloedstroomsnelheid en keert de bloedstroom (verstoorde stroom) in de LCA3 om. De halsslagaders werden ontleden na twee dagen of twee weken na ligatie. Het lumen van elke halsslagader werd onderworpen aan collagenasevertering en ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol om eencellige preparaten te isoleren uit de halsslagaders van de muis. De invloed van d-flow op de endotheelcellen kan nauwkeurig worden bestudeerd als de PCL-operatie correct wordt uitgevoerd. Het is cruciaal om de takken van de gemeenschappelijke halsslagader correct te identificeren, zoals de externe halsslagader, interne halsslagader, occipitale slagader en superieure schildklierslagader. Validatie van stromingspatronen door echografie valideert verder het succesv...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

HJ is de oprichter van FloKines Pharma. Andere auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door financiering van national institutes of health subsidies HL119798, HL095070 en HL139757 aan HJ. HJ wordt ook ondersteund door het Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. De diensten van de Emory Integrated Genomics Core (EIGC) werden gesubsidieerd door de Emory University School of Medicine en werden ook gedeeltelijk ondersteund door de Georgia Clinical and Translational Science Alliance van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer. UL1TR002378. De hierboven verstrekte inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en weerspiegelt niet de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
1x PBS (Cell Culture Grade)Corning21040CMX12
1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge TubesEppendorf022-43-108-1
15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, SterileFablabFL4022
50 mL SuperClear Centrifuge TubesLabcon3191-335-028
6-0 Silk Suture SterileCovidiens-1172 c2
70 µm Cell Strainer, White, Sterile, Individually PackagedThermo Fisher Scientic08-771-2
Accutase solution,sterile-filteredSigma-AldrichA6964-100MLof gelijkwaardig
ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)10x Genomics2000122
ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)10x Genomics2000123/ 2000138
Bovine Serum albuminSigma-AldrichA7906-500G
BuprenorphineMed-Vet InternationalRXBUPRENOR5-V
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kits v3.110X Genomics1000121
Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.110X Genomics1000175
Collagenase IIMP Biomedicals2100502.5
DigitoninSigma-AldrichD141-100MG
Dissecting ForcepsRoboz Surgical Instruments CoRS-5005
Dnase1New England Biolabs IncM0303S
Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)Eppendorf22620444230VR
Fetal Bovine Serum - Premium SelectR&D systemsS11550
Fixed Angle RotorEppendorfFA-45-24-11-Kit Rotor
HEPES buffered salineMillipore Sigma51558
Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)BD305932
IsofluranePatterson vet789 313 89
MACs Smart Strainers (30 µm)Miltenyi Biotec130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µm) Miltenyi Biotec130-098-463
Normal Saline (0.9% sodium chloride)Baxter International Inc2B1323
Nuclei Buffer (20x)10x GenomicsPN 2000153/2000207
PBS (10x), pH 7.4Thermo Fisher Scientic70011-044
Small scissorsRoboz Surgical Instruments CoRS-5675
Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With LockRoboz Surgical Instruments Co.RS-5480of soortgelijk
Tissue Mend IIWebster Veteinanry07-856-7946
Type II CollagenaseMP biomedicals2100502.1
Deposited Data
scATACseq FastQ filesNCBIwww.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
scRNAseq FastQ filesNCBIwww.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233
Software and Algorithms
Cell Ranger 3.1.010X Genomicshttps://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp
CiceroPliner et al., 2018https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/
Ggplot2 v3.2.1Hadley Wickhamhttps://cran.r-project.org
HarmonyKorsunsky et al., 2019https://github.com/immunogenomics/harmony
ImageJSchneider et al., 2012https://imagej.nih.gov
Monocle 2.8.0Qiu et al., 2017https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release
R version 3.6.2R Foundationhttps://www.r-project.org
Seurat 3.1.3Stuart et al., 2019https://github.com/satijalab/seurat
Signac 0.2.5Stuart et al., 2019https://github.com/timoast/signac

Referenties

  1. Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation. Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).
  2. Nam, D., et al. Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).
  3. Nam, D., et al. A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861(2010).
  4. Dunn, J., et al. Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).
  5. Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo. Scientific Data. 1 (1), 140039(2014).
  6. Ni, C. W., et al. Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood. 116 (15), 66-73 (2010).
  7. Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000(2013).
  8. Andueza, A., et al. Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study. Cell Reports. 33 (11), 108491(2020).
  9. Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac. bioRxiv. , (2020).
  10. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  11. Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).
  12. Li, F., et al. Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow. Cell Death and Discovery. 7 (1), 180(2021).
  13. Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
  14. O'Flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biology. 20 (1), 210(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments
Posted by JoVE Editors on 6/22/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally

to:

Sandeep Kumar*1
Aitor Andueza*1
Nicolas Villa-Roel1
Juyoung Kim1
Dong-Won Kang1
Hanjoong Jo1,2
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University
* These authors contributed equally

Tags

Isolatie van endotheelcellenhalsslagadersingle-cell omicsluminale digestieverstoorde bloedstroomsingle-cell RNAseqsingle-nucleus sequencingcollagenase-digestiemuismodelchromatine-toegankelijkheid
Isolatie van endotheelcellen uit het lumen van muisslagaders voor eencellige multi-omics-experimenten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.