DetectSyn: een snelle, onbevooroordeelde fluorescerende methode om veranderingen in synapsdichtheid te detecteren

Samenvatting

DetectSyn is een onbevooroordeelde, snelle fluorescerende test die veranderingen meet in het relatieve synapsnummer (pre- en postsynaptische betrokkenheid) over behandelingen of ziektetoestanden. Deze techniek maakt gebruik van een nabijheidsligatietechniek die zowel in gekweekte neuronen als in vast weefsel kan worden gebruikt.

Samenvatting

Synapsen zijn de plaats van communicatie tussen neuronen. Neuronale circuitsterkte is gerelateerd aan synaptische dichtheid en de afbraak van synapsen is kenmerkend voor ziektetoestanden zoals depressieve stoornis (MDD) en de ziekte van Alzheimer. Traditionele technieken om synapsgetallen te onderzoeken omvatten genetische expressie van fluorescerende markers (bijv. Groen fluorescerend eiwit (GFP)), kleurstoffen die een neuron vullen (bijv. Carbocyaninekleurstof, DiI) en immunofluorescente detectie van wervelkolommarkers (bijv. Postsynaptische dichtheid 95 (PSD95)). Een belangrijk voorbehoud bij deze proxytechnieken is dat ze alleen postsynaptische veranderingen identificeren. Toch is een synaps een verbinding tussen een presynaptische terminal en een postsynaptische wervelkolom. De gouden standaard voor het meten van synapsvorming/-eliminatie vereist tijdrovende elektronenmicroscopie of arraytomografietechnieken. Deze technieken vereisen gespecialiseerde training en dure apparatuur. Verder kan slechts een beperkt aantal neuronen worden beoordeeld en worden ze gebruikt om veranderingen in een heel hersengebied weer te geven. DetectSyn is een snelle fluorescerende techniek die veranderingen in synapsvorming of -eliminatie identificeert als gevolg van een ziektetoestand of medicijnactiviteit. DetectSyn maakt gebruik van een snelle nabijheidsligatietest om naast elkaar geplaatste voor- en postsynaptische eiwitten en standaard fluorescerende microscopie te detecteren, een techniek die gemakkelijk beschikbaar is voor de meeste laboratoria. Fluorescerende detectie van de resulterende puncta maakt een snelle en onbevooroordeelde analyse van experimenten mogelijk. DetectSyn biedt meer representatieve resultaten dan elektronenmicroscopie omdat grotere gebieden kunnen worden geanalyseerd dan een beperkt aantal fluorescerende neuronen. Bovendien werkt DetectSyn voor in vitro gekweekte neuronen en vaste weefselplakken. Ten slotte wordt een methode geboden om de gegevens die uit deze techniek worden verzameld, te analyseren. Over het algemeen biedt DetectSyn een procedure voor het detecteren van relatieve veranderingen in synapsdichtheid tussen behandelingen of ziektetoestanden en is toegankelijker dan traditionele technieken.

Inleiding

Synapsen zijn de fundamentele eenheid van communicatie tussen neuronen¹. Veel synapsen tussen neuronen binnen dezelfde regio's geven aanleiding tot circuits die gedrag bemiddelen². Synapsen bestaan uit een presynaptische terminal van een neuron die neurotransmitters of neuropeptiden vrijgeeft die informatie doorgeven aan postsynaptische receptoren van een ander neuron. De som van presynaptische signalen bepaalt of het postsynaptische neuron een actiepotentiaal zal afvuren en de boodschap naar andere neuronen zal verspreiden.

Synaptopathologie, het afbreken van synapsen, ontstaat bij ziekten en aandoeningen die gekenmerkt worden door een verminderd neuraal volume, zoals de ziekte van Alzheimer en depressieve stoornis, waardoor circuits die niet meer optimaal presteren ^3,4,5. Het herstellen van de synapsdichtheid ligt waarschijnlijk ten grondslag aan de werkzaamheid van mogelijke behandelingen voor deze aandoeningen. Onlangs werd bijvoorbeeld aangetoond dat toenemende synapsen ten grondslag liggen aan de gedragsmatige werkzaamheid van snelle antidepressiva⁶. Om mogelijke synaptopathologische behandelingen snel te screenen, hebben onderzoekers technieken nodig die snel veranderingen in synapsnummers identificeren.

De huidige methodologieën zijn ofwel tijdrovend en duur (elektronenmicroscopie, arraytomografie), of ze onderzoeken alleen postsynaptische veranderingen zonder presynaptische betrokkenheid op te nemen (wervelkolomanalyses, immunofluorescentie / colocalisatie). Kleurstoffen zoals DiI of fluorescerende eiwitten zoals GFP helpen neuronen te visualiseren en postsynaptische stekels te karakteriseren. Wervelkolomanalyse maakt echter gebruik van door onderzoekers gedefinieerde verhoudingen om morfologie te bepalen, wat de reproduceerbaarheid kan verminderen⁷. Verder wordt nog steeds blootgelegd hoe de verschillende wervelkolomklassen zich verhouden tot functionele synapsen⁸. Wervelkolomvorming kan van voorbijgaande aard zijn en kan postsynaptische plasticiteit weerspiegelen, maar deze stekels kunnen worden geëlimineerd voordat ze stabiliseren in een synaps met een presynaptisch neuron⁹.

Colocalisatie biedt een betere proxy voor synapsen dan wervelkolomanalyse omdat men presynaptische en postsynaptische eiwitten kan immunostainen. Synaptische eiwitten kunnen echter lage colocalisatiewaarden opleveren omdat de eiwitten naast elkaar staan en mogelijk niet consistent overlappen. Dus, omdat de eiwitten niet volledig over elkaar heen liggen, kunnen colocalisatietechnieken veranderingen in synapsvorming niet nauwkeurig meten als gevolg van deze ontbrekende informatie. Ten slotte, hoewel zowel elektronenmicroscopie (EM) als arraytomografie beelden met hoge resolutie van synapsen bieden, zijn ze tijdrovend. EM vereist verder gespecialiseerde apparatuur en onderzoekers zijn beperkt tot kleine hoeveelheden weefsel voor een bepaald experiment. Hoewel arraytomografie elegant de mogelijkheid biedt om te screenen op veel eiwitten op ultradunne secties en kan worden gecombineerd met EM¹⁰, kan deze techniek te arbeidsintensief zijn en buiten het bereik van experimenten vallen die snel moeten scannen op veranderingen in synapsvorming.

DetectSyn is een specifieke toepassing van de Duolink Proximity Ligation Assay. De PLA-test maakt de algemene detectie van eiwit-eiwitinteracties mogelijk. DetectSyn overbrugt proxy postsynaptische metingen door een fluorescerend signaal te versterken dat wordt uitgezonden door gelabelde pre- en postsynaptische eiwitten binnen 40 nm van elkaar. Als de synaptische eiwitten zich binnen 40 nm bevinden, zoals in een synaptische spleet, dan zullen de secundaire antilichamen, die DNA-sondes bevatten, hybridiseren tot circulair DNA. Dit gehybridiseerde cirkelvormige DNA drukt een fluorescerende sonde uit, die vervolgens wordt versterkt en gedetecteerd met standaard fluorescerende microscopietechnieken (zie figuur 1). Cruciaal is dat deze techniek, in tegenstelling tot EM- en arraytomografie, geen gespecialiseerde apparatuur vereist en ongeveer evenveel tijd in beslag neemt als standaard immunohistochemie. De toegankelijkheid van deze techniek stelt onderzoekers buiten onderzoeksintensieve instellingen dus in staat om deel te nemen aan synaptopathologisch onderzoek. Verder kan deze techniek veranderingen in synaptische dichtheid in meerdere hersengebieden binnen één experiment onderzoeken, waardoor een meer holistische weergave van synaptische veranderingen als gevolg van ziekte of behandeling wordt geboden.

Protocol

Isolatie van cellen en weefsel van dieren was in overeenstemming met de Gids voor de Verzorging en het Gebruik van Proefdieren van de National Institutes of Health en goedgekeurd door de Wake Forest Institutional Animal Care and Use Committee

OPMERKING: Dit protocol wordt gebruikt op monsters die al zijn behandeld en vastgelegd volgens specifieke experimentele paradigma's en vereisten. Voor demonstratiedoeleinden wordt synapsvorming als gevolg van snelle antidepressieve behandeling gebruikt om deze synapsdetectietechniek te benadrukken⁶. Neuronen die eerder op coverslips zijn gekweekt, behandeld, gefixeerd in 4% paraformaldehyde (PFA) en opgeslagen in 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zullen worden gebruikt om de in vitro procedures te benadrukken. Eerder gesneden hippocampusweefsel (25 μm dik) van behandelde muizen, transcardiaal geperfuseerd met ijskoude PBS en 4% PFA, en vervolgens opgeslagen in cryoprotectant zal worden gebruikt om de plakprocedures te markeren. Zie^11,12 voor meer informatie over het kweken van neuronen of het transcardiaal perfuseren van knaagdieren. Zie figuur 1 voor een grafische weergave van deze procedure.

Figuur 1: Grafische weergave van DetectSyn assay. Na het permeabiliseren van celmembranen binden primaire antilichamen voor Synapsin1 en PSD95 zich aan deze synaptische eiwitten. Secondaries met oligonucleotide tags binden zich vervolgens aan de primaire antilichamen. Als Synapsin1 en PSD95 zich binnen 40 nm bevinden, zoals bij een synaps, dan interageren de oligonucleotiden en wordt een fluorescerende tag versterkt. Dit fluorescerende signaal kan vervolgens via standaardmicroscopie in beeld worden gebracht en geanalyseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Spoel monsters

1. Spoel de monsters met 500 μL 1x PBS + 0,75% glycine gedurende 5 min 3 keer met voorzichtig roeren op een orbitale shaker om resterende PFA of cryoprotectant te verwijderen.

2. Blokkeer en permeabiliseer monsters

1. Bereid een blokkerende en permeabilisatieoplossing (10% normaal ezelserum, 0,25% Tween 20) voor in 1x PBS. Bereid je voldoende voor om te gebruiken voor blokkerende, primaire en secundaire incubaties.
2. Voeg aan monsters (bijv. coverslips of vrij zwevende plakjes) in 24 putplaten 500 μL blokkerings- en permeabilisatieoplossing toe. Zorg ervoor dat elke put een ander monster bevat en op de juiste manier is geëtiketteerd om te voorkomen dat monsters worden gewisseld.
3. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur (RT) gedurende 60 minuten voor gekweekte cellen of 2 uur voor gesneden weefsel. Gebruik een orbitale shaker voor zachte agitatie.

3. Incubate monsters in primaire antilichamen

1. Bereid primaire antilichamen voor in blokkerende buffer:
   1. Bereid postsynaptische dichtheid 95 voor (PSD95; 1:500, konijn polyklonaal), Synapsin1 (1:500, muis monoklonaal), MAP2 (1:400, kip polyklonaal)
   2. Bereid een negatieve controle aliquot voor die een van de synaptische paren weglaat (bijvoorbeeld zonder PSD95)
2. Verwijder de blokkerende oplossing voorzichtig met een plastic Pasteur-pipet. Probeer zoveel mogelijk te verwijderen zonder de cellen te storen of weefsel te scheuren.
3. Voor gekweekte cellen:
   1. Bekleed een grote plastic petrischaal met parafilm. Breng de deklapjes voorzichtig over op de parafilm met behulp van een tang.
   2. Voeg voorzichtig 60 μL van de primaire antilichaamoplossing toe aan de bovenkant van de coverslips. Zorg ervoor dat u de primaire antilichaamoplossing niet over de zijkant van de deklip morst.
   3. Om vocht te bieden en te voorkomen dat monsters tijdens de incubatietijd uitdrogen, voegt u ultrapuur water toe aan een kleinere petrischaal en schikt u de kleine petrischaal voorzichtig rond de dekens.
   4. Bedek de grote petrischaal en incubeer gekweekte cellen gedurende 1 uur bij RT.
4. Voor gesneden weefsel:
   1. Voeg voorzichtig 250 μL van de primaire antilichaamoplossing toe aan vrij zwevende plakjes in een plaat met 24 putjes.
   2. Bedek de plaat en incubeer het weefsel een nacht bij 4 °C met zachte agitatie op een orbitale shaker.

4. Was monsters en incubeer vervolgens in secundaire antilichamen

1. Bereid secundaire antilichamen voor in de blokkerende buffer:
   1. Bereid Ezel anti-muis (1:5), ezel anti-konijn (1:5), ezel anti-kip (1:400).
   2. Bij deze stap kunnen aanvullende technische controles worden verkregen door een secundair aliquot voor te bereiden dat de anti-muis of anti-konijn secundair weglaat.
2. Voor gekweekte cellen:
   1. Tik met een tang voorzichtig de primaire oplossing van de dekenslips op een papieren handdoek
   2. Breng met een tang de coverslips voorzichtig terug naar hun oorspronkelijke 24 putplaat gevuld met 500 μL 1x PBS.
3. Voor gesneden weefsel:
   1. Verwijder voorzichtig de primaire antilichaamoplossing met een plastic Pasteur-pipet. Probeer zoveel mogelijk te verwijderen zonder weefsel te scheuren.
   2. Voeg 500 μL 1x PBS toe
4. Was de monsters gedurende 10 min 3 keer in 1x PBS met zachte agitatie op een orbitale shaker. Breng gedurende deze tijd alle wasbuffers naar RT.
   1. Verander gedurende deze tijd de parafilm in de grote petrischaal
5. Voor gekweekte cellen:
   1. Breng met een tang de deklapjes voorzichtig terug naar de geparafilmde grote petrischaal
   2. Voeg voorzichtig 40 μL van de secundaire antilichaamoplossing toe aan de bovenkant van de coverslips. Zorg ervoor dat u de secundaire antilichaamoplossing niet over de zijkant van de deklip morst.
   3. Voeg indien nodig meer ultrapuur water toe aan een kleinere petrischaal en schik de kleine petrischaal voorzichtig rond dekmantels.
   4. Dek de grote petrischaal af
6. Voor gesneden weefsel:
   1. Voeg voorzichtig 250 μL van de secundaire antilichaamoplossing toe aan vrij zwevende plakjes in een plaat met 24 putjes.
   2. Dek de plaat af
      OPMERKING: Bescherm vanaf hier monsters tegen licht door de bovenkanten van de platen met folie te wikkelen.
7. Incubeer de monsters bij 37 °C gedurende 1 uur

5. Ligatie

1. Meng de ligatievoorraad 1:5 in water van moleculaire kwaliteit.
2. Breng, net als in rubriek 4, voorzichtig de coverslips over en verwijder het secundaire mengsel uit het gesneden weefsel.
3. Was de monsters in 500 μL wasbuffer A
   1. Voor gekweekte cellen, was 2 keer gedurende 5 minuten. Voor gesneden weefsel, was 2 keer gedurende 10 minuten. Gebruik zachte agitatie op een orbitale shaker voor beide.
   2. Verander gedurende deze tijd de parafilm in de grote petrischaal
4. Terwijl u de ligase op een koud blok houdt, verdunt u de ligase 1:40 in de ligatievoorraad vanaf stap 5.1. Voer deze verdunning onmiddellijk uit voordat u de ligase aan de monsters toevoegt.
5. Verwijder net als in rubriek 4 zoveel mogelijk van de wasbuffer A uit monsters voordat u de ligase toevoegt.
6. Voor gekweekte cellen: Breng coverslips terug naar de geparafilmde petrischaal. Voeg 40 μL van het ligatiemengsel toe aan coverslips, schik kleine met water gevulde petrischalen rond de coverslips en dek de grote petrischaal af.
7. Voor gesneden weefsel: Voeg 250 μL van het ligatiemengsel uit stap 5.4 toe aan elke put en bedek de plaat.
8. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij 37 °C.

6. Versterking

1. Meng de versterkingsvoorraad 1:5 in water van moleculaire kwaliteit.
2. Breng, net als in rubriek 4, de coverslips voorzichtig over en verwijder het ligatiemengsel uit het gesneden weefsel.
3. Wasmonsters in 500 μL wasbuffer A
   1. Voor gekweekte cellen, was 2 keer gedurende 2 min. Voor gesneden weefsel, was 2 keer gedurende 10 minuten. Gebruik zachte agitatie op een orbitale shaker voor beide.
   2. Verander gedurende deze tijd de parafilm in de grote petrischaal
4. Voer deze verdunning uit onmiddellijk voordat u het polymerase aan monsters toevoegt. Terwijl u het polymerase op een koud blok houdt, verdunt u polymerase
   1. Voor gekweekte cellen, verdun polymerase 1:80 in de amplificatievoorraad uit stap 6.1.
   2. Voor gesneden weefsel, verdun polymerase 1:40 in de versterkingsvoorraad uit stap 6.1.
5. Verwijder net als in stap 4 zoveel mogelijk van de wasbuffer A uit monsters voordat u het polymerase toevoegt.
6. Voor gekweekte cellen: Breng de coverslips terug naar de geparafilmde petrischaal. Voeg 40 μL van het versterkingsmengsel uit stap 6.4.1 toe aan coverslips, schik kleine met water gevulde petrischaaltjes rond de coverslips en dek de grote petrischaal af. Incubeer de monsters gedurende 100 minuten bij 37 °C.
7. Voor gesneden weefsel: Voeg 250 μL van het versterkingsmengsel uit stap 6.4.2 toe aan elke put en dek de plaat af. Incubeer de monsters gedurende 2 uur bij 37 °C.
   OPMERKING: Bereid en label dia's gedurende deze tijd.

7. Montage

1. Net als in stap 4, breng de coverslips voorzichtig over en verwijder het versterkingsmengsel uit het gesneden weefsel.
2. Was de monsters gedurende 10 minuten 2 keer in 500 μL wasbuffer B met voorzichtig roeren op een orbitale shaker.
3. Was de monsters gedurende 1 minuut in 500 μL van 1% wasbuffer B met voorzichtig roeren op een orbitale shaker.
4. Voor gekweekte cellen:
   1. Laat 3 μL montagemedia op een dia vallen
   2. Tik overtollige wasbuffer van de afdekplaat af en plaats vervolgens de afdekplaat (met cellen naar beneden gericht) in de montagemedia. Sluit de zijkanten af met een kleine hoeveelheid doorzichtige nagellak om de dekenslip op zijn plaats te verzegelen.
5. Voor gesneden weefsel:
   1. Breng voorzichtig een plakje weefsel over op de voorbereide dia en schik het, zodat het plakje plat ligt. Laat tussen 5-10 μL montagemedia (hoeveelheid is afhankelijk van de grootte van de plak) op de plak van het weefsel vallen
   2. Plaats voorzichtig een glazen afdekplaat over de plak tissues en sluit af met een kleine hoeveelheid heldere nagellak langs de rand om de dekzeil op zijn plaats te sluiten.
6. Wacht ten minste 15 minuten voordat u onder de microscoop analyseert of bewaar bij -20 °C.

8. Verkrijg digitale beelden met een confocale microscoop

1. Optimaliseer de acquisitie-instellingen (bijv. laservermogen, versterking, offset) voor monsters van alle behandelingen. Zorg ervoor dat de optimalisatie het verminderen van achtergrondruis en het verbeteren van het signaal omvat zonder de intensiteit van de fluorescerende signalen te oververzadigen. Zodra de instellingen zijn bepaald, past u dezelfde acquisitie-instellingen toe op alle verkregen afbeeldingen.
   OPMERKING: De volgende acquisitiegegevens kunnen worden gebruikt met een Nikon A1 confocale microscoop en de Nikon NIS AR Elements-software.
2. Plaats de dia met monster op het podium en zoek het brandpuntsvlak voor het monster met behulp van DAPI door het oculair.
3. Schakel de oogpoort uit door op Oogpoort te klikken en kies een optische configuratieknop om de instellingen aan te passen.
4. Pas de versterking, offset en laservermogen voor elk fluorescerend kanaal aan om achtergrondruis te verminderen en het fluorescerende signaal te verbeteren. Zorg ervoor dat het fluorescerende signaal niet oververzadigd raakt, zoals vermeld in stappen 8.5-8.6.
5. Controleer oververzadiging met behulp van een pseudokleur voor het fluorescerende signaal. Klik onder aan de live-afbeelding met de rechtermuisknop op het tabblad met het fluorescerende kanaal dat momenteel wordt gebruikt.
6. Kies vervolgens Kanaalkleuring en kies een pseudokleur zoals Rainbow Dark om de fluorescentie-intensiteit te visualiseren in een heat-map-achtige pseudokleur. In Rainbow Dark geven koelere kleuren minder fluorescerende intensiteit aan en hetere kleuren duiden op meer fluorescerende intensiteit.
7. Zodra alle fluorescerende kanalen zijn geoptimaliseerd, klikt u met de rechtermuisknop op de eerder gekozen optische configuratieknop en kiest u Huidige camera-instelling toewijzen voor deze knop.
8. Controleer of de gekozen instellingen voldoende zijn voor een aselecte steekproef uit elke behandelingsgroep. Als de gekozen instellingen een van deze voorbeelden oververzadigen, herhaalt u stap 8.4 om de oververzadiging te elimineren.
9. Voor gekweekte neuronen volgt u stappen 8.10-8.16.
10. Zoek met behulp van de oogpoort naar een neuron met dendrieten die minimale overlap hebben met andere dendrieten.
11. Schakel de oogpoort uit en gebruik het DAPI-kanaal om het cellichaam van het gekozen neuron te visualiseren. Dubbelklik op het midden van de soma om het neuron in het midden van het gezichtsveld te centreren.
12. Zoek met behulp van het MAP2-kanaal het beste scherpstelvlak voor het MAP2-signaal met live scannen.
13. Klik op het tabblad ND-acquisitie op Opslaan in bestand en kies een bestand om de afbeelding in op te slaan onder Bladeren. Voer vervolgens de bestandsnaam in.
14. Selecteer op het tabblad Z de optie Symmetrische modus gedefinieerd door bereik . Stel de focus in op het beste MAP2-vlak en klik op de knop Relatief om dit brandpuntsvlak in te stellen als het midden van de z-stack.
15. Stel het bereik in op 5 μm met stappen van 1 μm en zorg ervoor dat u Actieve sluiter sluiten tijdens Z-beweging aanvinkt. Selecteer op het tabblad Golflengte de naam van de optische knop met de eerder geconfigureerde acquisitie-instellingen onder Optical Conf. Klik vervolgens op Nu uitvoeren.
16. Herhaal stap 8.1.10-8.1.15 voor ongeveer 10 neuronen per coverslip/behandeling.
17. Voor gesneden weefsel volgt u de stappen 8.18-8.22.
18. Zoek met behulp van de eye-port naar de regio van belang. Lokaliseer bijvoorbeeld CA1 van de hippocampus.
19. Schakel de oogpoort uit en gebruik het MAP2-kanaal om het beste scherpstelvlak voor het MAP2-signaal te vinden met live scannen.
20. Kies in het menu Acquire de optie Grote afbeelding scannen. Selecteer vervolgens de naam van de optische knop met de eerder geconfigureerde acquisitie-instellingen onder het deelvenster Vastleggen in het deelvenster dat wordt geopend. Zorg er ook voor dat u de juiste doelstelling in dit deelvenster selecteert.
21. Gebruik onder het deelvenster Gebied en het oculair de pijltoetsen om de grenzen van het betreffende gebied in te stellen. Klik vervolgens op Grote afbeelding opslaan in bestand en maak een bestandsnaam voor het opslagpad voor de afbeelding.
22. Controleer in het deelvenster Instellen of Multichannel Capture is ingeschakeld en kies vervolgens de naam van de optische knop met de eerder geconfigureerde acquisitie-instellingen onder Optical Conf.
    OPMERKING: Een z-stack voor een grote afbeelding is mogelijk, maar zal de scantijd verlengen.

9. Analyse

1. Gebruik, net als bij acquisitie-instellingen, monsters van alle behandelingen om drempelinstellingen te optimaliseren. Zorg ervoor dat de drempeloptimalisatie zich richt op het verminderen van achtergrondruis en het verbeteren van het signaal zonder de intensiteit van de fluorescerende signalen te oververzadigen. Zodra deze instellingen zijn bepaald, past u dezelfde drempelinstellingen toe op alle afbeeldingen die voor analyse worden gebruikt, zoals beschreven in stap 9.2-9.3.
2. In ImageJ bevindt de drempeloptie zich onder het menu Afbeelding > > drempel aanpassen. Kies de optie Donkere achtergrond als de afbeelding een donkere achtergrond heeft.
3. Pas vervolgens de boven- en ondergrenzen van de drempel aan per vooraf bepaalde geoptimaliseerde drempelinstellingen en klik vervolgens op Toepassen.
4. Gebruik voor gekweekte cellen het MAP2-kanaal en een freehand region of interest (ROI) -tool om een ROI te trekken voor elk neuron, inclusief dendrieten en soma. Teken voor gesneden weefsel een ROI uit de vrije hand in de segmentafbeelding die het interessegebied inkapselt (bijvoorbeeld stratum radiatum van de CA1 in de hippocampus).
5. Verkrijg het gebied van de ROI. Meet in AfbeeldingJ het gebied onder het menu Analyseren > meten.
6. Detecteer het aantal puncta binnen elke ROI met behulp van een automatische detectietool zoals Deeltjesanalyse in ImageJ volgens stap 9.7-9.9.
7. Zoek de optie Deeltjesanalyse onder het menu Analyseren > Deeltjes analyseren. Definieer eerst de puncta-groottediameter, meestal 0,1-3 μm2.
8. Kies vervolgens de optie Overlaymaskers in het vervolgkeuzemenu Weergeven en vink de optie Resultaten weergeven aan. Klik vervolgens op OK.
9. Als puncta niet worden gedetecteerd met het gekozen diameterbereik, past u het bereik aan totdat alle puncta met deze analyse zijn gedetecteerd. Zorg ervoor dat u dezelfde deeltjesanalyse-instellingen gebruikt voor alle afbeeldingen.
10. Deel het aantal puncta door het gebied van een afzonderlijke interesseregio door de stappen 9.11-9.13 te volgen.
11. Kopieer en plak de resultaten voor elke afbeelding uit het pop-upvenster Resultaten van ImageJ in een spreadsheet.
12. Bepaal eerst uit welk bestand en monster de gegevens zijn verkregen. Deel vervolgens het gebied van de ROI door het aantal puncta.
13. Wis vervolgens de gegevens uit het pop-upvenster Resultaten en herhaal stap 9.2-9.12.
14. Resultaten normaliseren om monsters te controleren: Gemiddelde van de resultaten (aantal puncta/ROI-gebied) voor de controlemonsters. Deel vervolgens de verkregen resultaten van alle monsters door het gemiddelde van de controle om de genormaliseerde resultaten te verkrijgen. Het nieuwe gemiddelde van de controlemonsters moet gelijk zijn aan 1.

Resultaten

Gegevens die zijn gewijzigd van Heaney et ^al.6 worden gepresenteerd om een experiment aan te tonen waarbij verhoogde synapsvorming wordt verwacht (zie⁶ voor meer informatie en een meer diepgaande bespreking van het mechanisme). Eerder werd aangetoond dat snelle antidepressiva activering van de remmende metabotrope receptor, GABAB (gamma-aminoboterzuur subtype B), vereisen om effectief te zijn¹³. Verder gaven eerdere gegevens aan dat snelle antidepres...

Discussie

DetectSyn is een snelle test die een nabijheidsligatietest gebruikt om eiwitten binnen 40 nm van elkaar te detecteren, wat de detectie van synapsvorming mogelijk maakt. Deze techniek verbetert de huidige fluorescerende assays, die alleen dienen als proxy-metingen voor synapsvorming. DetectSyn detecteert kwantificeerbare veranderingen in synaptische eiwitten gelokaliseerd binnen 40 nm, d.w.z. binnen de synaptische spleet, van elkaar. Verder is DetectSyn kosteneffectiever en kost het minder tijd dan technieken, zoals elekt...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10x PBS	Fisher Scientific	BP39920	PBS gemaakt in huis werkt ook.
24 well platen	Fisher Scientific	FB012929	Voor weefselsneden zijn voorgesteriliseerde platen misschien niet nodig.
50 mL conische buizen	Fisher Scientific	14-432-22
Aluminiumfolie	Fisher Scientific	15-078-290
Chicken anti-MAP2 antilichaam	Abcam	ab5392
Klare nagellak	Fisher Scientific	NC1849418	Andere klare nagellak werkt ook.
Koude blok	Fisher Scientific	13131012
Computer werkstation	HP
Confocale of fluorescentiemicroscoop	Nikon	A1R HD25
Donkey anti-chicken FITC	Fisher Scientific	SA1-72000
Duolink donkey anti-Muis PLUS	Sigma	DUO92001
Duolink donkey anti-Konijn MINUS	Sigma	DUO92005
Duolink In Situ Detectie Reagentia Verre Rood	Sigma	DUO92013	Bevat ligatie stock, amplificatie stock, ligase, en polymerase.
Duolink In Situ Montage Medium met DAPI	Sigma	DUO82040
Duolink In Situ Was Buffers, Fluorescentie	Sigma	DUO82049	Bevat Was Buffer A en Was Buffer B; verdun Was Buffer B tot 1% in diH20 voor 1% Was Buffer B.
Fijnpunt verfkwast	Fisher Scientific	NC9691026	Sabel haar, maat 00 of 000, kan ook worden gevonden in kunstwinkels
Fisherbrand Dekglazen: Rechthoeken	Fisher Scientific	12545MP	Dekglazen zijn niet nodig voor gekweekte neuronen die al op glazen dekglazen zitten.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscoopglazen	Fisher Scientific	1255015	Voor gekweekte neuronen die al op glazen dekglazen zitten, kunnen Superfrost glazen overbodig zijn.
Vriezer, -20°C	VWR	76449-108
Glazen dekglazen	Fisher Scientific	125480
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Beeldverwerkingssoftware	bijv. NIS Elements, ImageJ
Incubator	Fisher Scientific	15-015-2633
Grote petrischaal, 100mm	Fisher Scientific	FB0875712
Water van moleculaire kwaliteit	Fisher Scientific	BP24701
Muis anti-Synapsin1 antilichaam	Synaptic Systems	106-011
Normaal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Orbitale shaker	Fisher Scientific	02-106-1013
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-10
Pipettips	Fisher Scientific	02-707-025
Pipetten	Fisher Scientific	14-388-100	Werkvolumes variëren van 3 µL tot 500 µL
Plastiek Pasteur pipet	Fisher Scientific	02-708-006
Precisie pincetten/tang	Fisher Scientific	12-000-122
Konijn anti-PSD95 antilichaam	Abcam	ab18258	Andere antilichaamparen kunnen ook werken, met optimalisatie.
Koelkast	VWR	76470-402
Kleine petrischaal, 60 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100