Methodenartikel

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

DOI:

10.3791/63144

⸱

19 oktober 2021

 ,  , 
1Infection and Innate Immunity Laboratory, Department of Biological Sciences, Institute for Biomedical Sciences, The George Washington University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster volwassen vliegen zijn uitgebreid gebruikt als modelorganismen om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan antimicrobiële aangeboren immuunresponsen van de gastheer en microbiële infectiestrategieën. Om het D. melanogaster larvestadium als aanvullend of alternatief modelsysteem te promoten, wordt een larvale injectietechniek beschreven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gebruik van onconventionele modellen om aangeboren immuniteit en pathogene virulentie te bestuderen, biedt een waardevol alternatief voor zoogdiermodellen, die kostbaar kunnen zijn en ethische problemen kunnen oproepen. Onconventionele modellen zijn notoir goedkoop, gemakkelijk te hanteren en cultuur, en nemen niet veel ruimte in beslag. Ze zijn genetisch vatbaar en bezitten volledige genoomsequenties, en het gebruik ervan brengt geen ethische overwegingen met zich mee. De fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft bijvoorbeeld geweldige inzichten gegeven in een verscheidenheid aan gedrag, ontwikkeling, metabolisme en immuniteitsonderzoek. Meer specifiek bezitten D. melanogaster volwassen vliegen en larven verschillende aangeboren afweerreacties die worden gedeeld met gewervelde dieren. De mechanismen die immuunresponsen reguleren, zijn meestal onthuld door genetische en moleculaire studies in het D. melanogaster-model . Hier wordt een nieuwe larvale injectietechniek aangeboden, die het onderzoek naar aangeboren immuunprocessen in D. melanogaster-larven verder zal bevorderen en de pathogenese van een breed scala aan microbiële infecties zal onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster wordt al tientallen jaren enorm gebruikt in biologisch en biomedisch onderzoek, omdat de geavanceerde reeks genetische en moleculaire hulpmiddelen gestaag is geëvolueerd voor analyse van een breed scala aan studies1,2,3,4. De evolutionair geconserveerde aspecten van ontwikkeling, homeostase en aangeboren immuniteit in D. melanogaster hebben het tot een waardevol modelorganisme gemaakt voor het bestuderen van verschillende menselijke en insectenziekten5,6. Met name de fundamentele rol van het D. melanogaster-model voor het bestuderen van immuniteit is grotendeels geïllustreerd in studies naar volwassen vliegen. D. melanogaster larvenstudies hebben echter ook bijgedragen aan de huidige kennis en hebben voornamelijk cellulaire immuunresponsen onderzocht, specifiek voor wespen- en nematodeninfecties die optreden via de insectensnoekel7,8,9,10. Drosophila melanogaster-larven bezitten drie verschillende soorten bloedcellen, gezamenlijk hemocyten genoemd: plasmatocyten, kristalcellen en lamellocyten11,12,13. Deze cellen kunnen een reeks immuunresponsen opzetten wanneer D. melanogaster-larven zijn geïnfecteerd met pathogenen zoals bacteriën, schimmels, virussen en parasieten14,15,16. Cellulaire immuunresponsen omvatten directe overspoeling (fagocytose) van kleine moleculen of bacteriën, melanisatie, inkapseling van grotere pathogenen zoals parasitoïde eieren en productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en stikstofmonoxidesynthasen (NOS)17,18,19.

Daarentegen zijn er minder studies gepubliceerd over het gebruik van het D. melanogaster larvale model om humorale immuunresponsen te analyseren. Dit is voornamelijk te wijten aan de toepassing van voedingstests voor orale infectie van D. melanogaster-larven en verschillende uitdagingen in verband met micro-injectielarven, waaronder de precieze behandeling van larven en het juiste gebruik van de micronaald, vooral tijdens penetratie20,21. De beperkte kennis van larvale infectie en technische problemen (d.w.z. hoge mortaliteit) hebben het D. melanogaster larvale model vaak moeilijk te gebruiken gemaakt. Een larvaal model zal het potentieel hebben om nieuwe moleculaire mechanismen te identificeren die meer inzicht zullen geven in gastheer-pathogeen interacties en de inductie van specifieke gastheer aangeboren immuunresponsen tegen pathogene infecties.

Hier wordt een eenvoudig en efficiënt protocol beschreven dat kan worden gebruikt om D. melanogaster-larven te injecteren met verschillende pathogenen, zoals bacteriën. In het bijzonder worden D. melanogaster-larven gebruikt voor injecties met de menselijke ziekteverwekker Photorhabdus asymbiotica en de niet-pathogene bacterie Escherichia coli. Deze methode kan worden gebruikt voor de manipulatie en analyse van de immuunresponsen van D. melanogaster op verschillende microbiële infecties.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vliegenopfok

OPMERKING: De levenscyclus van D. melanogaster is verdeeld in vier stadia: embryo, larve, pop en volwassene. De generatietijd met optimale opfokomstandigheden in het laboratorium (~25 °C, 60% luchtvochtigheid en voldoende voedsel) is ongeveer 10 dagen van bevruchte eicel tot ingesloten volwassene. Vrouwtjes leggen ~ 100 embryo's per dag en embryogenese duurt ongeveer 24 uur22. De larven ondergaan drie ontwikkelingsstadia (instars; L1-L3) in ~4 dagen (L1 en L2: 24 uur en L3: 48 uur). De eerste instar-larven beginnen zich onmiddellijk op het oppervlak van het medium te voeden. Tweede instarlarven graven zich in het medium in, terwijl derde instarlarven het medium verlaten en de wanden van de flacon opdwalen, op zoek naar een plek om te poppen gedurende 24-48 h. De D. melanogaster-lijn die voor dit protocol wordt gebruikt, is Oregon R (FBsn0000276).

  1. Voeg droogvoer met een dieet op basis van maïsmeel en soja toe aan een smalle injectieflacon met polystyreen (25 mm x 95 mm) tot een volume van 1/5 tot 2/5. Voeg vervolgens 9 ml water toe en laat de injectieflacon 1 minuut zitten totdat het dieet volledig gehydrateerd is.
  2. Voeg ongeveer 10 korrels droge bakkersgist toe aan de flacon en plaats een mengsel van ten minste 20 nieuw ontstane mannelijke en vrouwelijke volwassen vliegen.
  3. Incubeer de injectieflacon bij 25 °C op een lichtcyclus van 12:12 uur: donkere fotoperiodische cyclus.
  4. Om de voortgang van de levenscyclus te garanderen, controleert u de vliegenflacons dagelijks en registreert u de initiële ontwikkelingsstadia.

2. Selectie van larven voor infectie

  1. Selecteer larven met een fijne kwast (kamelenhaar is het beste) zodra ze het zwervende derde instar-stadium bereiken op de dag dat de infectie zal worden uitgevoerd (figuur 1).
  2. Was de geselecteerde larven met Ringer's oplossing (100 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM HEPES pH 6,9) in een kleine petrischaal (60 mm x 15 mm) na verwijdering uit de oorspronkelijke injectieflacon23.
  3. Plaats de larven op filterpapier (150 mm diameter) dat licht bevochtigd is met ongeveer 5 ml Ringer's oplossing in een petrischaaltje (100 mm x 15 mm) (figuur 2A).
  4. Voeg dagelijks ~ 1 ml Ringer's oplossing toe aan het filterpapier als dat nodig is om uitdroging en larvale uitdroging te voorkomen.

3. Bacteriële bereiding

  1. Kweek P. asymbiotica bacteriën op Luria Bertani (LB) agar media bij 28 °C gedurende 48 uur.
  2. Gebruik een bioveiligheidsniveau 2-kast om een enkele kolonie P. asymbiotica over te brengen om een vloeibare cultuur in 10 ml LB-media te enten.
  3. Incubeer de P. asymbiotica vloeibare cultuur 's nachts bij 28 °C in een roterende shaker ingesteld op 220 rpm.
  4. Kweek E. coli-bacteriën op een vergelijkbare manier, maar voer de initiële groei uit op agarmedia en vloeibare kweekincubatie bij 37 °C 's nachts.
  5. Centrifugeer elke nachtelijke bacteriecultuur gedurende 3 minuten bij 13.000 x g en 4 °C.
  6. Gooi het supernatant weg en was de resulterende bacteriële pellets drie keer met 10 ml steriel PBS.
  7. Centrifugeer de pellets opnieuw gedurende 3 minuten bij 13.000 x g en 4 °C.
  8. Verdun elke pellet met steriele PBS om de bacteriële concentraties aan te passen aan de optische dichtheid (600 nm) van 0,25 voor P. asymbiotica en 0,015 voor E. coli, die overeenkomen met 100-300 kolonievormende eenheden per larve van elk bacterieel preparaat, met behulp van een spectrofotometer.

4. Voorbereiding van de injector

  1. Bereid haarvaten voor met behulp van 3,5 "glazen capillaire buizen en een micropipette puller. Stel het instrument als volgt in: warmte: 580; trekken: 143; snelheid: 25; vertraging: 1; druk: 500.
  2. Gebruik recht gekartelde middenpunttang om het glazen capillair te openen in de mate die de toediening van de experimentele behandelingen mogelijk maakt en tegelijkertijd minimale schade aan de larven veroorzaakt (figuur 2B). Om deze procedure te optimaliseren tijdens het oefenen van injecties, gebruikt u Trypan Blue-oplossing (verdun de bouillon 0,4% met PBS tot 0,2%) om lekkage tijdens het injecteren en de overleving van de blauwe larven gemakkelijk te volgen.
  3. Vul het capillair met minerale olie met een plastic wegwerpspuit van 20 ml met een injectienaald (22 G, 25 mm lengte).
  4. Stel de nanoliterinjector in en werp de olie uit het capillair (figuur 2C).
  5. Vul het capillair met het gewenste bacteriële preparaat voor injectie. Neem de oplossing uit een druppel (~ 20 μL) die op parafilm wordt geplaatst. In dit protocol werd 50,2 nL van twee bacteriële voorraden geïnjecteerd.

5. Larven injectie

  1. Verdoving D. melanogaster-larven met behulp van koolstofdioxide gedurende ~ 2 minuten voorafgaand aan de procedure.
  2. Breng de verdoofde larven voorzichtig over op een filterpapier dat is bevochtigd in de oplossing van Ringer ter voorbereiding op injectie onder een stereomicroscoop. De larven zullen op dit punt lusteloos of passief zijn.
  3. Om larven te injecteren, oefent u stevige druk uit op de dorsale kant van het achterste uiteinde (de tracheale spiracles zijn zichtbaar aan het achterste uiteinde versus zwarte monddelen aan het voorste uiteinde) met behulp van een tang (figuur 2D).
  4. Steek de naald horizontaal naar het achterste uiteinde van de larven, in de buurt van de cuticula. Een succesvolle injectie zal niet resulteren in een lekkage van de geïnjecteerde oplossing uit de larven (figuur 3).
  5. Verwijder de tang die werd gebruikt om druk uit te oefenen op de staart van de larve voordat u de naald terugtrekt. Als de tang niet eerst wordt verwijderd, kan hijolymfe en / of de darm uit de larven van de wondplaats dwingen.
  6. Infecteer het juiste aantal larven voor het onderzoek dat wordt uitgevoerd. In dit specifieke protocol werden 20 larven voor elke experimentele aandoening geïnjecteerd.
  7. Breng de geïnjecteerde larven met een tang voorzichtig over naar een apart vochtig filterpapier in een petrischaal (10 larven per schaal) of een voedselflacon (afhankelijk van het doel van het experiment) om herstel mogelijk te maken.
  8. Plaats de petrischaaltjes of voedselflacons in een couveuse bij 25 °C. Als larven in een petrischaaltje worden bewaard, voeg dan de oplossing van Ringer toe als dat nodig is om uitdroging te voorkomen.

6. Registratie van overleving/mortaliteit

  1. Noteer het aantal dode en levende D. melanogasterlarven volgens de ingestelde experimentele tijdspunten. Levende larven zullen zich blijven ontwikkelen tot poppen en volwassenen.
  2. Gebruik statistische programma's, zoals Prism, om de ruwe overlevings- / mortaliteitsgegevens in te voeren, ze te analyseren met de log-rank (Mantel-Cox) -test en de resultaten in cijfers weer te geven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wanneer correct uitgevoerd, vertonen injecties van D. melanogaster-larven een bacteriespecifiek effect. De overlevingsgegevens werden verzameld op verschillende tijdstippen na infecties van P. asymbiotica (stam ATCC43943), E. coli (stam K12) en PBS (figuur 4). Terwijl D. melanogasterlarven gevoelig zijn voor P. asymbiotica, wat de overleving snel in gevaar brengt, vertonen larven geïnjecteerd met E. coli of PBS-controles verlengde overlev...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster is een van de meest waardevolle, experimenteel gemanipuleerde modellen die worden gebruikt voor onderzoek naar aangeboren immuniteit en pathogenese van verschillende microbiële infecties. Dit komt door de eenvoudige en snelle levenscyclus, eenvoudig onderhoud in een laboratorium, gevestigde evolutionaire genetica en diverse genetische toolbox. Eerdere methoden van D. melanogaster-larveninjecties, zoals het gebruik van een hybride microfluïdisch apparaat of een Narishige micromani...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken leden van de afdeling Biologische Wetenschappen van de George Washington University (GWU) voor het kritisch lezen van het manuscript. GT werd ondersteund door een Harlan summer fellowship van GWU. Alle grafische figuren zijn gemaakt met Behulp van BioRender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Fly Food B (Bloomington Recipe)LabExpress7001-NVFood B, in small vials, 100 vials/tray
100 x 15, Mono Petri Dishes Fully StackableVWR25384-342Diameter 100 x 15 mm
60 x 15, Mono Petri dishes Fully StackableVWR25384-092Diameter 60 x 15 mm
Glass capillariesVWR53440-186
Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circleVWR28450-150Diameter 150 mm
Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety CabinetESCOLA2-4A2-E
LB AgarFisher ScientificBP1425-500LB agar miller powder 500 g
LB BrothFisher ScientificBP1426-500LB broth miller powder 500 g
Mineral oilAlfa Aesar, Thermo Fisher Scientific31911-A1
NanoDrop 2000/2000c SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-2000C
Nanoject III Programmable Nanoliter InjectorDrummond3-000-207
Narrow Drosophila Vials, PolystyreneGenesee Scientific32-109
Needles, hypodermicVWR89219-31622 G, 25 mm
Next Generation Micropipette PullerWorld Precision InstrumentsSU-P1000
PBSVWR97062-732Buffer PBS tablets biotech grade 200tab
PrismGraphPadVersion 8
Syringes - plastic, disposableVWR76124-65220 mL
Trypan BlueSigma-AldrichT8154
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takehana, A., et al. Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).
  2. Senger, K., Harris, K., Levine, M. GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).
  3. Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae. Disease Models & Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).
  4. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D., Eleftherianos, I. Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway. Frontiers in Immunology. 10, 2372(2019).
  5. Cherry, S., Silverman, N. Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend. Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).
  6. Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214(2020).
  7. Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes. International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).
  8. Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. Insect immune responses to nematode parasites. Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).
  9. Leitão, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids. PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084(2019).
  10. Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. A. Parasitoid wasp of Drosophila employs preemptive and reactive strategies to deplete its host's blood cells. PLoS Pathogens. 17 (5), 1009615(2021).
  11. Vlisidou, I., Wood, W. Drosophila blood cells and their role in immune responses. The FEBS Journal. 282 (8), 1368-1382 (2015).
  12. Harnish, J. M., Link, N., Yamamoto, S. Drosophila as a model for infectious diseases. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724(2017).
  13. Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).
  14. Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila. Insects. 11 (4), 210(2020).
  15. Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi. Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).
  16. Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens. Virology. 540, 165-171 (2020).
  17. Gold, K. S., Brückner, K. Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster. Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).
  18. Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. M., Lemaitre, B. Drosophila innate immunity: regional and functional specialization of prophenoloxidases. BMC Biology. 13, 81(2015).
  19. Honti, V., Csordás, G., Kurucz, É, Márkus, R., Andó, I. The cell-mediated immunity of Drosophilamelanogaster: hemocyte lineages, immune compartments, microanatomy and regulation. Developmental and Comparative Immunology. 42 (1), 47-56 (2014).
  20. Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral bacterial infection and shedding in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57676(2021).
  21. Zabihihesari, A., Hilliker, A. J., Rezai, P. Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate. Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).
  22. Flatt, T. Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster. Genetics. 214 (1), 3-48 (2020).
  23. Ciche, T. A., Sternberg, P. W. Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts. BMC Developmental Biology. 7, 101(2007).
  24. Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus. Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).
  25. Yang, G., Waterfield, N. R. The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex. PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644(2013).
  26. Shokal, U., et al. Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria. BMC Microbiology. 16, 16(2016).
  27. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Injectie in Drosophila larvenaangeboren immuniteitvirulentie van pathogenenmicroinjectietechniekfruitvliegmodelbacteri le infectiederde instars larvenRingersoplossinghemolymflekkagepetrischaal

Gerelateerde artikelen